曲亮璠，郝景雯，謝慶方，黃 華，許勤虎，王祥河

(1. 天津市工業(yè)微生物研究所有限公司 天津 300462；2. 天津量信檢驗(yàn)認(rèn)證技術(shù)有限公司 天津 300462；3. 天津?qū)嵃l(fā)中科百奧工業(yè)生物技術(shù)有限公司 天津 300462；4. 天津市工業(yè)微生物企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300462；5. 天津市工業(yè)微生物工程技術(shù)中心 天津 300462)

黑米是我國著名珍貴稻種，資源廣泛，歷史悠久，極具特色。明代李時(shí)珍在《本草綱目》中記載，黑米具有“滋陰補(bǔ)腎、健脾暖肝、明目活血”等功效。黑米中蛋白質(zhì)含量比普通白米高出 25%，VA、VB、VC、鋅、鐵、鈣、磷、銅、錳等維生素和礦物元素也十分豐富[1-2]。除此之外，黑米的皮層中還含有很多高效的功能性物質(zhì)，如皂苷、生物堿、甾醇、多酚、黃酮、花青素等，能夠起到抗炎、抗過敏、抗氧化、改善微循環(huán)、提高機(jī)體免疫功能、清除自由基、改變體內(nèi)酶活性和預(yù)防衰老的作用[3-5]。

目前深加工及高附加值谷物產(chǎn)品的開發(fā)尚處于起步階段，谷物經(jīng)糊化、液化、糖化、滅酶、冷卻后添加乳酸菌、酵母菌、醋酸菌等食用真菌進(jìn)行單一或復(fù)合發(fā)酵，再經(jīng)調(diào)配可制備具有創(chuàng)新特色谷物發(fā)酵飲料，市場前景良好[6-8]。酶法糖化黑米的反應(yīng)過程環(huán)境友好，副反應(yīng)少，反應(yīng)條件較為溫和。辛泓均[9]以葡萄糖當(dāng)量(DE)為指標(biāo)優(yōu)化小米糖化酶解工藝制備小米低醇飲料，得到的最佳酶解參數(shù)為酶解溫度50℃、酶解時(shí)間 60min、加酶量 184U/g，此時(shí) DE值為 63.3%。李偉等[10]以 DE值為指標(biāo)，通過正交優(yōu)化試驗(yàn)確定了富硒發(fā)芽糙米的最適反應(yīng)條件為酶添加量35μg/mL、酶解反應(yīng)時(shí)長60min、反應(yīng)溫度85℃。衛(wèi)曉英等[11]優(yōu)化了薏米水解工藝，即在溫度 50℃、pH6.0、α-淀粉酶添加量 200U/g條件下水解 3h，還原糖的含量最高為1.73%。

本實(shí)驗(yàn)采用雙酶法對黑米進(jìn)行了酶解處理，以還原糖為指標(biāo)優(yōu)化了黑米糖化工藝，后續(xù)可通過生物技術(shù)研發(fā)谷物類發(fā)酵飲料，為黑米的綜合利用及其產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：市售黑米。

試劑：葡萄糖淀粉酶(酶活力≥200000U/g)；α-淀粉酶(酶活力≥20000U/g)；硫酸銅、亞甲藍(lán)、酒石酸鉀鈉、乙酸鋅、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、冰乙酸、鹽酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

METTLER AE200分析天平；德國米技米技爐；METTLER Seven Multi pH計(jì)；上海博迅 GZX-9146MBE數(shù)字鼓風(fēng)干燥箱；上海滬西定時(shí)恒溫磁力攪拌器90-2型；力辰恒溫水浴鍋HH-8。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

黑米→清洗→烘干→粉碎→過篩→糊化→糖化→滅酶。

黑米清洗3次后于70℃下烘干、粉碎，過40目細(xì)篩，去除大顆粒物。將黑米細(xì)粉與蒸餾水按照質(zhì)量比 1∶15的比例90℃糊化20min，調(diào)節(jié)溫度和 pH，添加 α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶進(jìn)行糖化，100℃煮沸3min滅酶。

1.3.2 還原糖含量測定方法

參照 GB 5009.7—2016中直接滴定法測定黑米糖化液中還原糖的含量[12]。

1.3.3 酶解反應(yīng)單因素實(shí)驗(yàn)

黑米糊化后，分別調(diào)節(jié)酶制劑添加量(0.2%、0.4% 、0.6% 、0.8%、1.0%)、酶解 pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5)、葡萄糖淀粉酶與 α-淀粉酶比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)、酶解時(shí)間(1、2、3、4h)、酶解溫度(50、55、60、65℃)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，測定酶解液中還原糖含量，篩選較優(yōu)反應(yīng)條件。

1.3.4 酶解工藝正交實(shí)驗(yàn)

在上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以酶解液中的還原糖為指標(biāo)，采用四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝，正交因素與水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Tab.1 Orthogonal experimental factors and horizontal design

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 酶制劑添加量優(yōu)化

酶制劑添加量對黑米糖化液中還原糖含量的影響如圖 1所示。當(dāng)葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶總添加量從0.2%增加至1.0%時(shí)，酶解液中還原糖含量分別為 2.15、3.91、4.06、4.18、4.23g/100g，呈上升趨勢。當(dāng)酶制劑添加量超過0.6%時(shí)，還原糖上升趨勢漸緩，最終接近平衡。此時(shí)底物含量成為反應(yīng)過程中的決定性因素，持續(xù)增加酶添加量不能明顯提升酶促反應(yīng)效果。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果和經(jīng)濟(jì)因素，將反應(yīng)酶制劑的較適宜添加量定為0.6%。

