趙鵬鵬 郄麗萍 馬婕,* 趙國(guó)忠 米貫東 任風(fēng)芝 姜明星

(1 華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，石家莊 050015；2 華北制藥集團(tuán)華勝有限公司，石家莊 050015)

替考拉寧是與臨床相關(guān)的糖肽類抗生素，由游動(dòng)放線菌產(chǎn)生，是5個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)相似化合物(T-A2-1、T-A2-2、T-A2-3、T-A2-4和T-A2-5)的混合物，其中，T-A2-2是主要有效成分。替考拉寧是治療成人和嬰兒的多重耐藥革蘭陽(yáng)性病原體引起的嚴(yán)重感染的一線療法[1]。同時(shí)也是目前為數(shù)不多的臨床有效活性藥物之一，其未來(lái)具有廣闊的應(yīng)用前景。但是目前存在著產(chǎn)量低等問(wèn)題，限制了應(yīng)用。

微生物產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力主要由微生物的遺傳特性決定，遺傳特性可以通過(guò)誘變來(lái)改變。目前誘變的手段有很多，如熱處理、紫外照射、常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)等。已有大量關(guān)于熱處理、紫外照射等處理技術(shù)的研究[2]，但是關(guān)于替考拉寧產(chǎn)生菌的誘變處理應(yīng)用相對(duì)較少，而且處理效果并不理想。因此，我們采用了ARTP誘變技術(shù)來(lái)進(jìn)行菌種選育。

ARTP誘變技術(shù)是近年來(lái)新興的一種具有高效率特點(diǎn)的誘變手段，尤其是在微生物菌種改良選育領(lǐng)域。該技術(shù)主要是利用高濃度的活性粒子均勻地作用于微生物，從而改變細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)并引起基因損傷，誘發(fā)生物細(xì)胞啟動(dòng)SOS修復(fù)機(jī)制，最終導(dǎo)致微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生相應(yīng)變化[3-4]。已有相關(guān)研究利用ARTP誘變技術(shù)來(lái)進(jìn)行菌種選育工作，并且取得了一定的效果[5-6]。但是有關(guān)替考拉寧產(chǎn)生菌株方面的報(bào)道較少。

本研究利用ARTP誘變技術(shù)來(lái)進(jìn)行替考拉寧產(chǎn)生菌株的選育工作，并從轉(zhuǎn)速、接種量、溫度和pH等因素進(jìn)行了發(fā)酵工藝優(yōu)化。最后，成功篩選得到了一株新的高產(chǎn)突變株，形成了一個(gè)新的發(fā)酵工藝，顯著提高了替考拉寧的產(chǎn)量。這表明，ARTP誘變技術(shù)在替考拉寧產(chǎn)生菌菌種誘變方面擁有較大的應(yīng)用潛力，發(fā)酵工藝的優(yōu)化對(duì)實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)具有指導(dǎo)性意義。

1 儀器與試藥

超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；ARTP-ⅡS型誘變育種儀(無(wú)錫源清天木生物科技有限公司)；DELTA 320型pH計(jì)(Mettler-Toledo有限公司)；Pico型高速離心機(jī)(賽默飛世爾科技有限公司)；LC-2030C型高效液相色譜儀(島津有限公司)。

替考拉寧標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度為92.28%)。乙腈和甲醇為色譜級(jí)，其他試劑均為分析純，水為去離子水。

替考拉寧產(chǎn)生菌游動(dòng)放線菌(Actinoplanes teichomycetics)T19，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

2 試驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基的配制[7]

固體培養(yǎng)基(平板、斜面培養(yǎng)基)：精密稱量可溶性淀粉20 g，K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 1 g，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，瓊脂20 g，置于1000 mL量瓶中，加水溶解并定容，用6 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)至pH為7.2。

種子培養(yǎng)基：精密稱量淀粉40 g，黃豆粉20 g，酵母粉5 g，蛋白胨5 g，NaCl 4 g，MgSO40.5 g，(NH4)2SO42 g，CaCO35 g，置于1000 mL量瓶中，加水溶解并定容，用6 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)至pH為7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：精準(zhǔn)稱量淀粉40 g，葡萄糖20 g，NH4Cl 3 g，NaNO32 g，黃豆粉20 g，MgSO40.5 g，玉米油5 g，CaCO35 g，置于1000 mL量瓶中，加水溶解并定容，用6 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)至pH為7.2。

