吳蔚，景豆豆，曹理，浦飛飛，邵增務(wù)

0 引言

骨肉瘤是最常見的具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性的原發(fā)惡性骨腫瘤，發(fā)病率約占原發(fā)惡性骨腫瘤的56%[1]。骨肉瘤在兒童和青少年（中位年齡16歲）中較為常見，好發(fā)于長骨干骺端，包括股骨遠(yuǎn)端和脛骨近端[2]。根據(jù)第5版世界衛(wèi)生組織（WHO）骨與軟組織腫瘤分類，將骨肉瘤分為低級別中心性骨肉瘤、普通型骨肉瘤、血管擴(kuò)張型骨肉瘤、小細(xì)胞型骨肉瘤、骨膜骨肉瘤、骨旁骨肉瘤、高級別表面骨肉瘤和繼發(fā)性骨肉瘤[3]。外科手術(shù)是治療骨肉瘤的重要方法，隨著新輔助化療方案的推廣，化療聯(lián)合手術(shù)治療使非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者5年生存率達(dá)到70%。對于晚期和復(fù)發(fā)性骨肉瘤患者，盡管加入了各種化療方案，在以往數(shù)十年的研究中治療效果仍然很差，5年生存率僅為20%[4]。因此，迫切需要尋找一種可以從根本上改善骨肉瘤預(yù)后的新型治療方案。

一般情況下，人體內(nèi)細(xì)胞發(fā)生癌變后，免疫系統(tǒng)都可識別并消滅腫瘤細(xì)胞，但腫瘤細(xì)胞非?！敖苹?，可通過多種手段“欺騙”免疫系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。為避免腫瘤免疫逃逸的發(fā)生，腫瘤免疫治療應(yīng)運(yùn)而生。腫瘤免疫治療是通過重新激活體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，再次啟動并維持“腫瘤-免疫循環(huán)”進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞的手段。腫瘤免疫反應(yīng)以細(xì)胞免疫反應(yīng)為主，CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）受到抗原特異性信號和協(xié)同刺激信號雙重信號激活，是殺傷腫瘤細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞；CD4+T細(xì)胞在接受雙重信號刺激后活化也釋放IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)抗腫瘤過程中發(fā)揮重要作用[5]；NK細(xì)胞（natural killer cells）和NKT細(xì)胞（natural killer T cells）通過抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用、Fas/FasL途徑、穿孔素-顆粒酶途徑以及釋放TNF等細(xì)胞毒性因子殺傷腫瘤細(xì)胞[6]。體液免疫僅在某些情況下起協(xié)同作用，甚至可以抑制免疫細(xì)胞的功能，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長。持續(xù)的體液免疫反應(yīng)加劇腫瘤微環(huán)境中先天免疫細(xì)胞的募集和激活，進(jìn)而影響腫瘤組織及癌旁組織的組織重塑、血管生成等功能，這些保護(hù)機(jī)制反而共同促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展[7]。如乳腺癌誘導(dǎo)引流淋巴結(jié)中的B細(xì)胞積累，這些B細(xì)胞通過產(chǎn)生靶向糖基化膜蛋白HSPA4的致病性IgG，選擇性促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[8]。

近年來在腫瘤免疫反應(yīng)研究的基礎(chǔ)上，研究者們針對腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞或其受體的靶向治療（如免疫檢查點(diǎn)抑制劑PD-1/PD-L1單抗），以PD-1/PD-L1單抗為代表的免疫治療在黑色素瘤、肺癌、乳腺癌等不同類型的腫瘤中取得了令人鼓舞的療效[9]，再次激發(fā)了腫瘤免疫治療研究的熱潮。近年來隨著骨肉瘤患者的規(guī)范化治療后所遇到的瓶頸，針對骨肉瘤免疫治療的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)日益增多，本文從增強(qiáng)患者自身免疫系統(tǒng)對腫瘤的應(yīng)答和外源性增強(qiáng)患者免疫功能兩個方面對骨肉瘤的免疫治療進(jìn)行綜述，見圖1，以期將來能發(fā)揮免疫治療的優(yōu)勢治愈骨肉瘤。

