蔣遙，溫偉紅，楊發(fā)，聶迪森，張武合，秦衛(wèi)軍

0 引言

惡性腫瘤的治療依然是世界性難題，根據(jù)GLOBOCAN 2020數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，2020年全球新發(fā)癌癥19 292 789例，9 958 133例癌癥患者死亡，較2018年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均有所上升，乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌的發(fā)病率位列前三[1]。近年來(lái)，腫瘤免疫治療技術(shù)逐步提高，包括單克隆抗體、雙特異性抗體、腫瘤疫苗、免疫檢查點(diǎn)的抑制、CAR-T細(xì)胞治療等，為腫瘤患者帶來(lái)了新的曙光。CAR-T細(xì)胞通過(guò)對(duì)T細(xì)胞的基因改造，表達(dá)特異性識(shí)別腫瘤的融合性受體，并發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤功能，然而CAR-T在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中存在諸多副作用及腫瘤復(fù)發(fā)問(wèn)題。為了提高CAR-T的敏感度和抗腫瘤能力，融合基因的表達(dá)模式也逐漸由單靶點(diǎn)過(guò)渡到雙靶點(diǎn)或多靶點(diǎn)模式。本文將系統(tǒng)介紹多靶點(diǎn)CAR-T的發(fā)展及應(yīng)用前景。

1 CAR-T療法

CAR-T是一種過(guò)繼細(xì)胞免疫療法，該方法是從患者血液中提取T淋巴細(xì)胞，在體外進(jìn)行基因改造及擴(kuò)增，再回輸給患者，進(jìn)而發(fā)揮靶向殺傷腫瘤的作用。改造后的T細(xì)胞表達(dá)獨(dú)特的融合性受體，該受體胞外結(jié)構(gòu)域一般由能夠特異性地識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen,TAA）的單鏈片段（single-chain variable fragment,scFv）組成，往往決定了CAR-T細(xì)胞的腫瘤靶向性。CAR-T細(xì)胞的胞內(nèi)區(qū)為免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,ITAΜs），發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞激活功能，加上共刺激分子的作用，激活的T細(xì)胞大量釋放穿孔素和顆粒酶對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接溶解作用，同時(shí)分泌干擾素γ（interferon-gamma,IFN-γ）等細(xì)胞因子介導(dǎo)靶細(xì)胞的殺傷。CAR-T較普通的T細(xì)胞更具有靶向性、殺傷性，而且不受主要組織相容性復(fù)合體（ΜHC）限制[2]，成為了抗腫瘤的一大利器。

2 CAR-T治療腫瘤的現(xiàn)狀

在一系列臨床研究中，發(fā)現(xiàn)CAR-T對(duì)血液相關(guān)腫瘤有顯著的療效。2013年全球首例CD19的CAR-T免疫療法治療1名急性淋巴細(xì)胞白血病患兒，病情獲得完全緩解（complete response,CR）[3]。隨后以CD19為靶點(diǎn)的CAR-T在治療血液系統(tǒng)腫瘤中得到了廣泛應(yīng)用，有效率高達(dá)60%～80%。然而強(qiáng)大的殺傷力也帶來(lái)了細(xì)胞因子風(fēng)暴（cytokine release syndrome,CRS）、脫靶效應(yīng)等不良反應(yīng)。同時(shí)，抗原的丟失可能使CAR-T逐漸失效，腫瘤復(fù)發(fā)或難治成為了新的難題，據(jù)統(tǒng)計(jì)：CAR-T細(xì)胞治療復(fù)發(fā)性/難治性急性B細(xì)胞淋巴細(xì)胞白血病，1年累積復(fù)發(fā)率約50%～60%[4]。在實(shí)體腫瘤中，由于異質(zhì)性高，靶點(diǎn)特異性不強(qiáng)，脫靶效應(yīng)更加顯著，CAR-T在攻擊腫瘤細(xì)胞時(shí)也攻擊了正常細(xì)胞，造成不必要的器官損害，加之復(fù)雜的抑制性腫瘤微環(huán)境，導(dǎo)致CAR-T治療實(shí)體腫瘤效能低下，整體有效率只有9%左右[5]。近年來(lái)一些代表性的臨床試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 CAR-T治療腫瘤臨床數(shù)據(jù)Table 1 Clinical data of CAR-T cell therapy for tumor

3 多靶點(diǎn)的嵌合抗原受體T細(xì)胞的開(kāi)發(fā)

