張瑞，彭濤，陰建，宋頌，王珅，秘子涵，陳汶，任建松,6

0 引言

胃癌（gastric cancer,GC）是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。我國是胃癌高發(fā)國家，2020年胃癌新發(fā)病例數(shù)47.9萬，死亡37.4萬，約占全世界胃癌新發(fā)和死亡病例的44.0%和48.6%，防控形勢十分嚴峻[1]。胃癌防治的最終目的是降低胃癌的發(fā)病率和死亡率，延長生命。由于目前對胃癌發(fā)生的復雜生物學過程和因素的理解尚不完全清楚，從根本上阻斷致癌因素作用控制胃癌的發(fā)生在短時期難以突破。因此采用早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是降低胃癌患者死亡率、提高生存率和生存質(zhì)量的重要途徑。目前，胃鏡是診斷胃癌的有效方法，但因其屬侵入性檢查，人群接受度較低，且費用較高，難以進行大規(guī)模普查。因此，急切需要開發(fā)一種可應用于胃癌早期篩查的簡單可靠、無創(chuàng)或微創(chuàng)的大通量檢查方法。多項研究表明，Dickkopf相關(guān)蛋白1（DKK1）在健康人群體內(nèi)呈低表達，在肺癌、宮頸癌、肝癌、胰腺癌和胃癌等多種腫瘤患者中呈高表達，提示其可能作為一種潛在的腫瘤篩查標志物[2-6]。本研究探討DKK1在胃癌患者和非胃癌者血清中的差異，并探索其與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為評估其能否作為胃癌血清學篩查指標提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年8月—2014年10月于中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院就診、年齡范圍40～69歲、經(jīng)內(nèi)鏡檢查及組織病理確診為胃癌的患者170例，作為胃癌組。對照組來自同期本院體檢科接受上消化道內(nèi)鏡檢查且未診斷患胃癌者，且排除患有任何惡性腫瘤者，按照年齡（相差5歲以內(nèi)）與胃癌病例進行隨機1:1頻數(shù)匹配。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。所有研究對象的血液均為經(jīng)過臨床檢測之后的剩余血標本，分離出1.5 ml血清，放入凍存管中，-80℃保存?zhèn)溆?。采集血液時胃癌患者未經(jīng)過放化療或手術(shù)治療。

1.2 檢測方法

血清DKKl 檢測采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）。ELISA檢測系統(tǒng)為美國R&D Systems公司生產(chǎn)的DKK100試劑盒，嚴格按照說明書進行操作。將100 μl的標準液或血清樣品加入96孔酶標板中，室溫孵育2 h，洗板。每孔加入200 μl DKK1結(jié)合液，室溫孵育2 h，洗板。每孔加入200 μl的底物溶液，室溫下避光孵育30 min，顯色后加入50 μl的終止溶液并使用酶標儀檢測450 nm處的光密度（optical density,OD）值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SAS9.4進行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析。血清DKK1濃度資料呈偏態(tài)分布，以中位數(shù)（四分位數(shù)）[Μ（P25,P75）]表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。分類資料以n（%）表示，采用Pearsonχ2檢驗進行組間比較。血清DKK1濃度與胃癌患者的臨床病理指標間的相關(guān)性比較采用Wilcoxon秩和檢驗或Kruskal-Wallis秩和檢驗。計算血清DKK1診斷胃癌的敏感度和特異性，繪制受試者工作特征ROC曲線，通過計算約登指數(shù)（Youden index）獲取最佳診斷臨界值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組與對照組的基本特征及血清DKK1濃度分布情況

胃癌組男性119例（70.00%），中位年齡59歲，對照組男性80例（47.06%），中位年齡58歲。兩組在BΜI、吸煙和飲酒的分布上差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。胃癌組患者血清DKK1的中位表達水平[266.4（182.1,360.8）pg/ml]顯著高于對照組[97.9（36.0,145.1）pg/ml]（P＜0.0001），見表1。

表1 胃癌組與對照組的基本特征及血清DKK1表達水平Table 1 Basic characteristics and expression of serum DKK1 in gastric cancer (GC) group and control group