2.2 酶解時(shí)間優(yōu)化

酶解時(shí)間對黑米糖化液中還原糖含量的影響如圖 2所示。當(dāng)葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶的作用時(shí)間從 1h延長至 4h，黑米糖化液中的還原糖的含量分別為 2.64、4.08、4.11、4.16g/100g。在反應(yīng)初始時(shí)期，隨著底物與葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶相互作用時(shí)間的延長，水解程度不斷提高，酶解持續(xù)進(jìn)行 2h以后目標(biāo)產(chǎn)物濃度的變化不再明顯。這可能是由于在黑米糖化反應(yīng)初期體系中淀粉含量較高，底物與酶活性位點(diǎn)可以充分結(jié)合；在反應(yīng)后期隨著液化酶、糖化酶酶活下降，以及受到已生成的葡萄糖底物濃度抑制等因素的影響，黑米糖化液中還原糖的含量不再有明顯的變化[13]。因此，將酶解反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)定為2h。

圖2 酶解時(shí)間對黑米糖化液中還原糖含量的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on reducing sugar content in black rice saccharification soluion

2.3 葡萄糖淀粉酶與α-淀粉酶添加比例優(yōu)化

葡萄糖淀粉酶與 α-淀粉酶添加比例對黑米糖化液中還原糖含量的影響如圖3所示。在黑米的酶解過程中，黑米淀粉受到了內(nèi)切型 α-淀粉酶和外切型葡萄糖淀粉酶的作用。由于 2種淀粉酶的作用及功能特性并不相同，故二者的添加比例對底物的酶解速度有很大影響。葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶比例分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，還原糖含量分別為3.43、4.15、4.01、3.65、3.22g/100g。α-淀粉酶為液化酶，可與黑米淀粉分子中的 α-1，4-糖苷鍵隨機(jī)結(jié)合，并產(chǎn)生同樣數(shù)量的還原端和非還原端。葡萄糖淀粉酶為糖化酶，只能與黑米淀粉分子的非還原尾端結(jié)合，并對其進(jìn)行剪切。α-淀粉酶的水解作用可增加葡萄糖淀粉酶底物的摩爾濃度，二者有協(xié)同作用。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，2種淀粉酶水解黑米的較適宜添加比例為 2∶1。

圖3 葡萄糖淀粉酶與α-淀粉酶添加比例對黑米糖化液中還原糖含量的影響Fig.3 Effect of glucoamylase and α-amylase addition ratio on reducing sugar content in black rice saccharification solution

2.4 酶解溫度優(yōu)化

酶解溫度對黑米糖化液中還原糖含量的影響如圖 4所示，在 45～65℃范圍內(nèi)，還原糖含量分別為2.49、3.65、3.93、4.09、3.83g/100g，目標(biāo)產(chǎn)物的生成量隨著反應(yīng)體系溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在反應(yīng)過程中，淀粉酶的特殊靶向位點(diǎn)與目標(biāo)底物相結(jié)合。提高反應(yīng)溫度，酶解速度會(huì)逐漸加快，但酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度將改變蛋白質(zhì)分子的多維空間構(gòu)象，并影響其結(jié)合位點(diǎn)的活性高低。反應(yīng)溫度過高會(huì)導(dǎo)致葡萄糖淀粉酶與α-淀粉酶的穩(wěn)定性降低，會(huì)逐步使酶分子變性，進(jìn)而影響酶和目標(biāo)物的有效結(jié)合，最終使酶解反應(yīng)效率下降。因此，黑米酶解的較適宜溫度定為60℃。

圖4 酶解溫度對黑米糖化液中還原糖含量的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on reducing sugar content in black rice saccharification solution

2.5 酶解pH優(yōu)化

酶解 pH對黑米糖化液中還原糖含量的影響如圖 5 所示，當(dāng)酶解 pH 分別為 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5時(shí)，酶解液中還原糖的含量分別為 3.19、4.15、3.91、3.88、3.86g/100g，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。pH 影響酶分子的構(gòu)象、催化基團(tuán)中質(zhì)子供體或質(zhì)子受體所需的離子化狀態(tài)和活性中心上必需基團(tuán)的解離程度[14]。在糖化過程中需要控制反應(yīng)體系的 pH 值，使2種淀粉酶活性中心表現(xiàn)出最大催化活力，進(jìn)而提高酶促反應(yīng)效率，縮短酶解時(shí)長。因此，將黑米糖化反應(yīng)的初始pH值定為4.0。

圖5 酶解pH對黑米糖化液中還原糖含量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH on reducing sugar content in black rice saccharification solution

2.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 實(shí)驗(yàn)因素與水平

根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對黑米酶解過程中還原糖含量影響較大的溫度、pH、酶添加量這3個(gè)因素，以酶解液中的還原糖含量為指標(biāo)進(jìn)行L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表 2，方差分析結(jié)果見表3。

2.6.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表 2、表 3可知，溫度和 pH因素對黑米糖化反應(yīng)過程中的還原糖含量有顯著性影響，各因素極差值分別為0.340、0.490、0.194，3個(gè)因素對其響應(yīng)值的影響主次順序?yàn)閜H〉溫度〉酶添加量。因素A溫度以 A2水平最適，因素 B pH以 B2水平最適，因素 C酶添加量以 C3水平最適。因此，最佳發(fā)酵條件為溫度60℃、pH 4.0、酶添加量0.8%。

表2 實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Experimental scheme and experimental results

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.3 Results of ANOVA of orthogonal experiments

3 結(jié) 論

葡萄糖淀粉酶和 α-淀粉酶可協(xié)同水解黑米中的淀粉進(jìn)行糖化。通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酶解工藝，其中溫度因素、pH因素對黑米糖化過程中的還原糖含量有顯著性影響，得到的最佳條件為酶制劑總添加量0.8%、pH4.0、反應(yīng)溫度 60℃，此時(shí)酶解液中還原糖含量為4.29g/100g。