高紫云, 宋洪川, 徐武美, 郭嘉航,李思民, 黃晶心, 官會林, 孫世中

(云南師范大學 能源與環(huán)境工程學院，高原特色中藥材種植土壤質量演變退化與修復云南省野外科學觀測研究站，云南省農村能源工程重點實驗室,云南 昆明 650500)

土壤鹽漬化是制約農業(yè)發(fā)展的重要因素之一，不僅嚴重干擾植物正常的生長發(fā)育進程，同時對區(qū)域內植物地理分布產生了巨大的不利影響.調查顯示，在全球范圍內，鹽漬化的土地面積約有9.5×108hm2,而僅我國就已有9×107hm2的土地遭到了鹽漬化的嚴重侵襲[1]；且隨著全球氣候的變化以及近年來諸多不當的農業(yè)耕作及灌溉措施的施行，預計未來土壤鹽漬化的問題將會持續(xù)加重，鹽漬化的土地面積也將進一步擴大[2].

鹽堿脅迫作為影響作物生長發(fā)育的重要的非生物脅迫之一，通過形成的滲透脅迫和離子脅迫干擾植株內部的物質合成及外部的形態(tài)構建[3]；種子萌發(fā)期是植株整個生命進程中最復雜也是最關鍵的時期，此時植株對外界鹽堿環(huán)境的變化最為敏感，反應也最為明顯和強烈[4].因此，植株對某種鹽堿環(huán)境的耐受能力能夠從種子萌發(fā)階段時的萌發(fā)表現以及胚芽的生長特征上得以體現[5].

甘遂是我國獨有的一種藥用草本作物，廣泛分布于我國陜西、山西、甘肅及河南等地，甘遂入藥具有利尿、引產、瀉下及消腫等顯著效用[6]，因其優(yōu)秀的逐水特性，在醫(yī)藥界享有“瀉水圣藥”的美譽[7-8].

目前，國內醫(yī)藥行業(yè)對甘遂的需求量激增，但由于室內種植甘遂生長緩慢且產量不佳，甘遂的栽培和生產還是以野外自然條件下種植為主[9]，但山西、陜西和河南等甘遂主產區(qū)日益加重的土壤鹽漬化極大地制約了甘遂的產出并影響了藥材品質[10].且甘遂在鹽脅迫環(huán)境下的萌發(fā)特性尚未有前人進行系統性的研究探討，因此此次試驗采用方差分析以及擬合回歸線的方法，通過使用不同濃度的NaCl、Na2SO4及NaHCO3溶液對甘遂種子進行鹽脅迫處理，觀察并分析在三種不同鹽脅迫環(huán)境下甘遂種子的萌發(fā)表現和響應特征，進而總結甘遂種子的耐受機制和抑制其萌發(fā)的鹽溶液濃度范圍，旨在為甘遂的土壤選擇、科學栽培以及耐鹽品種選育提供一定的理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

甘遂種子購自山西運城四季藥材種苗站，所用鈉鹽為分析純NaCl、Na2SO4及NaHCO3.挑選顆粒飽滿、大小一致且無病蟲害的甘遂種子3 000粒，使用1%次氯酸鈉溶液充分浸泡20 min后，再用無菌蒸餾水沖洗干凈，最后使用無菌濾紙吸干種子表面水分，靜置備用.

