王喃喃 許鑫 劉姣 崔成偉

(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，濟(jì)寧 272100)

頭孢曲松鈉(ceftriaxone sodium)，屬半合成的第三代頭孢菌素，具有抗菌活性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞外膜和組織的穿透力強(qiáng)、有效血藥濃度維持時(shí)間長(zhǎng)、體內(nèi)代謝穩(wěn)定、血漿蛋白結(jié)合率低、可用于肝或腎功能不全者等特點(diǎn)[1-3]，被收錄在世界衛(wèi)生組織(WHO)基本藥物標(biāo)準(zhǔn)清單及《國(guó)家基本藥物目錄(2018年版)》，是臨床所需的最有效的藥物。頭孢曲松鈉合成工藝為：7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)與三嗪環(huán)，在三氟化硼/乙腈的催化下，合成7-ACT后，由7-ACT和AE活性酯在單一的乙醇體系或者多元溶劑體系下進(jìn)行反應(yīng)生成一分子頭孢曲松鈉與2-巰基苯并噻唑(2-mercaptobenzothiazole，MBT)，副產(chǎn)物MBT直接以固體形式分離后再加入成鹽劑獲得頭孢曲松鈉晶體。而MBT作為頭孢曲松鈉合成過(guò)程中的副產(chǎn)物，2016年，WHO國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)致癌物清單將其列為2A類(lèi)致癌物，且有文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]，MBT可刺激皮膚和黏膜，能引起皮炎及難以治療的皮膚潰瘍，可致敏，但是目前尚未見(jiàn)頭孢曲松鈉中2-巰基苯并噻唑檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。因此，為了更好地控制頭孢曲松鈉的質(zhì)量，有必要提供一種測(cè)量方法，以檢測(cè)頭孢曲松鈉中是否含有2-巰基苯并噻唑，從而保證用藥的安全性。

1 儀器與材料

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；MSA6.6S-0CE型百萬(wàn)分之一天平(德國(guó)Sartorius公司)；AB265-S型十萬(wàn)分之一分析天平(美國(guó)Mettler Toledo公司)。

2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌?廣州牌牌生物科技有限公司，批號(hào)：PI2-MBT-20181030-01)；頭孢曲松鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)：20181905045、2081905046、2081905047)；乙腈(新藍(lán)景化學(xué)工業(yè)有限公司，批號(hào)：B2119011000)；甲酸(天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20131105)；純化水(屈臣氏集團(tuán)有限公司，批號(hào)：20181204)。所有試劑均為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agilent ZORBAX SB-Aq C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為1%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)，等度洗脫；流速為0.5 mL/min；柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液

精密稱取2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌愤m量，加水-乙腈(60:40,V/V)使溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含2-巰基苯并噻唑0.1 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液

取頭孢曲松鈉適量，精密稱定，加水-乙腈(60:40,V/V)溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含頭孢曲松鈉10 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性溶液

取頭孢曲松鈉適量，精密稱定，加2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌啡芤喝芙獠⒍肯♂屩瞥擅? mL中約含頭孢曲松鈉10 mg的溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下各溶液分別進(jìn)樣，系統(tǒng)適用性溶液典型色譜圖見(jiàn)圖1?？瞻兹軇┎桓蓴_樣品測(cè)定，系統(tǒng)適用性溶液中2-巰基苯并噻唑與相鄰峰之間分離度大于1.5，頭孢曲松鈉中其他特定雜質(zhì)(脫酰頭孢噻肟?jī)?nèi)酯、7-ACA、三嗪環(huán)、AE活性酯、7-ACT、E異構(gòu)體)均在10 min之前出峰或者在該色譜條件下不出峰，不干擾樣品測(cè)定。方法專(zhuān)屬性良好。

2.4 定量限與檢測(cè)限

將"2.2.1"項(xiàng)下2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌啡芤阂运?乙腈(60:40,V/V)為溶劑進(jìn)行稀釋?zhuān)琒/N≈10時(shí)的濃度作為定量限濃度，S/N≈3時(shí)的濃度作為檢測(cè)限濃度。定量限濃度相當(dāng)于樣品濃度的百分比(%)為0.00005%(0.5 ppm)，檢測(cè)限濃度相當(dāng)于樣品濃度的百分比(%)為0.000015%(0.15 ppm)。

2.5 線性與范圍

在定量限～200%限度濃度范圍內(nèi)選取6個(gè)濃度點(diǎn)(定量限溶液、0.02、0.04、0.1、0.14和0.2 μg/mL)進(jìn)行配液測(cè)定。精密量取系列線性溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸分析。2-巰基苯并噻唑在0.0051～0.2051 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性方程為y=6.4195x-0.0098，r=0.9996(＞0.999)。線性關(guān)系圖見(jiàn)圖2。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加上述溶劑溶解并定量稀釋制成約0.2 μg/mL的溶液作為雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取頭孢曲松鈉100 mg，精密稱定，分置于9個(gè)10 mL量瓶中，分成3組，分別加入雜質(zhì)對(duì)照品儲(chǔ)備液4、5和6 mL，加入溶劑稀釋定容至刻度，制成80%、100%、120% 3個(gè)濃度的準(zhǔn)確度試驗(yàn)溶液。分別精密量取上述溶液各20 μL，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。2-巰基苯并噻唑3個(gè)濃度9點(diǎn)回收率在86.3%～102.3%之間，平均回收率為102.8%，RSD=6.0%。

