干志強(qiáng)，熊雙鳳，鐘 镥2，3，，羅晴方2，3，，張 藝2，3，#（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)術(shù)傳承創(chuàng)新研究中心，成都 611137；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，成都 611137；.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，成都 611137）

本課題組前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鴨嘴花在各地藏醫(yī)院、制藥企業(yè)的實際使用中存在著基原復(fù)雜、多品種混用的現(xiàn)象[10]，且該藥現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（2005年版《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（第3冊）》）只有薄層鑒別和水分、浸出物檢查，沒有含量測定等內(nèi)容[11]；同時，通過查詢中國知網(wǎng)發(fā)現(xiàn)，其質(zhì)量評價的相關(guān)文獻(xiàn)較少。這使得其質(zhì)量難以得到有效控制，給制劑生產(chǎn)和臨床應(yīng)用造成了一定的安全隱患。本課題組前期以鴨嘴花為對象，依次開展了本草考證、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究等一系列工作[10，12]，得出了生物堿類成分較符合其藥性、藥效特點這一結(jié)論[13]，并進(jìn)一步對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了完善[14]。在此基礎(chǔ)上，本研究結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)報道[15]，選用鴨嘴花中含量相對較高且研究相對集中的藥效成分鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿作為指標(biāo)，建立高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）指紋圖譜并測定其含量，同時結(jié)合化學(xué)模式識別方法進(jìn)一步分析，以期能夠綜合、全面地評價鴨嘴花藥材的質(zhì)量，為有效控制其品質(zhì)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC-2030C 3D Plus 型HPLC儀（日本Shimadzu公司）、SB5200D型超聲清洗儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）、D2-8 型超純水制備儀（成都寶賽思科技有限公司）、BP121S 型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、AE224型電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

11 批鴨嘴花藥材采集或購買自我國西藏、四川、云南3個省份，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院張藝研究員鑒定為爵床科鴨嘴花屬植物鴨嘴花A.vasicaNees.的干燥枝和葉（具體來源信息見表1）；鴨嘴花堿對照品（批號Y-164-190701，純度＞98%）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；鴨嘴花酮堿對照品為本課題組前期分離所得（結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振氫譜、核磁共振碳譜確證，純度＞98%）[13]；甲醇為色譜醇，其余試劑均為分析純，水為超純水。

表1 11批鴨嘴花樣品的來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 以Thermo Hypersil GoldTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇為流動相A、0.1%磷酸溶液為流動相B 進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，5%A；10～30 min，5%A→15%A；30～47 min，15%A→25%A；47～92 min，25%A→30%A）；檢測波長為283 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取鴨嘴花藥材（編號S10）粉末（過四號篩，下同）0.5 g，置于25 mL錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率720 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷，稱定質(zhì)量，用相同溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 精密稱取鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿對照品適量，加50%甲醇，分別制成每1 mL含鴨嘴花堿0.809 mg、鴨嘴花酮堿0.746 mg 的單一儲備液。分別吸取上述儲備液1、0.5 mL，用50%甲醇定容于10 mL 量瓶中，得兩種成分質(zhì)量濃度分別為0.080 9、0.037 3 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.4 精密度試驗 精密稱取同一批樣品（編號S10）0.5 g，照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以鴨嘴花堿為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD分別為0.30%～2.18%、0.29%～2.96%（n＝6），說明方法精密度較好。

2.1.5 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品（編號S10）0.5 g，共6 份，照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，以鴨嘴花堿為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD 分別為0.21%～2.90%、0.46%～2.98%（n＝6），說明方法重復(fù)性較好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批樣品（編號S10）0.5 g，照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 時照“2.1.1”項下條件進(jìn)樣分析，以鴨嘴花堿為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD 分別為0.87%～2.56%、0.71%～2.75%（n＝6），說明樣品在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 指紋圖譜的建立 取11批鴨嘴花樣品，照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析。將所得各批次樣品的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》，以時間窗寬度0.1 min 為條件、S10（色譜響應(yīng)適中且采樣量大）圖譜為參照，采用平均數(shù)法，經(jīng)多點校正后生成指紋圖譜的共有模式[16]，得疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（R），結(jié)果見圖1。

圖1 11批鴨嘴花樣品的HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜

2.1.8 共有峰的指認(rèn) 綜合11批樣品的色譜信息，選擇分離度、穩(wěn)定性、重復(fù)性較好的色譜峰為共有峰，共標(biāo)定了23個共有峰。經(jīng)與混合對照品溶液的HPLC圖（圖2）比對，指認(rèn)了其中2個色譜峰，分別為鴨嘴花堿（2號峰）和鴨嘴花酮堿（4號峰）。因鴨嘴花堿的峰面積較大且分離度較好，故選其為參照峰。