1.2 試驗方法

分別設置0、50、100、150、200、250 mmol·L-1和300 mmol·L-1的NaCl(pH 7.0)、Na2SO4(pH 7.0)和NaHCO3(pH 8.3)溶液[11-12].種子萌發(fā)采用培養(yǎng)皿濾紙芽床法，即在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中鋪設兩層定性濾紙，每個培養(yǎng)皿中均勻放置50粒備用的種子，并分別倒入5 mL對應濃度的鹽溶液，每個處理設6組重復.將培養(yǎng)皿加蓋后放置入25 ℃且相對濕度為60%～70%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，利用稱重法每天補充蒸發(fā)掉的水分，保證各個處理組中對應鹽溶液濃度不變，每天定時統計當日種子萌發(fā)數量，以胚芽露出種皮1 mm為萌發(fā)標準，以第4天作為萌發(fā)高峰計算發(fā)芽勢；待種子萌發(fā)全部停止時，將全部未萌發(fā)的種子用蒸餾水洗凈，放入蒸餾水中復水，每天定時統計復水后各處理組種子的新增萌發(fā)數.經前期甘遂種子萌發(fā)預實驗可知，12 d內種子萌發(fā)過程已全部結束，故在此次試驗中取12 d作為萌發(fā)試驗總時長.

1.3 指標測定方法

種子的發(fā)芽率=(萌發(fā)數量/供試數量)×100%;

種子的發(fā)芽勢=(從開始至發(fā)芽高峰的萌發(fā)數量/供試數)×100%;

發(fā)芽指數=∑(GT/DT),

式中,DT為萌發(fā)相應天數，GT為相應天數種子的發(fā)芽數;

活力指數=發(fā)芽指數×平均每皿總胚芽長[13-14];

相對發(fā)芽率=(處理組發(fā)芽率/對照組發(fā)芽率)×100%;

相對鹽害率=(對照組發(fā)芽率-處理組發(fā)芽率)/對照組發(fā)芽率×100%；

萌發(fā)恢復率=[(A-B)/(C-B)]×100%，

式中，A為全部時間的發(fā)芽種子數,B為鹽溶液中的發(fā)芽種子數，C為該處理全部種子數；

終萌發(fā)率=(脅迫下萌發(fā)的種子數+復水后萌發(fā)的種子數)/供試種子數×100%；

將種子相對發(fā)芽率與相應的鹽溶液濃度建立回歸關系，耐鹽適宜濃度、耐鹽半致死濃度和耐鹽極限濃度分別為相對發(fā)芽率為75%、50%和25%時對應的鹽溶液濃度.

1.4 數據分析與處理

使用Microsoft Excel 2019軟件整理試驗數據并繪制圖表,使用IBM SPSS Statistics 25軟件對數據進行可重復雙因素方差分析與單因素ANOVA檢驗，并進行顯著差異檢驗(P<0.05).

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對甘遂種子萌發(fā)動態(tài)的影響

由表1可以得出，各NaCl濃度處理下甘遂種子萌發(fā)率隨時間延長穩(wěn)步提升，總體而言，同一時間段內，甘遂種子萌發(fā)率隨NaCl濃度升高而降低，150～300 mmol·L-1NaCl脅迫下甘遂種子萌發(fā)率在任何時間段均顯著低于對照(P<0.05)；另外，當NaCl濃度達到200 mmol·L-1時，開始萌發(fā)時間較對照組推遲了1 d，濃度為250 mmol·L-1及300 mmol·L-1時，萌發(fā)開始時間均推遲了2 d.

可重復雙因素方差分析表明，處理時間和NaCl濃度以及兩者交互作用均能夠對甘遂種子發(fā)芽率產生極其顯著的影響(P< 0.01).

表1 NaCl處理對甘遂種子萌發(fā)動態(tài)影響

同行不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著；**表示在0.01水平差異顯著，*表示在0.05水平差異顯著，ns 表示無顯著性差異，下同.

如表2所示，經不同濃度Na2SO4處理下的各組，第1～4天內，300 mmol·L-1Na2SO4處理組萌發(fā)率顯著低于對照組(P< 0.05)；第5～12天內，隨Na2SO4濃度升高，甘遂種子萌發(fā)率呈先升高后降低的趨勢.

可重復雙因素方差分析表明，處理時間和Na2SO4濃度均能夠對甘遂種子發(fā)芽率產生極其顯著的影響(P< 0.01),處理時間和Na2SO4濃度交互作用對甘遂種子發(fā)芽率無顯著性影響.