2.2 血清DKK1在胃癌患者中的診斷意義

根據(jù)DKK1在胃癌組和對照組血清中的檢測結(jié)果繪制ROC曲線，見圖1，曲線下面積為0.908（95%CI:0.878～0.938）。根據(jù)約登指數(shù)最大確定診斷胃癌的最佳截斷值為167.8 pg/ml。以DKK1濃度＞167.8 pg/ml為DKK1陽性，診斷胃癌的敏感度為80.59%（95%CI:76.64%～86.53%），特異性為84.71%（95%CI:79.30%～90.12%），陽性預測值為84.05%（95%CI:78.43%～89.67%），陰性預測值為81.36%（95%CI:75.62%～87.09%）。

2.3 血清DKK1與胃癌患者臨床病理指標的關(guān)系

血清DKK1與胃癌患者臨床病理指標的關(guān)系見表2。未發(fā)現(xiàn)血清DKK1濃度與胃癌患者的年齡、性別、民族、胃癌家族史、吸煙史、BΜI、飲酒史、腫瘤大小、肝臟轉(zhuǎn)移、血管浸潤和遠處轉(zhuǎn)移之間存在相關(guān)性（均P＞0.05），但與腫瘤TNΜ分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和嗜神經(jīng)侵襲明顯相關(guān)（均P＜0.05）。

表2 血清DKK1水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系 (Μ,P25-P75)Table 2 Relation between serum DKK1 level and clinicopathological characteristics of gastric cancer patients(Μ,P25-P75)

2.4 血清DKK1對胃癌患者臨床病理特征的診斷價值

經(jīng)ROC曲線分析，血清DKK1對胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、嗜神經(jīng)侵襲和TNΜ分期均具有一定的診斷意義（AUC=0.633、0.622、0.613、0.635）。根據(jù)約登指數(shù)，區(qū)分胃癌浸潤深度（T3+T4vs.T1+T2）、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否存在嗜神經(jīng)侵襲、TNΜ分期（Ⅲ+Ⅳvs.Ⅰ+Ⅱ）的最佳臨界值分別為265.7、240.4、198.2、265.7 pg/ml，見表3。

表3 血清DKK1對胃癌臨床病理特征的診斷價值Table 3 Diagnosis value of serum DKK1 on clinicopathological features of GC patients

3 討論

21世紀以來，我國胃癌的發(fā)病率和死亡率均有所下降，生存率有所提高，但仍遠低于日本與韓國等同樣胃癌高發(fā)的國家，2010—2014年我國胃癌年齡標化5年生存率為35.9%，日本為60.3%，韓國最高，達到了68.9%[7]。而日本與韓國生存率提高的重要原因之一在于其所開展的全國性胃癌篩查項目。我國人口眾多，目前還無法實現(xiàn)全民胃癌內(nèi)鏡普查，故通過胃癌的危險因素和一些標志物篩選高危人群進行內(nèi)鏡檢查是符合我國國情的篩查策略[8]。目前，已知的胃癌血清標志物有胃蛋白酶原（PG）、胃泌素-17（G-17）、幽門螺桿菌抗體（Hp-IgG）、癌胚抗原（CEA）、CA199、CA724、微小RNA和環(huán)狀RNA等，但尚沒有一種被證實可作為胃癌篩查可靠的標志物[9]。2019年早期胃癌篩查專家共識中提出了一種新型胃癌篩查評分系統(tǒng)，通過性別、年齡與傳統(tǒng)的血清學標志物PG、G-17和Hp-IgG五項指標濃縮高危人群行內(nèi)鏡精查，但其在真實世界人群中的篩查效果如何仍有待進一步研究評估[8]。故探索新的胃癌血清學標志物，對胃癌高危人群的篩選具有重要意義。

DKK1作為一種分泌蛋白，是有力的Wnt信號通路的拮抗劑[10]。Wnt信號通路為進化上非常保守的信號轉(zhuǎn)導途徑，在胚胎發(fā)育形成和維持成體組織的動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用，是調(diào)控細胞形態(tài)、生長、發(fā)育、增殖、遷移和分化的關(guān)鍵通路之一[11]。與正常干細胞一樣，腫瘤干細胞也利用Wnt信號通道，這些通道的失調(diào)可能會導致腫瘤發(fā)生[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，在正常胃腺和腸化生組織中，DKK1呈陰性或較低水平，而在胃癌細胞中通常呈中等或高度表達[6]。