圖2 混合對照品溶液的HPLC圖

2.1.9 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）》對11 批鴨嘴花樣品進(jìn)行相似度評價。結(jié)果顯示，與對照指紋圖譜（R）相比，所有樣品的相似度均不低于0.920，表明11 批鴨嘴花藥材的整體品質(zhì)較穩(wěn)定。結(jié)果見表2。

表2 11批鴨嘴花樣品的相似度評價結(jié)果

2.2 化學(xué)模式識別分析

2.2.1 聚類分析 將11 批鴨嘴花樣品指紋圖譜共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS 25 軟件進(jìn)行聚類分析，采用組間連接法，以平方歐氏距離為測度[17]，結(jié)果見圖3。由圖3 可知，當(dāng)距離為25 時，11 批鴨嘴花樣品被分為2 類，即S1～S8 為一類、S9～S11 為一類；當(dāng)距離為14 時，S9 與S10～S11被進(jìn)一步區(qū)分。上述結(jié)果表明，產(chǎn)自相同省份的鴨嘴花藥材成分普遍較為一致（西藏產(chǎn)的S1、S4，云南產(chǎn)的S2、S3、S5～S8，四川產(chǎn)的S10、S11），且產(chǎn)自西藏與云南的鴨嘴花藥材具有一定的相似性；但當(dāng)距離不同時，來源相同的鴨嘴花藥材品質(zhì)也可能存在差異（產(chǎn)自云南的S8和S9）。結(jié)合鴨嘴花的指紋圖譜可以看出，S8樣品中的11、13、16、17、20 號峰普遍高于其他批次鴨嘴花樣品，S9 樣品中的21 號峰與其他批次樣品存在明顯差異，這可能是造成這2批樣品區(qū)別于其他批次樣品的主要原因。

圖3 11批鴨嘴花樣品的聚類分析樹狀圖

2.2.2 主成分分析 為進(jìn)一步探討這11 批鴨嘴花樣品化學(xué)成分之間的差異，本研究應(yīng)用SIMCA 14.1 軟件對鴨嘴花指紋圖譜共有峰的峰面積進(jìn)行了主成分分析，結(jié)果得分矩陣圖的解釋率參數(shù)R2X為0.997，累計解釋能力參數(shù)Q2為0.723，以上參數(shù)均大于0.5，表明模型穩(wěn)定且預(yù)測準(zhǔn)確性較好[18]。由得分圖（圖4）可知，S9、S10～S11分別為一類，S1～S8被進(jìn)一步分為較為接近的2類（S1、S4為一類，S2～S3、S5～S8為一類），基本證實了聚類分析的結(jié)果。

圖4 11批鴨嘴花樣品的主成分分析得分圖

2.2.3 正交偏最小二乘法-判別分析 在“2.2.2”項下主成分分析的基礎(chǔ)上，本研究以共有峰峰面積為變量，采用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)一步對不同批次的鴨嘴花樣品進(jìn)行了正交偏最小二乘法-判別分析。在建立的正交偏最小二乘法-判別分析模型中，解釋率參數(shù)R2X為0.999，區(qū)分參數(shù)R2Y為0.983，累計解釋能力參數(shù)Q2為0.743，以上參數(shù)均大于0.5，表明模型穩(wěn)定且預(yù)測準(zhǔn)確性較好[18]。從得分圖（圖5）來看，11批鴨嘴花樣品可分為4類，呈現(xiàn)出與聚類分析和主成分分析類似的結(jié)果。

圖5 11 批鴨嘴花樣品的正交偏最小二乘法-判別分析得分圖

本研究進(jìn)一步以變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1.0為標(biāo)準(zhǔn)[19－20]，以11批樣品的共有峰峰面積為變量，篩選影響各批次樣品質(zhì)量的差異性成分。由各共有峰的VIP 值（圖6）可知，VIP值＞1.0的共有峰分別為2、16、21、17、1、13號峰，其對應(yīng)的成分可能是造成11 批鴨嘴花樣品質(zhì)量差異的主要原因，為差異性成分。

圖6 11批鴨嘴花樣品各共有峰的VIP圖

2.3 含量測定

采用HPLC 法測定鴨嘴花藥材中藥效成分鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿的含量。

2.3.1 色譜條件 以Thermo Hypersil GoldTMC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95，V/V）為流動相；檢測波長為283 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測時間為30 min。