2.2 培養(yǎng)方法

固體培養(yǎng)：將保存的菌種T19(甘油管)用無(wú)菌水稀釋后，涂布于平板或斜面培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)室，培養(yǎng)7 d。

種子培養(yǎng)：從成熟斜面培養(yǎng)基挖塊(1 cm×0.5 cm)，轉(zhuǎn)接到裝液量為30 mL的250 mL三角瓶中，置于28℃培養(yǎng)室，搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min，培養(yǎng)2 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)2 d的種子液以10%的接種量轉(zhuǎn)接到裝液量為40 mL的250 mL三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min，培養(yǎng)7 d。

單孢子懸液的制備：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的T19新鮮斜面一支，加入10 mL無(wú)菌生理鹽水，用接種針刮下，玻璃珠打散，過(guò)濾，制成單孢子懸液。

2.3 抗性篩選濃度的確定

將出發(fā)菌株的單孢子懸液分別涂布于不同濃度(1、2、4、6和8 mg/mL)替考拉寧平板培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)10 d，觀察平板上菌落的生長(zhǎng)狀況，確定替考拉寧游動(dòng)放線菌抗自身代謝產(chǎn)物替考拉寧的最小抑菌濃度。

2.4 ARTP誘變方法

取10 μL菌懸液滴加在無(wú)菌的不銹鋼載片上，將載片放于誘變育種儀中，按照一定的時(shí)間進(jìn)行照射處理，照射間距為2 nm。設(shè)置誘變功率為100 W，氣流量為10 SLM。設(shè)置不同的處理時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、70、80和90 s。統(tǒng)計(jì)致死率、正突變率和負(fù)突變率，從而確定出最佳的誘變條件。

致死率=(未經(jīng)誘變處理菌落數(shù)-經(jīng)誘變處理菌落數(shù))/未經(jīng)誘變處理菌落數(shù)×100%。

正突變率=相對(duì)效價(jià)大于110%的菌落數(shù)/突變菌落數(shù)×100%。

負(fù)突變率=相對(duì)效價(jià)小于90%的菌落數(shù)/突變菌落數(shù)×100%。

2.5 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將突變高產(chǎn)替考拉寧菌株連續(xù)傳代5次，測(cè)定每一代突變菌株產(chǎn)替考拉寧的能力，從而驗(yàn)證突變菌株生產(chǎn)性能的穩(wěn)定性。

2.6 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

以誘變后產(chǎn)量最高的菌株為實(shí)驗(yàn)菌株，對(duì)原始發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

轉(zhuǎn)速：考察不同轉(zhuǎn)速(200、210、220、230和240 r/min)對(duì)替考拉寧產(chǎn)量的影響。

接種量：考察不同接種量(2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%和15%)對(duì)替考拉寧產(chǎn)量的影響。

溫度：考察不同溫度(24℃、26℃、28℃、32℃和34℃)對(duì)替考拉寧產(chǎn)量的影響。

pH：考察不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5)對(duì)替考拉寧產(chǎn)量的影響。

2.7 發(fā)酵液的效價(jià)測(cè)定

發(fā)酵液的效價(jià)測(cè)定參考已有研究[8]。取發(fā)酵液3 mL，與乙醇以1:1(V:V)混勻，靜置1 h，3000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)行HPLC分析。

2.8 分析條件

HPLC檢測(cè)：C18柱(4.0 mm×250 mm，5 μm)；A相0.02 mol/L乙酸銨，B相色譜級(jí)乙腈，梯度洗脫(條件見(jiàn)表1)；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣溫度40 ℃，進(jìn)樣量20 μL；流速1 mL/min；tR7.3 min，tc14.6 min。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Gradiet elution condition

3 結(jié)果與討論

3.1 替考拉寧抗性篩選濃度的確定

為了確定替考拉寧的抗性篩選濃度，在替考拉寧濃度為1～8 mg/mL范圍內(nèi)的平板上，觀察T19菌落生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)菌株在1和2 mg/mL的替考拉寧抗性平板上生長(zhǎng)狀態(tài)良好，在4 mg/mL替考拉寧抗性平板上呈現(xiàn)微弱生長(zhǎng)的狀態(tài)，在6 mg/mL替考拉寧抗性平板上菌落完全不生長(zhǎng)。這表明菌株T19的耐自身代謝產(chǎn)物替考拉寧濃度低于6 mg/mL，從而確定替考拉寧抗性篩選濃度為6 mg/mL，這與已有相關(guān)研究一致[9]。