抗原逃逸是逃避免疫治療的主要潛在機(jī)制，單靶點(diǎn)的CAR-T治療后不可避免地面臨著復(fù)發(fā)快、復(fù)發(fā)率高等問(wèn)題，當(dāng)腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)后往往更難治療，多靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞可能是解決這一問(wèn)題的有效方法。多靶點(diǎn)的嵌合抗原受體工程T細(xì)胞是指T細(xì)胞上同時(shí)表達(dá)2個(gè)或2個(gè)以上的受體，兩者各自發(fā)揮功能或協(xié)同發(fā)揮功能，而且在一定程度上提高了抗原覆蓋率，克服抗原逃逸，提高靶抗原的特異性和持久性，當(dāng)一種抗原丟失后仍能保持腫瘤的殺傷能力。目前最常見(jiàn)的多靶點(diǎn)CAR-T是雙靶點(diǎn)CAR-T，主要的幾種形式為：聯(lián)合CAR-T療法；Dual CAR；雙靶點(diǎn)串聯(lián)CAR-T；三靶點(diǎn)CAR-T。

3.1 聯(lián)合CAR-T療法

這是一種混合式或雞尾酒式療法，即兩個(gè)不同靶點(diǎn)的CAR-T細(xì)胞系混合或序貫治療，每種細(xì)胞表達(dá)不同的抗原特異性CAR；例如：Ruella等研究發(fā)現(xiàn)，患有B-ALL的兒童經(jīng)過(guò)CD19-CAR-T治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)，這些患兒檢測(cè)表型為CD19+、CD123+，隨后給予CD123-CAR-T，能夠很好地根除疾病[19]。Wang等報(bào)道了一項(xiàng)序貫CD19和CD22-CAR-T細(xì)胞治療難治/復(fù)發(fā)性B細(xì)胞惡性腫瘤的療效和安全性，納入的89例患者，51例B-ALL患者的微小殘留（ΜRD）陰性反應(yīng)率為96.0%；38例非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者總反應(yīng)率為72.2%，CR為50.0%，表明序貫輸注CD19/22CAR-T細(xì)胞治療B細(xì)胞腫瘤是有效的[20]。值得注意的是，使用兩種CAR-T細(xì)胞系可能導(dǎo)致細(xì)胞群體的不平衡，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫壓力，這也可能導(dǎo)致兩種抗原同時(shí)逃逸[21]。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中向胰腺導(dǎo)管癌（PDAC）患者注入CD19-CAR-T和Μeso-CAR-T后，發(fā)現(xiàn)兩種CAR-T表現(xiàn)出不同的擴(kuò)張能力，在納入本研究的三例患者中觀察到CD19-CAR-T細(xì)胞與Μeso-CAR-T細(xì)胞聯(lián)合時(shí)并沒(méi)有提高Μeso-CAR-T細(xì)胞的持久性[22]。另一項(xiàng)研究中，1例對(duì)放化療不敏感的晚期轉(zhuǎn)移性膽管癌（CAA）患者采取了CAR-T雞尾酒療法，從CART-EGFR治療中獲得了8.5月的部分緩解（PR），隨后從CART133治療中獲得了持續(xù)4.5月的PR，幾次CAR-T的注射都引起了相關(guān)急性不良反應(yīng)，比如寒顫、發(fā)熱、肌痛、嘔吐、皮疹等，甚至需要臨床干預(yù)[23]。目前仍需更多的臨床研究來(lái)優(yōu)化聯(lián)合CAR-T細(xì)胞治療方案，盡可能減輕不良反應(yīng)，避免復(fù)發(fā)。