表2 Na2SO4處理對甘遂種子萌發(fā)動態(tài)影響

如表3所示，經不同濃度NaHCO3處理下的各組，總體而言，在同一時間段內，萌發(fā)率隨NaHCO3濃度的升高而降低；當NaHCO3濃度達到250 mmol·L-1時，種子開始發(fā)芽時間推遲了1 d，當鹽分濃度達到300 mmol·L-1時，種子開始萌發(fā)時間推遲了2 d，且250 mmol·L-1和300 mmol·L-1NaHCO3處理組萌發(fā)率在任何時間段均顯著低于對照組(P<0.05).

可重復雙因素方差分析表明，處理時間和NaHCO3濃度以及兩者交互作用均能夠對甘遂種子發(fā)芽率產生極其顯著的影響(P<0.01).

表3 NaHCO3處理對甘遂種子萌發(fā)動態(tài)影響

2.2 鹽脅迫對甘遂種子相關萌發(fā)指標的影響

由表4可知，經不同濃度的NaCl溶液和NaHCO3溶液處理后的甘遂種子各發(fā)芽指標均呈現隨濃度升高而不斷降低的趨勢，當鹽溶液濃度達到300 mmol·L-1時，NaCl處理組和NaHCO3處理組發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數以及活力指數均達到最低，顯著低于對照組(P<0.05).而Na2SO4鹽溶液處理組發(fā)芽率與發(fā)芽指數均呈現隨鹽溶液濃度先升高后降低的趨勢，其中發(fā)芽率在200 mmol·L-1時達到頂峰，比對照組高25.89%，發(fā)芽指數在150 mmol·L-1時達到頂峰，比對照組高4.91%;發(fā)芽勢總體呈現先下降，后升高，又下降的變化趨勢，在濃度為200 mmol·L-1時與對照組持平;活力指數隨Na2SO4濃度的升高不斷下降，到300 mmol·L-1時，活力指數達到最低，僅為對照組的10.23%.由此可見，甘遂種子對Na2SO4的耐受性強于NaCl和NaHCO3，并且低濃度的Na2SO4在一定程度上可以促進種子的萌發(fā)，但又僅限于促進種子萌動與破殼，鹽溶液的刺激依然會導致種子整體生活力的下降.

可重復雙因素方差分析表明，鹽溶液種類、鹽溶液濃度以及鹽溶液種類和濃度的交互作用均能夠對甘遂種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數和活力指數產生極其顯著的影響(P<0.01) .

2.3 復水對甘遂種子恢復萌發(fā)的影響

由圖1-3可見，NaCl鹽溶液處理組種子復水后，最終萌發(fā)率較復水前萌發(fā)率均有不同程度的增長，且隨著鹽溶液濃度的逐漸升高呈現先增高后降低的趨勢，當鹽溶液濃度達到100 mmol·L-1時，最終萌發(fā)率達到頂峰，比對照組高11.10%(P<0.05).萌發(fā)恢復率整體呈現先升高后下降的趨勢，且在NaCl濃度為150 mmol·L-1時達到最高；Na2SO4鹽溶液處理組復水后，復水后萌發(fā)恢復率與最終萌發(fā)率均隨濃度的升高先升高而后降低，且前者在不同濃度鹽溶液處理組間差異不顯著，后者在鹽溶液濃度為50～250 mmol·L-1時顯著高于對照組(P<0.05)，當濃度達到200 mmol·L-1時，最終萌發(fā)率達到頂峰，比對照組高44.44%.NaHCO3溶液處理組復水后，最終萌發(fā)率與復水后萌發(fā)恢復率均在鹽溶液濃度為50 mmol·L-1時顯著升高隨后不斷降低，50 mmol·L-1時最終萌發(fā)率比對照高7.44%(P<0.05).