3.2 ARTP處理時(shí)間的確定

為了確定最佳的ARTP處理時(shí)間，在固體平板培養(yǎng)基上涂布經(jīng)ARTP誘變處理不同時(shí)間的菌懸液，在28℃培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)7 d，以未誘變處理的菌懸液為對(duì)照，搖瓶篩選ARTP誘變處理不同時(shí)間的菌落，計(jì)算致死率和突變率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，隨著ARTP誘變處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株T19的致死率逐漸升高，在90 s以后，致死率增加速率減慢；正突變率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在90 s時(shí)達(dá)到最高值(18.4%)；負(fù)突變率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，在90 s以后，負(fù)突變率趨于平緩；綜合考慮，我們確定最佳ARTP誘變處理時(shí)間為90 s。

3.3 誘變菌株搖瓶篩選

以T19菌株為出發(fā)菌株，將經(jīng)ARTP處理90 s后的孢子液混勻后，梯度稀釋涂布于含6 mg/mL替考拉寧平板上，挑選66株單菌落進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)替考拉寧效價(jià)分析，以出發(fā)菌株相對(duì)效價(jià)為100，計(jì)算突變株的相對(duì)效價(jià)，結(jié)果如表2所示，17株為正突變菌株(相對(duì)效價(jià)在110以上)，約占28.8%；35株為未突變菌株(相對(duì)效價(jià)在90～110)，約占54.5%；14株為負(fù)突變菌株(相對(duì)效價(jià)在90以下)，約占16.7%。正突變率較之前的18.4%高出了10.4%，這說(shuō)明抗性篩選在一定程度上降低了非正突變率菌株的比例。

表2 替考拉寧抗性突變株篩選結(jié)果Tab.2 Screening results of teicoplanin-resistant mutants

通過(guò)多次復(fù)篩之后，有4株抗性突變菌株顯示出了很好的產(chǎn)替考拉寧能力，其發(fā)酵效價(jià)超過(guò)原始菌株T19的20%，且比較穩(wěn)定，其中T190226-2的發(fā)酵的相對(duì)效價(jià)最高，達(dá)到142%，為出發(fā)菌株T19的1.42倍，見(jiàn)表3和圖2。

表3 4株高產(chǎn)突變菌株的搖瓶發(fā)酵情況Tab.3 Shaking flask fermentation conditions of four highyielding mutant strains

3.4 突變菌株T190226-2的遺傳穩(wěn)定性考察

菌種的傳代穩(wěn)定性是決定其能否實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的重要因素。采用斜面?zhèn)鞔u瓶驗(yàn)證的方法，考察經(jīng)過(guò)誘變和抗性篩選得到的這一株新的突變菌株T190226-2的傳代穩(wěn)定性。連續(xù)傳代5代，測(cè)定每一代菌株的相對(duì)效價(jià)，結(jié)果由圖3所示。從圖3中可以看出，高產(chǎn)菌株T190226-2經(jīng)穩(wěn)定性傳代檢測(cè)，在第五代時(shí)相對(duì)效價(jià)(95.4%)稍有下降。由此可以表明，高產(chǎn)菌株T190226-2具有穩(wěn)定的遺傳特性。

3.5 誘變前后菌落形態(tài)變化

經(jīng)過(guò)誘變篩選后，菌株內(nèi)部的基因會(huì)發(fā)生一定的改變，從而導(dǎo)致其性狀的一些改變。如圖4所示，突變菌株與出發(fā)菌株相比，在形態(tài)上已經(jīng)有了顯著的差異，在固體培養(yǎng)基上，出發(fā)菌株經(jīng)培養(yǎng)后，顏色為橙色，褶皺較多；突變菌株的形態(tài)與出發(fā)菌株稍有差異，顏色為肉粉色，褶皺相對(duì)較少。這一新突變菌株也是首次報(bào)道。突變菌株的生長(zhǎng)形態(tài)發(fā)生了一定的變化，表明經(jīng)過(guò)誘變及抗性篩選，菌絲內(nèi)部基因可能發(fā)生了一定的變化，具體發(fā)生變化的基因還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.6 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