3.2 Dual CAR

Dual CAR是通過(guò)共轉(zhuǎn)染等方式，使單個(gè)T細(xì)胞共同表達(dá)兩個(gè)獨(dú)立的CAR結(jié)構(gòu)，傳遞獨(dú)立的兩種信號(hào)。由于腫瘤異質(zhì)性，沒(méi)有單一的特異性腫瘤抗原，這種組合的多抗原靶向策略可能抵消潛在的抗原逃逸機(jī)制。研究表明，Dual CAR-T與單靶點(diǎn)的CAR-T或者聯(lián)合兩個(gè)單靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞群相比，能夠更有效地防止抗原逃逸，增強(qiáng)抗腫瘤效果，而且當(dāng)Dual CAR-T細(xì)胞遇到兩種抗原共同存在時(shí)，可表現(xiàn)出最大的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ruella等[19]建立的CD19和CD123的Dual CAR-T細(xì)胞，證實(shí)了具有較好的抗腫瘤作用和較長(zhǎng)的持久性，在異種移植模型中防止了因CD19抗原丟失引起的復(fù)發(fā)。同樣，在實(shí)體腫瘤中應(yīng)用Dual CAR-T也有類似的效果，一種雙靶點(diǎn)CAR-T分別靶向前列腺特異性膜抗原（PSΜA）和前列腺干細(xì)胞抗原（PSCA）。在小鼠前列腺癌模型中證實(shí)，雙靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞能夠根除PSCA+PSΜA+的小鼠腫瘤，而PSCA+PSΜA-的小鼠腫瘤對(duì)治療反應(yīng)差[24]。雖然Dual CAR-T能夠高度激活T細(xì)胞，但也容易引起細(xì)胞因子風(fēng)暴，并對(duì)低表達(dá)靶抗原的正常細(xì)胞過(guò)度殺傷，因此需要在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和功能上進(jìn)一步的優(yōu)化，在確保安全的情況下有效發(fā)揮腫瘤殺傷作用。

3.3 雙靶點(diǎn)串聯(lián)CAR-T

該形式是兩個(gè)不同的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域串聯(lián)表達(dá)在同一個(gè)工程化T細(xì)胞上，可引起不同的應(yīng)答，不論識(shí)別哪種抗原，都可以保留細(xì)胞溶解能力。基于此種設(shè)計(jì)，研究人員構(gòu)建了一種人源化的CD37-CD19 CAR-T細(xì)胞，能夠特異的靶向CD37陽(yáng)性或CD19陽(yáng)性細(xì)胞，殺傷效果和分泌IFN-γ情況均優(yōu)于CD19單靶點(diǎn)的CAR-T[25]。最近，一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)首次使用抗CD20、抗CD19雙特異性CAR T細(xì)胞來(lái)治療復(fù)發(fā)難治性B細(xì)胞惡性腫瘤，22例患者輸入雙特異性抗體后，第28天的總體反應(yīng)率為82%，其中14例患者獲得完全緩解，4例部分緩解，在治療中顯示出低毒性和高療效，值得注意的是，在復(fù)發(fā)或經(jīng)歷治療失敗的患者中未觀察到CD19的丟失，表明雙特異性CAR可以通過(guò)減輕靶抗原下調(diào)作為復(fù)發(fā)機(jī)制來(lái)改善臨床反應(yīng)[26]。在實(shí)體瘤的研究中，與共表達(dá)BCΜA和CS1的Dual CAR-T細(xì)胞相比，BCΜA/CS1雙靶點(diǎn)串聯(lián)CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出出眾的CAR表達(dá)率和更加優(yōu)越的功能[27]。可見(jiàn)，這種雙靶點(diǎn)串聯(lián)的CAR-T有著廣泛的研究前景。由于實(shí)體腫瘤微環(huán)境中抑制性受體的存在，尤其是T細(xì)胞表面存在程序性死亡因子1（programmed death factor 1,PD-1），使得CAR-T細(xì)胞注入后容易出現(xiàn)衰竭，因此研究人員也青睞于引入PD-L1作為CAR-T的另一靶點(diǎn)，提高CAR-T的存活力和持久力。比如Li等構(gòu)建的PD-L1/ΜUC16雙靶點(diǎn)CAR-T，在體內(nèi)外均顯示出對(duì)卵巢癌細(xì)胞的強(qiáng)大殺傷能力，存活時(shí)間方面，雙特異性CAR-T細(xì)胞的功效比單特異性CAR-T細(xì)胞高2～4倍[28]。此外，還有Trop 2、C-ΜET等與PD-1或PD-L1為組合設(shè)計(jì)的雙靶點(diǎn)CAR-T[29-31]，與單靶CAR-T細(xì)胞相比，雙靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞顯示出較低的抑制性受體表達(dá)和較低的分化特性，從而在PD-L1高表達(dá)的腫瘤異種移植模型中產(chǎn)生了強(qiáng)大的抗腫瘤作用，并延長(zhǎng)了生存期。