圖1 甘遂種子在NaCl脅迫下的發(fā)芽率、萌發(fā)恢復率和最終發(fā)芽率

圖2 甘遂種子在Na2SO4脅迫下的發(fā)芽率、萌發(fā)恢復率和最終發(fā)芽率

2.4 甘遂種子對不同鹽脅迫的耐受性

由表5可知，處理組種子萌發(fā)進程受到的鹽分傷害隨鹽濃度的升高而愈發(fā)劇烈，而相同鹽溶液濃度下，Na2SO4處理組相對鹽害率顯著低于其余兩種鹽溶液處理組，且在50～250 mmol·L-1濃度區(qū)間內，相對鹽害率與對照組無顯著性差異(P<0.05).NaCl處理組與NaHCO3處理組相比，除100 mmol·L-1處理組外，在相同鹽濃度下，NaCl處理組相對鹽害率顯著高于NaHCO3處理組(P<0.05).由此可見，甘遂種子對Na2SO4的耐受性最好，對NaCl耐受性最差，三種鹽對甘遂種子萌發(fā)進程的抑制作用從強到弱順序依次為NaCl>NaHCO3>Na2SO4.

可重復雙因素方差分析表明，鹽溶液種類、鹽溶液濃度以及鹽溶液種類和濃度的交互作用均能夠對種子相對鹽害率產生極其顯著的影響(P< 0.01).

如表6所示，依據鹽濃度與發(fā)芽率之間的顯著相關性建立兩者間的回歸直線方程式.由表中公式可知，甘遂種子對NaCl、Na2SO4及NaHCO3的耐鹽適宜濃度分別為109.00、318.00 mmol·L-1和140.00 mmol·L-1，半致死濃度分別為221.50、396.57 mmol·L-1和277.50 mmol·L-1，臨界濃度分別為334.00、446.57 mmol·L-1和365.00 mmol·L-1.

表6 甘遂種子發(fā)芽率與鹽分濃度回歸分析結果

3 討論

種子萌發(fā)期是植物整個生命周期中對外界環(huán)境刺激響應最為強烈和脆弱的時期[15].種子萌發(fā)期對不同鹽的應激表現往往最能夠反映出此種植物對該鹽的耐受性[16].而鹽分對種子萌發(fā)的影響往往和鹽的種類、濃度以及種子類型，甚至同一種種子的采收年份有密切關聯[17].鹽脅迫對種子萌發(fā)的影響一般通過滲透調節(jié)和離子毒害作用實現，前者一般通過改變細胞內外溶液環(huán)境的滲透壓來抑制細胞對水分的汲取和利用，進而干擾細胞的正常生命活動；后者一般是無機鹽離子進入細胞，影響細胞膜結構的滲透調節(jié)，進一步紊亂細胞內部的代謝活動，使得呼吸作用無法正常進行[18].

研究使用不同濃度的NaCl、Na2SO4和NaHCO3對甘遂種子萌發(fā)階段進行脅迫，結果表明，不同濃度的NaCl和NaHCO3均會對甘遂種子的萌發(fā)產生抑制作用，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數以及萌發(fā)指數均呈下降趨勢，并且隨鹽溶液濃度的升高，抑制作用逐漸加強.說明NaCl和NaHCO3能夠通過滲透脅迫和離子毒害作用抑制甘遂種子的萌發(fā)潛力和發(fā)芽整齊度，推遲發(fā)芽高峰和開始萌發(fā)的時間，影響種子生長和物質積累.而Na2SO4處理組在低濃度條件下表現出對種子萌發(fā)的促進，高濃度才表現出抑制，這與朱毅等[12]的研究結果一致.這可能是由于甘遂種子對Na2SO4的耐受性強，低濃度的Na2SO4溶液作用下，部分鈉離子進入細胞內，使得細胞內滲透壓升高，細胞吸水能力提升，促進了細胞內部代謝反應的進行；也可能是微量的鈉離子激活了細胞中相關呼吸酶，進而促進了細胞內營養(yǎng)物質的轉化和利用的緣故[19].