2.3.2 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項。

2.3.3 混合對照品溶液的制備 同“2.1.3”項。

2.3.4 空白溶液的制備 取50%甲醇適量，作為空白溶液。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗 分別取“2.3.2”“2.3.3”“2.3.4”項下供試品溶液（編號S10）、混合對照品溶液、空白溶液，照“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。由所得色譜圖（圖7）可知，各待測成分色譜峰的分離度均不低于1.5，理論板數(shù)均不低于3 000，空白溶液對2種成分的測定無干擾。

圖7 混合對照品溶液、鴨嘴花供試品溶液和空白溶液的HPLC圖

2.3.6 線性關(guān)系考察 取“2.3.3”項下儲備液適量，加50%甲醇，制成鴨嘴花堿質(zhì)量濃度分別為0.020、0.040、0.080、0.161、0.323、0.647 mg/mL，鴨嘴花酮堿質(zhì)量濃度分別為0.009、0.018、0.037、0.074、0.149、0.298 mg/mL 的系列混合線性工作溶液，照“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測成分峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，得鴨嘴花堿回歸方程為Y＝3×107X+60 576（r＝0.999 5）、鴨嘴花酮堿回歸方程為Y＝1×107X－21 892（r＝0.999 1）。結(jié)果顯示，鴨嘴花堿在0.020～0.647 mg/mL、鴨嘴花酮堿在0.009～0.298 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.7 精密度試驗 取“2.3.2”項下供試品溶液（編號S10），照“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿峰面積的RSD 分別為0.72%、0.57%（n＝6），表明方法精密度較好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 精密稱取同一批樣品（編號S10）0.5 g，照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時照“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿峰面積的RSD 分別為0.98%、0.78%（n＝6），表明供試品在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.9 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品（編號S10）0.5 g，共6 份，照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各成分含量。結(jié)果顯示，鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿含量的RSD 分別為1.07%、0.71%（n＝6），說明方法重復(fù)性較好。

2.3.10 加樣回收率試驗 稱取已知含量的鴨嘴花樣品（編號S10），共6 份，分別按已知量的100%加入混合對照品溶液（按“2.3.3”項下方法制得）適量，照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。試驗結(jié)果（表3）顯示，鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿的平均加樣回收率分別為99.99%（RSD＝1.53%，n＝6）、99.06%（RSD＝1.83%，n＝6），說明方法準(zhǔn)確性較好。

表3 鴨嘴花堿和鴨嘴花酮堿的加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）

2.3.11 樣品含量測定 取11批鴨嘴花樣品粉末0.5 g，照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件平行進(jìn)樣測定2次，記錄峰面積并采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各成分含量。由檢測結(jié)果（表4）可知，11批鴨嘴花樣品中，鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿的含量分別為4.12～10.22、0.60～3.26 mg/g，提示不同產(chǎn)地鴨嘴花藥材中上述化學(xué)成分的含量差異較大。

表4 鴨嘴花藥材含量測定結(jié)果（n＝2，mg/g）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的確定

通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，藏藥鴨嘴花的現(xiàn)代藥理學(xué)研究報道較少，相關(guān)化合物的藥理學(xué)研究主要集中在抗炎、抗腫瘤、抗菌作用等方面，其中鴨嘴花堿和鴨嘴花酮堿被證實具有顯著的抗炎、抗菌活性[6]；同時，鴨嘴花堿被證實能夠有效地降低血壓，而鴨嘴花酮堿具有較強(qiáng)的抗過敏作用[21]，與藏藥鴨嘴花的傳統(tǒng)功效相符。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鴨嘴花的化學(xué)成分以生物堿類成分為主，此類成分最能體現(xiàn)其“苦味”藥性，其中鴨嘴花堿被預(yù)測為鴨嘴花治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的潛在標(biāo)志物，且該成分與鴨嘴花酮堿均在鴨嘴花中具有相對較高的含量[13]，故本研究選擇鴨嘴花堿、鴨嘴花酮堿作為藏藥鴨嘴花的質(zhì)量評價指標(biāo)成分。

3.2 色譜條件的確定

本課題組前期對色譜條件進(jìn)行了系統(tǒng)考察，通過全波長掃描確定了檢測波長，并對比了不同流動相體系（甲醇-水，乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）等條件的分離效果，最終確定了適用于鴨嘴花指紋圖譜分析和含量測定的最優(yōu)色譜條件，并通過方法學(xué)考察驗證了上述方法的可行性。