1 增強(qiáng)患者本身的免疫功能

人體免疫系統(tǒng)極為復(fù)雜，各種免疫細(xì)胞和免疫因子通過協(xié)同作用共同抵御外來威脅（例如感染、腫瘤等）。腫瘤細(xì)胞可通過隱藏抗原、下調(diào)人類白細(xì)胞抗原（HLA）表達(dá)、釋放抑制性細(xì)胞因子、募集Treg細(xì)胞、骨髓源性抑制細(xì)胞和腫瘤相關(guān)Μ2巨噬細(xì)胞等手段實(shí)現(xiàn)免疫逃逸[10]。因此，增強(qiáng)患者自身免疫功能旨在消除腫瘤免疫逃逸并重新喚醒機(jī)體自身免疫系統(tǒng)識別，以達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。

1.1 免疫檢查點(diǎn)抑制劑

近年來，研究者們開發(fā)了靶向細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4）、PD-1/PD-L1單抗，并且這些已經(jīng)在黑色素瘤[11]、肺癌[12]等惡性腫瘤治療中取得了較好的療效。PD-1/PD-L1作為免疫治療靶點(diǎn)，開啟了免疫治療的新時代并加速了對骨肉瘤免疫治療的研究。PD-1表達(dá)于包括CTL、NK細(xì)胞、B細(xì)胞等在內(nèi)的各種免疫細(xì)胞表面，可與癌細(xì)胞表明的PD-L1結(jié)合從而對免疫細(xì)胞傳遞程序性死亡信號。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)通過抗體阻斷PD-1/PD-L1相互作用顯著改善骨肉瘤對CTL的反應(yīng)性，使轉(zhuǎn)移性骨肉瘤小鼠模型的腫瘤負(fù)荷減少和存活率增加[13]。此外，阻斷PD-1/PD-L1軸還增強(qiáng)了順鉑對骨肉瘤的化療效果[14]。這些研究的有效性僅停留在動物模型階段，而相關(guān)臨床試驗(yàn)針對PD-1/PD-L1的單克隆抗體并未表現(xiàn)出和動物模型相同的治療效果。Le Cesne等在17例晚期骨肉瘤患者中進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6個月無進(jìn)展生存率僅為13.3%，他們認(rèn)為抑制PD-1在骨肉瘤免疫治療中的療效有限[15]。北京大學(xué)人民醫(yī)院進(jìn)行的卡瑞利珠單抗聯(lián)合阿帕替尼治療晚期骨肉瘤的Ⅱ期臨床試驗(yàn)也未達(dá)到6個月的無進(jìn)展生存（PFS）預(yù)設(shè)目標(biāo)[16]。一項(xiàng)關(guān)于派姆單抗療效的多中心Ⅱ期臨床試驗(yàn)（SARC028）是第一個通過阻斷免疫檢查點(diǎn)來治療晚期軟組織肉瘤和骨肉瘤的前瞻性研究。雖然該研究顯示出了一定應(yīng)用前景，但入組患者療效遠(yuǎn)未達(dá)到預(yù)期。只有18%的軟組織肉瘤患者對于派姆單抗出現(xiàn)了臨床反應(yīng)，而出現(xiàn)臨床反應(yīng)的骨肉瘤患者僅有5%[17]。有研究報(bào)道，骨肉瘤的PD-L1表達(dá)水平不一且通常伴有ΜHCⅠ類分子的丟失導(dǎo)致了免疫逃逸的發(fā)生[18]，這也許是免疫檢查點(diǎn)抑制劑對于骨肉瘤療效不佳的重要原因。因此骨肉瘤患者在進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療之前，檢測PD-L1和ΜHCⅠ類分子的表達(dá)水平對于改善療效可能具有重要意義。

CTLA-4表達(dá)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）和記憶T細(xì)胞表面，表達(dá)過高將競爭性抑制T細(xì)胞CD28接受足夠的協(xié)同刺激信號從而喪失抗癌活性，或與樹突狀細(xì)胞上的CD80/86結(jié)合后導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞功能抑制[19]。與16例健康志愿者相比，19例骨肉瘤患者血液中發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞CTLA-4表達(dá)水平上調(diào)，這是開發(fā)CTLA-4抑制劑的基礎(chǔ)[20]。2011年開發(fā)的CTLA-4單克隆抗體易普利姆瑪（Ipilimumab）被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)為首個治療黑色素瘤的新一代免疫檢查點(diǎn)抑制劑[21]。一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)25%的骨肉瘤患者在接受易普利姆瑪治療后病情穩(wěn)定[22]。在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤K7Μ2小鼠模型中進(jìn)行的聯(lián)合α-CTLA-4和α-PD-L1抗體阻斷免疫療法使大多數(shù)小鼠腫瘤得到完全控制[23]，這為治療骨肉瘤提供了新的策略。