值得注意的是，NaHCO3處理組活力指數顯著低于同等濃度下的NaCl和Na2SO4處理組，表明NaHCO3能夠顯著的抑制種子胚芽的伸長和生長，并且抑制作用顯著強于同濃度的NaCl和Na2SO4，此種結果應該由于NaHCO3作為一種堿性鹽(pH 8.3)，不僅通過滲透作用和離子毒害對種子萌發(fā)產生負面影響，而且還造成了過高pH的不良環(huán)境[20]，堿性環(huán)境下，細胞的結構和功能遭到進一步破壞，離子平衡被打破，細胞為了維持正常的生命活動不得已需要消耗更多的物質和能量去對抗pH過高產生的逆環(huán)境，進而抑制了胚芽的生長進程[21].因此,在對種植了甘遂的土壤進行澆灌時應注意避免堿性水源，以規(guī)避過高pH對甘遂生長發(fā)育所產生的不良影響.

對不同處理組種子復水試驗后的數據進行分析，可以看出脫離鹽脅迫環(huán)境后，低濃度的鹽溶液處理組最終萌發(fā)率與對照組有顯著性差異(P<0.05)，100 mmol·L-1NaCl、50 ～250 mmol·L-1Na2SO4和50 mmol·L-1NaHCO3處理組最終萌發(fā)率顯著高于對照組，說明低濃度的鹽溶液主要通過滲透脅迫使得種子吸水困難來暫時抑制種子萌發(fā)，并未破壞種子內部的生理結構和膜系統，在外界滲透環(huán)境回復到正常水平后，種子細胞仍然能保持正常的萌發(fā)能力,這與前人研究結果相吻合[22].此外由于植物體不同的補償和超補償機制[23-24]，在鹽脅迫解除后，外界滲透環(huán)境和離子環(huán)境發(fā)生激烈變化，相關代謝酶受到刺激，活性增強，也進一步打破了種子休眠，提高了發(fā)芽率[25].同時從試驗結果可以看到，250 mmol·L-1和300 mmol·L-1NaHCO3處理組種子最終萌發(fā)率與復水前萌發(fā)率沒有顯著性差異，這可能是由于過高的鹽分脅迫對細胞產生了嚴重的離子毒害，使得細胞膜系統失去了控制離子進出的能力，導致細胞異變和吸漲，對細胞正常的生理代謝造成了不可逆轉的損傷，使得種子即使解除了鹽脅迫也永久喪失了繼續(xù)萌發(fā)的能力[4,26].

通過對甘遂種子的耐鹽性評價，可知低濃度的Na2SO4對甘遂種子萌發(fā)呈現出促進作用，相對鹽害率為零，另外從回歸方程可得Na2SO4的耐鹽適宜濃度、半致死濃度和臨界濃度均為最高，NaCl最低，NaHCO3居中.綜上，甘遂種子對Na2SO4具有較強的耐受性，對NaCl和NaHCO3的刺激則較為敏感，且對NaCl的耐受性最差.這與張麗平等[27]得出的結果不一致，可能的原因是不同植物代謝反應進程不同，對不同類型鹽脅迫的響應表現也有差別.因此，在甘遂種子實際栽培過程中，應針對土壤中含鹽量和鹽分組成差異有選擇地種植，進而保證甘遂植株的健康生長.

4 結語

隨鹽濃度的升高，NaCl與NaHCO3處理組的甘遂種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數和活力指數等發(fā)芽指標均總體呈下降趨勢，Na2SO4處理組發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數總體呈先上升后下降趨勢，活力指數則持續(xù)下降，表明低濃度Na2SO4對甘遂種子萌發(fā)有一定促進作用.復水后，各鹽處理組最終萌發(fā)率均有不同程度回升，低濃度鹽處理下，最終萌發(fā)率顯著大于對照，表明低濃度鹽脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用主要來源于滲透脅迫，具有暫時性.耐鹽性評價結果表明，甘遂種子對三種鹽的耐受性由強到弱順序依次為Na2SO4>NaHCO3>NaCl.