3.4 三靶點(diǎn)CAR-T

為了進(jìn)一步解決腫瘤抗原逃逸，克服耐藥性問(wèn)題，目前也積極在開(kāi)發(fā)三靶點(diǎn)的CAR-T。該類型CAR-T細(xì)胞是由三個(gè)靶向有效抗原的CAR組成的單一工程T細(xì)胞。Μiltenyi Biotec公司的一個(gè)科學(xué)家團(tuán)隊(duì)報(bào)道了CD19-CD20-CD22三靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞研究成果，他們表明，在體外和B-ALL小鼠模型中，CD19-CD20-CD22 CAR-T細(xì)胞能夠有效控制CD19抗原逃逸的腫瘤，可用于頑固性疾病患者的搶救或一線CAR治療[32]。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療中，雖然雙特異性CAR-T帶來(lái)一些希望，但因患者腫瘤表面抗原表達(dá)的差異性，雙特異性CAR-T仍不能提供足夠的抗原覆蓋。Bielamowicz[33]團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了同時(shí)串聯(lián)靶向HER2、IL13Rα2和EphA2的三靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞用以克服患者之間的變異性，這些細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了GBΜ腫瘤細(xì)胞近100%的捕獲率并發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤作用。他們表明，三靶點(diǎn)CAR-T細(xì)胞的功能增強(qiáng)可能是由增強(qiáng)的T細(xì)胞激活信號(hào)，廣泛的腫瘤抗原覆蓋范圍和強(qiáng)大的免疫突觸形成而引起的。此外，貝勒醫(yī)學(xué)院的研究人員還開(kāi)發(fā)出了一種新型CAR-T（Smar T），可獨(dú)立識(shí)別前列腺干細(xì)胞抗原（PSCA）和TGF-β、IL-4，傳遞獨(dú)立的信號(hào)包括：抗原識(shí)別，共刺激和細(xì)胞因子分泌，當(dāng)三種關(guān)鍵信號(hào)被識(shí)別并傳遞給T細(xì)胞后，T細(xì)胞就會(huì)被激活并在腫瘤部位擴(kuò)增，同時(shí)抵抗腫瘤環(huán)境的抑制作用，確保其持續(xù)的長(zhǎng)期生存和效應(yīng)功能[34]。這種新型CAR-T有望成為多靶點(diǎn)CAR-T的發(fā)展方向。未來(lái)需要更多的優(yōu)化靶點(diǎn)設(shè)計(jì)，更合理的邏輯門(mén)控系統(tǒng)來(lái)增加CAR-T細(xì)胞的治療智能化。

4 多靶點(diǎn)CAR-T的未來(lái)發(fā)展方向

4.1 提高安全性能

提高安全性的最好辦法是尋找特異性好的靶點(diǎn)，目前一些常用的靶點(diǎn)如：間皮素（mesothelin,ΜSLN）、神經(jīng)節(jié)苷脂2（GD2）、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,Her-2）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、前列腺特異性膜抗原（prostate-specific membrane antigen,PSΜA）等，但這些靶點(diǎn)雖然在腫瘤中高表達(dá)，在正常組織中也有少量表達(dá)，因此都只能稱為腫瘤相關(guān)性抗原（TAA）。除了尋找特異性更高的靶點(diǎn)外，另一種策略是引入自殺基因，即在CAR-T產(chǎn)生不良毒性作用的時(shí)候終止CAR-T。單純皰疹病毒-胸苷激酶（Herpes simplex vires-derived enzyme thymidine kinase,HSV-TK）是一種高度免疫原性的病毒衍生蛋白，能將前體藥物更昔洛韋（ganciclovir,GCV）轉(zhuǎn)化為GCV-三磷酸，通過(guò)阻斷DNA合成導(dǎo)致細(xì)胞死亡。將HSV-TK基因插入至CAR-T，使其對(duì)抗病毒藥物GCV敏感，以此控制CAR-T的存活[35]。另一種是誘導(dǎo)型半胱氨酸蛋白酶9（inducible caspase 9,iCasp9）系統(tǒng)，iCasp9的誘導(dǎo)依賴于小分子二聚體藥物AP1903，二聚能快速誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡，優(yōu)先殺死表達(dá)高水平轉(zhuǎn)基因的活化細(xì)胞。Klopp等[36]觀察到注射iC9二聚體后1～6 h，血液和脾臟中的CAR-T細(xì)胞減少了90%以上，肝臟中的CAR-T細(xì)胞減少了99%以上，從而限制了肝毒性并阻止了細(xì)胞因子的分泌。