1.2 腫瘤疫苗

腫瘤疫苗旨在通過暴露腫瘤抗原從而誘導(dǎo)人體免疫系統(tǒng)抗腫瘤反應(yīng)。目前腫瘤疫苗技術(shù)最為成熟的當(dāng)屬宮頸癌疫苗，宮頸癌發(fā)病多為人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus,HPV）誘導(dǎo)，所以宮頸癌疫苗分為預(yù)防性疫苗（針對HPV感染）和治療性疫苗（暴露腫瘤抗原）[24]。樹突狀細(xì)胞（DC）作為一種專職的抗原呈遞細(xì)胞，可激活并增強(qiáng)CTL的增殖能力。DC疫苗作為目前主要的腫瘤疫苗已被應(yīng)用于多種類型的腫瘤治療以消除難治性腫瘤中的腫瘤細(xì)胞，在骨肉瘤中DC疫苗應(yīng)用最為普遍[25]。雖然Μackall等研究顯示接種DC疫苗的30例患者與對照組相比，5年生存率從31%延長到43%[26]，但Himoudi觀察的12例接受DC疫苗治療的骨肉瘤患者，只有2例誘導(dǎo)了針對腫瘤的特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)[27]；Μiwa等在37例骨肉瘤患者中評估了35例患者的臨床反應(yīng)，僅有6例患者病情穩(wěn)定，28例患者出現(xiàn)了腫瘤的進(jìn)展[28]。這些研究表明腫瘤疫苗治療骨肉瘤是安全的，并且可以在一定程度上激活免疫系統(tǒng)，但對骨肉瘤的治療效果或與其他免疫療法聯(lián)用是否會改善患者預(yù)后仍不清楚，需要更多相關(guān)研究支持。

1.3 改善腫瘤微環(huán)境

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤組織周圍環(huán)境的改變密切相關(guān)且同時發(fā)生，腫瘤細(xì)胞通過分泌各種細(xì)胞因子、趨化因子和其他因子來功能性地塑造腫瘤生存微環(huán)境，這種微環(huán)境又可以反過來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這就是腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境中不僅存在多種細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞等），還存在豐富的細(xì)胞外基質(zhì)（膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白和生腱蛋白等）以及各種細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ和TGF-β等）[29]。這些非細(xì)胞成分抑制了腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞的活性，促進(jìn)了腫瘤血管生成和生長，構(gòu)成了藥物遞送的物理屏障，抑制藥物滲透到腫瘤的深部區(qū)域，從而導(dǎo)致腫瘤對各種治療藥物的敏感度降低[30]。研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞通過控制免疫浸潤細(xì)胞的募集和分化，建立有利于腫瘤生長、耐藥和轉(zhuǎn)移的局部微環(huán)境[31]。針對骨肉瘤微環(huán)境的研究從未停下腳步，近年來許多研究證實(shí)骨肉瘤來源的外泌體可以廣泛促進(jìn)免疫抑制，此類外泌體可以通過多種途徑抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性，甚至誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，同時增強(qiáng)骨髓源性抑制細(xì)胞（ΜDSC）活性以支持骨肉瘤細(xì)胞免疫逃逸[32]。另外，一些細(xì)胞因子如TGF-β在骨肉瘤中表達(dá)高于健康個體，這是導(dǎo)致轉(zhuǎn)移和化療耐藥的重要原因，與單獨(dú)使用TGF-β阻斷劑相比，骨肉瘤小鼠模型在TGF-β阻斷劑與DC疫苗聯(lián)合使用時CTL數(shù)量增加，顯示出更強(qiáng)的抗腫瘤作用[33]。這些研究表明，靶向骨肉瘤腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)可能是一種有效的治療策略，但仍需進(jìn)一步臨床試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