3.3 指紋圖譜及化學(xué)模式識別分析

本研究從整體性的角度出發(fā)，采用HPLC 指紋圖譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)模式識別分析方法對不同來源的11 批鴨嘴花樣品進(jìn)行評價，結(jié)果表明，11 批不同產(chǎn)地的鴨嘴花樣品呈現(xiàn)出較好的相似性。通過建立HPLC指紋圖譜、對比混合對照品圖譜，共確定了23個穩(wěn)定性、分離度皆好的共有峰。通過聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法-判別分析發(fā)現(xiàn)，這11 批鴨嘴花樣品均可得以明顯區(qū)分。相似的結(jié)果提示，上述3種分析方法均可有效區(qū)分不同產(chǎn)地的鴨嘴花藥材。其中，云南產(chǎn)鴨嘴花與西藏產(chǎn)鴨嘴花樣品的品質(zhì)較為接近，而四川產(chǎn)鴨嘴花與云南、西藏產(chǎn)鴨嘴花樣品則有所區(qū)別；同時，化學(xué)模式識別分析結(jié)果還提示，產(chǎn)自同一省份的樣品并不完全一致，如同產(chǎn)于云南的S9 樣品與S2～S3、S5～S8 樣品之間存在一定的差異。

從指紋圖譜結(jié)果可知，鴨嘴花S9 樣品中21 號峰對應(yīng)成分的含量明顯高于其他產(chǎn)地的鴨嘴花樣品。通過VIP值分析結(jié)果可以看出，21號峰對11批鴨嘴花樣品間的差異有較大的貢獻(xiàn)，結(jié)合以上信息可推測21號峰對應(yīng)成分可能是造成鴨嘴花S9樣品異于其他云南產(chǎn)鴨嘴花樣品的原因。然而，導(dǎo)致鴨嘴花S9 樣品中21 號峰對應(yīng)成分含量較高的原因可能為該地地理環(huán)境特殊，也可能由取樣誤差所致，具體原因尚有待進(jìn)一步研究。

為進(jìn)一步探索造成不同樣品間差異的原因，本研究以VIP值＞1.0為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到了6個色譜峰，即2、16、21、17、1、13號峰，提示其對應(yīng)的6個成分為影響鴨嘴花質(zhì)量的差異性成分。通過比對混合對照品溶液的HPLC圖發(fā)現(xiàn)，2號峰為鴨嘴花堿。定量分析結(jié)果顯示，該成分與另一含量相對較高的鴨嘴花酮堿（4號峰）的含量分別為4.12～10.22、0.60～3.26 mg/g，該結(jié)果表明不同產(chǎn)地的鴨嘴花樣品中上述2種成分的含量存在明顯差異，此差異是否會影響其藥效仍有待進(jìn)一步實驗證實。從定量結(jié)果來看，云南產(chǎn)鴨嘴花樣品中鴨嘴花堿的含量普遍高于四川產(chǎn)鴨嘴花樣品，但與西藏產(chǎn)鴨嘴花樣品相近，提示即使鴨嘴花堿對造成不同樣品間差異的貢獻(xiàn)較大，但僅憑單一成分評價藥材品質(zhì)具有一定的局限性，有待后續(xù)研究進(jìn)一步完善。

4 結(jié)語

藏藥鴨嘴花現(xiàn)有文獻(xiàn)中關(guān)于質(zhì)量評價方法的研究較少，難以有效為其質(zhì)量控制提供參考。本研究通過指紋圖譜技術(shù)確定了11批藏藥鴨嘴花藥材中的23個共有峰，并結(jié)合化學(xué)模式識別分析有效地區(qū)分了不同產(chǎn)地的鴨嘴花樣品，直觀地反映了不同產(chǎn)地鴨嘴花藥材的相似性與差異性；進(jìn)一步通過VIP值篩選出了造成樣品間質(zhì)量差異的主要成分，為其質(zhì)量控制提供了參考，也為其后續(xù)研究提供了方向。本研究的不足之處在于樣品收集的數(shù)量有限且未能通過已有文獻(xiàn)鑒定出更多的未知成分。在后續(xù)研究中，本課題組將深入開展鴨嘴花藥材的化學(xué)成分研究，重點關(guān)注16、21、17、1、13 號峰對應(yīng)成分的具體結(jié)構(gòu)，并結(jié)合藥效學(xué)實驗進(jìn)一步探究這些成分成為鴨嘴花藥材質(zhì)量標(biāo)志物的可能性。