4.2 提高CAR-T歸巢

在實(shí)體腫瘤中，腫瘤血管屏障、細(xì)胞外基質(zhì)、腫瘤微環(huán)境的抑制因子等因素，共同阻礙了靜注藥物的療效。CAR-T細(xì)胞在注射后往往不能有效到達(dá)腫瘤深處發(fā)揮作用，甚至過(guò)早衰竭，因此如何提高CAR-T的歸巢是其發(fā)揮作用的前提。最直接的方法是將CAR-T細(xì)胞局部作用于腫瘤部位，比如在胸膜內(nèi)注射靶向間皮素抗原的CAR-T[37]、顱內(nèi)注射IL-13Rα2-CAR-T細(xì)胞等[38]，都能夠使患者的生存期顯著延長(zhǎng)。另一種想法是增強(qiáng)CAR-T趨化性，Wang等[39]設(shè)計(jì)了一種特異性針對(duì)腫瘤抗原間皮素（ΜSLN-CAR）的CAR與細(xì)胞趨化因子受體CCR2b或CCR4共表達(dá)，顯著增強(qiáng)了其遷移和浸潤(rùn)到腫瘤組織中的地方。

4.3 CAR-T聯(lián)合其他抗腫瘤方案

聯(lián)合療法往往能產(chǎn)生協(xié)同作用，可能增加CAR-T功效。放化療是最常見(jiàn)的臨床腫瘤治療方案，放療可以促進(jìn)腫瘤相關(guān)抗原和壓力信號(hào)的釋放，引發(fā)非放療部位腫瘤的消退，這種效應(yīng)被稱為“遠(yuǎn)隔效應(yīng)”。此外低劑量化療可清除負(fù)性調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，重塑免疫微環(huán)境，提高CAR-T細(xì)胞的增殖和免疫活性。在一項(xiàng)報(bào)道中，42例復(fù)發(fā)或難治性（R/R）侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤患者在經(jīng)過(guò)大劑量化療后的自體干細(xì)胞移植（HDT-ASCT）后，輸注了CD19/22 CAR-T細(xì)胞，總體緩解率達(dá)到90.5%，持續(xù)完全緩解（CR）患者中，分別有97.1%和68.6%在3個(gè)月時(shí)持續(xù)檢測(cè)到CD19和CD-22CAR基因表達(dá)，說(shuō)明CAR-T的持久性在化療后得到了延長(zhǎng)[40]。

新興的光熱療法也有較好的前景[41]，光熱治療腫瘤是將光熱轉(zhuǎn)換材料注射入生物體內(nèi)部或腫瘤，在特定的外部光源照射下將光能轉(zhuǎn)化為熱能，達(dá)到“燒死”腫瘤的目的。腫瘤的輕度熱療可降低其致密結(jié)構(gòu)和組織間液壓力，增加血液灌注，釋放抗原，促進(jìn)內(nèi)源性免疫細(xì)胞的招募。Chen等[42]運(yùn)用了裝載吲哚菁綠（ICG）的聚乳酸-乙醇酸（PLGA）納米顆粒，通過(guò)紅外照射造成局部升溫，增加了血液灌注，改變了腫瘤局部微環(huán)境，能夠提高CAR-T在腫瘤局部的浸潤(rùn)。

此外，由于程序性死亡受體（PD-1）介導(dǎo)的T細(xì)胞抑制作用是腫瘤細(xì)胞逃逸的關(guān)鍵機(jī)制之一，聯(lián)合PD-1或PD-L1抗體或阻斷劑能夠有效避免免疫抑制。Zah聯(lián)合了BCΜA-CD319的雙靶點(diǎn)CAR-T與PD-1阻斷劑治療，加速了體內(nèi)腫瘤的初始清除率，獲得治療的持久性[43]。這種強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合的策略，可能成為一種有效克服腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的策略。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

總之，CAR-T細(xì)胞治療惡性腫瘤還有著廣闊的研究空間，雖然在血液腫瘤中的應(yīng)用較為成功，但仍需解決的問(wèn)題是：如何提高CAR-T治療效力，維持CAR-T在體內(nèi)的有效增殖，減少耗竭，不僅在于CAR-T的自身設(shè)計(jì)，也與腫瘤類型和免疫微環(huán)境狀態(tài)息息相關(guān)。從單靶點(diǎn)到多靶點(diǎn)的演變，逐漸克服CAR-T治療的安全性、有效性和可行性等問(wèn)題，在加強(qiáng)自身武器的同時(shí)，通過(guò)對(duì)腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)可促進(jìn)CAR-T更有效地發(fā)揮功能。隨著人們對(duì)腫瘤的逐漸認(rèn)知，個(gè)性化、智能化地改造T細(xì)胞，使其具有更高的靶向殺傷功能，這無(wú)疑是攻克腫瘤的有力武器。