本研究結(jié)果表明胃癌組血清DKK1的水平（266.4 pg/ml）顯著高于對照組（97.9 pg/ml）（P＜0.0001）。多項研究也表明胃癌患者血清DKK1水平高于對照人群，提示血清DKK1具有作為胃癌篩查標志物的潛能[6,13-16]。Lee等[6]對153例胃癌患者和173例健康對照者的血清DKK1進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清DKK1水平顯著高于健康對照者（P＜0.0001）。唐丹等[13]比較了胃癌組、胃良性疾病組和健康對照組的血清DKK1水平，結(jié)果顯示胃癌組＞胃良性疾病組＞健康對照組（P＜0.05），對胃癌具有較高的診斷價值（AUC=0.820）。Zhuang等[17]評估了90例胃癌患者、50例胃癌前疾病者與40例健康對照者的血清DKK1濃度，結(jié)果表明胃癌患者組血清DKK1濃度顯著高于胃癌前疾病組和健康對照組（P＜0.01）。魏禮清等[14]對78例胃癌患者及38例健康對照者血清DKK1濃度進行檢測，結(jié)果顯示胃癌組平均水平（51.62±38.43 μg/ml）顯著高于健康對照組（22.18±6.59 μg/ml），與本研究結(jié)果一致。而張小剛等[18]對34例胃癌患者和38例健康者血清DKK1檢測的結(jié)果顯示，胃癌患者血清中DKKl含量明顯低于健康者（P＜0.01）。這與以上研究結(jié)果完全相反，可能是由于該研究樣本量較小。

本研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤分期晚、浸潤深、存在神經(jīng)侵襲與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者血清DKK-1水平更高，提示血清DKK1水平與胃癌惡性程度相關(guān)，與已發(fā)表的研究結(jié)果一致[17,19-20]。Zhuang等[17]進一步研究發(fā)現(xiàn)血清DKK1水平與胃癌患者臨床分期、血管浸潤、浸潤深度有關(guān)。盧起飛等[20]納入132例胃癌患者、121例慢性胃炎患者及74例體檢健康者的研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清DKK-1水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期有關(guān)（P＜0.05），不過該研究還發(fā)現(xiàn)血清DKK-1水平與腫瘤直徑、肝臟轉(zhuǎn)移有關(guān)，而未發(fā)現(xiàn)與腫瘤分化程度、浸潤深度、血管轉(zhuǎn)移情況相關(guān)（P＞0.05）。本研究并未發(fā)現(xiàn)血清DKK-1水平與腫瘤直徑、肝臟轉(zhuǎn)移、血管浸潤有關(guān)（P＞0.05），考慮可能是發(fā)生肝臟轉(zhuǎn)移和血管浸潤的患者數(shù)較少或者受幽門螺桿菌感染、胃癌分型等混雜因素的影響，但仍需進一步研究驗證。

本研究的局限性在于：（1）DKK1是一種非特異性的腫瘤標志物，并不適合單獨用于胃癌篩查，而本研究僅分析了胃癌患者血清DKK1的表達水平，需結(jié)合PG、Hp-IgG等現(xiàn)有的胃癌血清標志物，進一步研究DKK1的加入是否可提高篩查的準確性；（2）本研究為一項單中心研究，未開展外部驗證；（3）本研究胃癌患者與非胃癌者的性別構(gòu)成存在差異，雖然按性別的分層分析顯示男女血清DKK1濃度的曲線下面積比較接近，但對研究結(jié)果仍可能存在影響。今后將進一步完善研究方案，選擇更具代表性的人群，以便更好地評估DKK1在胃癌篩查中的價值。

綜上所述，血清DKK1作為胃癌標志物具有一定的價值，應開展進一步研究，探討其在識別胃癌高危人群方面的作用。