在搖瓶實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)速、接種量、溫度和pH等因素的考察，確定最佳培養(yǎng)條件。結(jié)果如圖5所示。

(1)轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響：研究了不同轉(zhuǎn)速(200、210、220、230、240 r/min)對(duì)菌株T190226-2發(fā)酵的影響。如圖5a所示，隨著轉(zhuǎn)速的增加，相對(duì)效價(jià)呈現(xiàn)出先增長(zhǎng)和下降的趨勢(shì)，在轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)，發(fā)酵的相對(duì)效價(jià)最高。有研究表明[10]，微生物發(fā)酵過(guò)程中所需的溶氧量各有差異，高轉(zhuǎn)速可以增加發(fā)酵液中的溶解氧含量。搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株T190226-2在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)溶氧的需求是有一定限度的。

(2)接種量對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響：研究了不同接種量(2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%和15%)對(duì)菌株T190226-2發(fā)酵的影響。接種量對(duì)微生物的發(fā)酵有著重要的影響，接種量的大小也受多個(gè)因素影響，包括菌種類別、發(fā)酵條件和種子液生長(zhǎng)狀態(tài)。如圖5b所示，隨著接種量的增加，菌株T190226-2發(fā)酵的相對(duì)效價(jià)呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，接種量為7.5%時(shí)，相對(duì)效價(jià)達(dá)到最高值(165%)。這表明，接種量過(guò)小或過(guò)大都會(huì)影響微生物的正常生長(zhǎng)代謝，接種量過(guò)小會(huì)引起菌體生長(zhǎng)緩慢，無(wú)法得到飽和的菌體密度，進(jìn)而影響替考拉寧的產(chǎn)生；接種量過(guò)大會(huì)過(guò)早可能會(huì)引起營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏，不利于次級(jí)代謝期替考拉寧的產(chǎn)生。

(3)溫度對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響：研究了不同溫度(24℃、26℃、28℃、30℃和32℃)對(duì)菌株T190226-2發(fā)酵的影響。從圖5c中可以看出，溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育有著重要影響[11]，隨著溫度的升高，菌株T190226-2發(fā)酵的相對(duì)效價(jià)先增加后降低，在28℃時(shí)達(dá)到最大值。這表明菌株T190226-2具有嗜溫性，溫度過(guò)高會(huì)對(duì)菌株生長(zhǎng)和替考拉寧生成產(chǎn)生負(fù)面影響。同時(shí)適宜的溫度，也能降低發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的蒸發(fā)。

(4)pH對(duì)發(fā)酵效價(jià)的影響：初始pH對(duì)微生物發(fā)酵有著重要的影響。研究了不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5)對(duì)菌株T190226-2發(fā)酵的影響。如圖5d所示，隨著pH的升高，替考拉寧的相對(duì)效價(jià)先增加后減少，在pH為6.5時(shí)，替考拉寧的相對(duì)效價(jià)達(dá)到最大值(180%)。這表明，pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響菌株的正常生長(zhǎng)發(fā)育。

4 結(jié)論

以替考拉寧產(chǎn)生菌游動(dòng)放線菌T19為出發(fā)菌株，通過(guò)ARTP誘變以及抗性選育等手段對(duì)替考拉寧產(chǎn)生菌T19進(jìn)行了遺傳選育研究，得到了一株新的高產(chǎn)突變菌株T190226-2，并且具有較好的遺傳穩(wěn)定性，替考拉寧的效價(jià)水平為出發(fā)菌株的142%。通過(guò)發(fā)酵條件的優(yōu)化，包括轉(zhuǎn)速、接種量、溫度和pH等因素的考察，確定了最優(yōu)的發(fā)酵條件：轉(zhuǎn)速為220 r/min，接種量為7.5%，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為28℃，初始pH為6.5，替考拉寧的最高發(fā)酵相對(duì)效價(jià)可達(dá)180%，較出發(fā)菌株提高了80%。這表明ARTP技術(shù)可以有效用于替考拉寧產(chǎn)生菌游動(dòng)放線菌的選育；同時(shí)，對(duì)新菌種優(yōu)化后的發(fā)酵工藝，可大幅度提高替考拉寧的產(chǎn)量，對(duì)其工業(yè)化生產(chǎn)有重要的意義。