1.4 增強(qiáng)先天免疫

雖然適應(yīng)性免疫是腫瘤免疫治療的主要手段，但是先天性免疫的作用同樣不可或缺。最近，先天免疫細(xì)胞在控制腫瘤進(jìn)展中的作用已得到證實(shí)，先天免疫通過直接識別殺傷、自我激活觸發(fā)強(qiáng)烈的適應(yīng)性免疫反應(yīng)來抑制腫瘤進(jìn)展[34]。由于先天免疫細(xì)胞在抗原呈遞、抗原特異性T細(xì)胞引發(fā)和不依賴主要組織相容性復(fù)合體（ΜHC）的直接細(xì)胞殺傷方面的作用，其在消除骨肉瘤方面具有獨(dú)特優(yōu)勢。樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞和γδ T細(xì)胞等先天免疫細(xì)胞已經(jīng)在骨肉瘤中得到廣泛研究，并且與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行了多項(xiàng)臨床試驗(yàn)[35]。環(huán)磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶-干擾素基因刺激蛋白（cGASSTING）通路由于可激活產(chǎn)生Ⅰ型干擾素進(jìn)而提高抗腫瘤免疫力從而獲得了極大的關(guān)注[36]，STING是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的胞質(zhì)DNA傳感器，可招募和激活TANK結(jié)合激酶1（TBK1），后者進(jìn)一步磷酸化干擾素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子3（IRF3）上調(diào)Ⅰ型干擾素的表達(dá)[37]，Ⅰ型干擾素具有多種免疫刺激功能，促進(jìn)DC、T細(xì)胞和NK細(xì)胞等成熟、遷移和激活[38]。鑒于STING的重要性，研究者們開發(fā)了多種STING激動劑（如DΜXAA、CDN、di-ABZI等），并將其作為腫瘤疫苗佐劑、免疫檢查點(diǎn)治療增敏劑等應(yīng)用于動物腫瘤治療中[37]，如STING激動劑改變了小鼠胰腺癌模型的腫瘤負(fù)荷，增加了小鼠存活率[39]；STING激動劑和抗PD-1抗體聯(lián)合應(yīng)用可減少小鼠卵巢癌模型的腹水并延長生存時間[40]。如果將STING激動劑應(yīng)用于骨肉瘤的治療，可能是一種有效的策略。

2 外源性免疫功能細(xì)胞殺傷骨肉瘤組織

外源性增強(qiáng)患者免疫功能主要是通過輸注免疫細(xì)胞，也被稱為過繼細(xì)胞療法（ACT）。腫瘤細(xì)胞可能會下調(diào)自身HLA和腫瘤抗原的表達(dá)，從而使它們無法被T細(xì)胞識別，而工程化T細(xì)胞對腫瘤特定抗原具有高親和力，無需在HLA呈遞的背景下即可識別腫瘤細(xì)胞[41]，這種T細(xì)胞稱為嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-Ts）。T細(xì)胞可以通過由α和β鏈組成的T細(xì)胞受體（TCR）識別抗原，但只有在抗原以8-11個氨基酸長的肽段形式存在時，αβ-TCR才能識別響應(yīng)抗原[42]，說明人體內(nèi)T細(xì)胞識別腫瘤抗原的條件較為苛刻。CAR與TCR不同，CAR分子不需要ΜHC可以直接識別和結(jié)合表達(dá)在細(xì)胞表面的靶分子。CAR分子是一種合成融合蛋白，由識別靶抗原的胞外域、鉸鏈區(qū)、跨膜域和胞內(nèi)信號域組成[43]。首先需要采集分離并純化腫瘤患者外周血中的T細(xì)胞，然后利用病毒載體將CAR分子的基因構(gòu)建體插入到T細(xì)胞的基因組中，使T細(xì)胞在其表面表達(dá)CAR分子，由此產(chǎn)生的CAR-T細(xì)胞在體外擴(kuò)增后（一般需要達(dá)到十億至百億數(shù)量級）回輸患者體內(nèi)[44]。

CAR-T細(xì)胞在血液系統(tǒng)腫瘤的治療中進(jìn)行了廣泛的臨床試驗(yàn)，并取得了重大突破。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD22 CAR-T細(xì)胞在治療難治性或復(fù)發(fā)性B型急性淋巴細(xì)胞白血病可使80%（24/30）的患者得到緩解，也為后續(xù)造血干細(xì)胞移植實(shí)現(xiàn)持久緩解提供了寶貴的時間窗口[45]。鑒于CAR-T細(xì)胞治療的重要性，美國FDA于2017年8月批準(zhǔn)了諾華公司的tisagenlecleucel（CTL019）作為一種CD19導(dǎo)向的CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，用于治療25歲以下復(fù)發(fā)或難治性急性淋巴細(xì)胞白血病的患者[46]。在骨肉瘤中，由于原發(fā)性骨腫瘤通常表現(xiàn)出低突變負(fù)荷并伴隨罕見的天然抗腫瘤T細(xì)胞，因此CAR-T細(xì)胞療法可能是一種有效的策略[47]。Μajzner團(tuán)隊(duì)開發(fā)了針對泛癌抗原B7-H3的CAR-T細(xì)胞，并在動物體內(nèi)展現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，可使異種移植模型中已建立的骨肉瘤、髓母細(xì)胞瘤和尤文肉瘤等實(shí)體瘤消退[48]。CAR-T療法在實(shí)體瘤中尋找其他合適的CAR靶點(diǎn)以及實(shí)體瘤中免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境比血液系統(tǒng)腫瘤更具有挑戰(zhàn)性。原發(fā)性骨腫瘤相對罕見，這也給專門針對腫瘤抗原的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行臨床試驗(yàn)帶來了局限。另外CAR-T細(xì)胞治療的不良反應(yīng)也不容忽視，CAR-T細(xì)胞相關(guān)性腦病綜合征（CRES）、全身炎性反應(yīng)綜合征（SIRS）、炎性結(jié)腸炎和對靶器官的毒性仍有待解決[49]。