表1 2-巰基苯并噻唑方法學(xué)驗(yàn)證-準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Method validation of MBT-accuracy tests

2.7 重復(fù)性與中間精密度試驗(yàn)

兩位分析員在不同時(shí)間，用兩臺(tái)不同儀器試驗(yàn)，每位分析員分別配制6份加標(biāo)供試品溶液和2份2-巰基苯并噻唑?qū)φ掌啡芤?。配制方法?jiàn)“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液與系統(tǒng)適用性溶液(加標(biāo)供試品溶液)。取配制溶液各20 μL分別進(jìn)樣分析，計(jì)算6份樣品中2-巰基苯并噻唑含量，結(jié)果見(jiàn)表2。6份樣品中2-巰基苯并噻唑含量測(cè)定結(jié)果RSD≤2.0%，12份樣品中2-巰基苯并噻唑含量測(cè)定結(jié)果RSD≤2.0%。

表2 2-巰基苯并噻唑方法學(xué)驗(yàn)證-重復(fù)性與中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Method validation of MBT-precision tests

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液與系統(tǒng)適用性溶液，分別置于0 h、室溫與4℃條件下1、2、4、6、8和12 h后測(cè)定，考察對(duì)照品溶液與樣品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果為4℃條件12 h對(duì)照品溶液RSD為1.5%，系統(tǒng)適用性溶液RSD為1.9%；室溫條件12 h對(duì)照品溶液RSD為6.5%，系統(tǒng)適用性溶液RSD為10.2%。表明對(duì)照品溶液與樣品溶液在4℃條件12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 耐用性試驗(yàn)

分別對(duì)柱溫、流速、色譜柱、流動(dòng)相比例、甲酸比例等條件進(jìn)行波動(dòng)，結(jié)果見(jiàn)表3。改變柱溫、流速、色譜柱、流動(dòng)相比例、和甲酸比例，系統(tǒng)適用性溶液分離度均符合要求，表明實(shí)驗(yàn)條件的微小變化對(duì)2-巰基苯并噻唑含量測(cè)定無(wú)影響。

表3 2-巰基苯并噻唑方法學(xué)-耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Method validation of MBT-durability tests

2.10 樣品測(cè)定

取3批頭孢曲松鈉樣品，對(duì)其2-巰基苯并噻唑含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。3批樣品中2-巰基苯并噻唑含量均低于定量限。

表4 頭孢曲松鈉中2-巰基苯并噻唑含量測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination results of MBT in ceftriaxone sodium

3 討論

(1)《遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則》中MBT屬于已知致癌物質(zhì)，按照Ⅰ類(lèi)雜質(zhì)控制，Ⅰ類(lèi)雜質(zhì)控制限度按照PDE或者ADI進(jìn)行控制。毒性數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索2-巰基苯并噻唑大鼠口服的TD50為344 mg，本品最大日劑量為4 g，根據(jù)TD50和最大日劑量計(jì)算MBT人體可接受限度為84 ppm。根據(jù)EMA關(guān)于基因毒性雜質(zhì)限度指南中TTC分段概念，接觸時(shí)間≤1個(gè)月的允許日吸入量為60 μg，頭孢曲松鈉的最大日劑量為4 g，限度應(yīng)為15 ppm。因此，制定內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)為不得過(guò)10 ppm。

(2)采用水-乙腈(60:40,V/V)、0.1%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)、0.5%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)、1.0%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)、2.0%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)篩選流動(dòng)相，結(jié)果采用1.0%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)作為流動(dòng)相時(shí)MBT的峰型最好，并通過(guò)調(diào)節(jié)流速為0.5 mL/min，使MBT與相鄰峰達(dá)到基線分離，分離度良好。

(3)頭孢曲松鈉及USP41收載的各特定雜質(zhì)(脫酰頭孢噻肟?jī)?nèi)酯、7-ACA、三嗪環(huán)、AE活性酯、7-ACT、E異構(gòu)體)在254 nm波長(zhǎng)下有最大吸收，MBT在320 nm波長(zhǎng)下有最大吸收，為了提高檢測(cè)靈敏度以及方法專(zhuān)屬性，實(shí)驗(yàn)選擇320 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

(4)采用流動(dòng)相1.0%甲酸溶液-乙腈(60:40,V/V)為稀釋劑，MBT的提取回收率較低，分析原因MBT偏堿性，酸度系數(shù)(pKa)約為9.80，酸性條件下易于析出。采用水-乙腈(60:40,V/V)為稀釋劑，2-巰基苯并噻唑3個(gè)濃度回收率在86.3%～102.3%之間，表明采用水-乙腈(60:40,V/V)能夠?qū)悠分蠱BT提取較為完全。