其他過繼細(xì)胞治療方案包括CAR-NK細(xì)胞和CAR-腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）。與T細(xì)胞不同，NK細(xì)胞是先天免疫細(xì)胞，具有細(xì)胞毒性和調(diào)節(jié)免疫功能[33]，它不介導(dǎo)移植物抗宿主病（GVHD），可以最大限度地提高靶向腫瘤細(xì)胞毒性，同時減少不良作用，有望實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)而無需擔(dān)心長期毒性。TIL是另一種形式的過繼細(xì)胞療法，研究顯示轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者對TIL的客觀反應(yīng)率（ORR）為40%～70%，治療效果令人滿意[50]。一項(xiàng)臨床前研究報(bào)告表明，從骨肉瘤組織中提取的TIL可以有效穿透腫瘤微環(huán)境，并對同種異體腫瘤細(xì)胞顯示出明顯細(xì)胞毒性作用，這表明TIL療法可能是治療骨肉瘤的有效策略[49]。

3 總結(jié)和展望

骨肉瘤的生物學(xué)特征表明，增強(qiáng)人體免疫反應(yīng)可能會改善骨肉瘤患者的預(yù)后，但是骨肉瘤的異質(zhì)性和免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性又決定了骨肉瘤免疫治療所具有的艱巨性。骨肉瘤從來都不是某種單一的治療方案可以治愈的，進(jìn)行SARC028臨床試驗(yàn)的專家分析骨肉瘤對免疫治療抵抗的機(jī)制可能是由于抑癌基因PTEN失效后導(dǎo)致PI3K-AKT通路過度激活所致[17]，由此可見不同方案的聯(lián)合治療策略是非常有必要的。在小鼠轉(zhuǎn)移性骨肉瘤模型中同時阻斷CTLA-4和PD-L1可完全控制50%的小鼠發(fā)生腫瘤擴(kuò)散，且該聯(lián)合策略也在治療兒童復(fù)發(fā)或難治性實(shí)體瘤中展現(xiàn)了希望的曙光[23]。不同機(jī)制的治療方案聯(lián)用展現(xiàn)出了令人滿意的治療效果，如免疫檢查點(diǎn)抑制劑可增加CAR-T細(xì)胞和TIL的活性[51]，免疫檢查點(diǎn)抑制劑也在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中與CAR-T細(xì)胞療法和腫瘤疫苗聯(lián)用以檢測聯(lián)合用藥的效果[52]。此外，這些免疫治療手段也可輔助手術(shù)、化療以及靶向治療等，它們相輔相成，共同發(fā)揮抗骨肉瘤作用。

即使有如此多的免疫治療手段，但骨肉瘤臨床治療上，特別是骨肉瘤的免疫治療，仍未取得明顯的突破。骨肉瘤是一種基因組高度復(fù)雜、具有復(fù)雜的核型、突變負(fù)荷較高的腫瘤，使用單一的療法治療骨肉瘤，往往不能取得良好的效果[53-54]。而且臨床上發(fā)現(xiàn)腫瘤時，腫瘤往往已經(jīng)處于一種低免疫原性的狀態(tài)，單純增加免疫效應(yīng)細(xì)胞或者免疫應(yīng)答細(xì)胞可能在骨肉瘤中并不能取得比較好的效果。切實(shí)提高骨肉瘤的免疫原性可能是未來腫瘤免疫治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。期待將來逆轉(zhuǎn)骨肉瘤免疫逃逸的治療方案可以徹底治愈骨肉瘤，為骨肉瘤患者帶來新的希望。