郭震華

（1 黑龍江省農業(yè)科學院水稻研究所，黑龍江 佳木斯 154026；2 國家植物航天育種工程技術研究中心，廣東 廣州 510642）

稻瘟病作為影響最為嚴重的一種世界性稻作病害，每年可造成水稻減產11%～30%[1]，嚴重制約著水稻的安全生產。黑龍江省作為北方稻區(qū)的第一水稻大省，水稻的面積和總產均超過全國水稻面積和總產的10%，是全國糧食安全的“壓艙石”和“穩(wěn)壓器”。而黑龍江地區(qū)稻瘟病時有發(fā)生，危害嚴重，嚴重時可造成減產15%～20%。稻瘟病在水稻整個生育期內及各個部位均可發(fā)生，其中尤以葉瘟影響最為嚴重。因為稻瘟病復雜的遺傳背景，快速變異的生理小種，一個新品種在推廣3～5 年左右就可能失去抗性[2]。將生物技術（分子標記輔助選擇及轉基因技術等）應用于抗稻瘟病育種中，可以將優(yōu)勢基因聚合到一起，縮短育種年限，加快育種進程。

日本于20 世紀60 年代最先開始水稻抗稻瘟病基因的分析工作。截至2013 年5 月，共有64 個抗稻瘟病位點，78 個主效基因被報道。其中，Pi2，Piz-t，Pi9，Pia，Pib，Pita，Pid2，pi21，Pi36，Pi37，Pish，Pik，Pikm，Pi5，Pid3，Pb1，Pit，Pikp 等基因均被克隆，并且這些基因成簇的分布在除3 號染色體以外的其它染色體上。

Pi2 最初被定位在6 號染色體的標記RG64與RZ612 間[3，4]，繼續(xù)精細定位，通過RG64 和AP22 將遺傳距離定位在0.9 cM 和1.2 cM[5]。由于Pi2 的廣譜抗性，在792 個從中國收集的稻瘟小種中，接近92.45%的小種不能侵染含有Pi2 的資源材料C101A51[6]。同時，C101A51 還抗13 個國家中的36 個稻瘟小種[7]。作為NBS-LRR 一類基因，Pi2 包含3839 bp 和116 bp 兩個內含子，cDNA 全長為3332 bp，編碼1032 個氨基酸。在3個LRRs 區(qū)域中，Pi2 與Pi-zt 的編碼氨基酸中存在8 個位點的差異，并且其中僅存在1 個位于xxLxLxx 基序中[8]。

高分辨率熔解曲線（HRM，high-resolution melting curve）技術是新興的一種基因分型技術，通過配套的軟硬件系統(tǒng)，可以快速自動監(jiān)測DNA熔解曲線的變化，實現基因分型，分辨率可達單堿基差異，對SSR、SNP 及Indel 等不同類型變異有很好的區(qū)分效果[8]。由于不需要凝膠電泳等步驟，從而真正實現了閉管操作[9]，避免污染的可能。該方法目前已在玉米[10]、大麥[11]及水稻[12]等農作物中得到很好的應用。筆者擬利用與抗稻瘟病基因Pi2 緊密連鎖的HRM 分子標記[13]，對黑龍江水稻種質資源進行基因分型，以期明確Pi2 基因在黑龍江水稻中的分布情況，為抗稻瘟病品種的合理利用及選育提供參考，為寒地水稻分子標記輔助選擇育種（MAS）提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

選取67 份黑龍江省水稻主栽品種及優(yōu)異種質資源為本研究供試水稻材料（表1），由黑龍江省農業(yè)科學院水稻研究所提供，于2014 年種植于黑龍江省農業(yè)科學院佳木斯水稻研究所試驗地中。

表1 實驗所需品種（系）及其來源

1.2 方法

1.2.1 水稻基因組DNA 提取 苗期分別取各試驗材料的新鮮葉片，等量混合，按照McCouch[14]提供的方法進行DNA 的提取。

1.2.2 用于HRM 分析的多重巢式PCR 擴增多重巢式PCR 共包括以下兩輪擴增反應：

第一輪PCR：2×Power Taq PCR Master Mix母液5 μl，外引物F/R（10 μmoL-1）各0.3 μl，基因組DNA0.5 μl，總體積10 μl，ddH2O 補足。PCR 程序：95 ℃預變性5 min，35 個循環(huán)，20sec 95 ℃變性，20sec 57 ℃退火，10sec 72 ℃延伸；5 min 72 ℃延伸。擴增程序在Gene-Amp9700 型PCR 儀（Applied Biosystems, USA）上進行。

反應結束后PCR 管加200 μl 雙蒸水，稀釋第一輪產物。

第二輪PCR：2×Power Taq PCR Master Mix母液4 μl，內引物F/R（10 μmoL-1）各0.3 μl，第一輪稀釋PCR 產物0.5 μl，20×EvaGreen 染料（Biotium, USA）0.5 μl，內外標樣各1 μl，最后ddH2O 補足10 μl。擴增程序在Gene-Amp9700 型PCR 儀（Applied Biosystems, USA）上進行。PCR程序：95 ℃預變性2 min，22 個循環(huán)95 ℃變性20 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s；最后95 ℃延伸2 min。

1.2.3 利用LightScanner96 系統(tǒng)HRM 分析第二輪PCR 產物中加入20 μL 礦物油（SIGMA公司），將PCR 產物離心轉移至HRM檢測板中，2000 rpm 離心2 min，檢查無氣泡，放入LightScanner96 高分辨率熔解曲線分析系統(tǒng)（Idaho Technology Inc, USA）進行HRM檢測，起點溫度為60 ℃，終點溫度為95 ℃，平均15 min 一板PCR 反應。反應完成后，通過配套的LightScanner Call-IT、Small Amplicon 及LightScanner 分析系統(tǒng)分別進行基因型分析、自動化分析及HRM檢測。

用于PCR 擴增反應的引物名稱、序列、位置及片段大小等詳細信息見表2。

表2 檢測Pi2 基因的HRM 標記

2 結果與分析

對黑龍江水稻種質資源進行基因分型。通過兩輪的PCR 反應，擴增終產物由于DNA 雙鏈上突變位點的退火溫度（Tm 值）不同，產生不同的峰值，從而區(qū)分不同基因型。

基于Pi2 基因對應的HRM 標記檢測可以看出，灰色曲線為堿基為G 的稻瘟病感性基因Pi2，而紅色曲線為堿基為T 的稻瘟病抗性基因pi2。可以看出，pi2 因T 堿基氫鍵多于pi2 的G 堿基，其溶解溫度（Tm 值）為79～79.5 ℃，而Pi2 的溶解溫度（Tm 值）為78.5 ℃，明顯低于pi2 的，從而產生不同的峰值，可以清晰的區(qū)分不同基因型（圖1）。由圖2 可以看出，67 份材料的基因型通過不同顏色表示出，其中紅色的為抗性基因pi2 的種質資源材料，灰色的為感性基因Pi2 的種質資源材料。通過分析比對，67 份種質資源中，共有9 份含資源抗性基因pi2，分別為，龍粳12、哈99774、龍粳31、龍粳39、龍粳54、龍交10-989、龍粳53、彩及zlm55-1，僅占參試種質資源的13.43%，其余58份為含感性基因Pi2 資源?？梢姡琾i2 抗稻瘟病基因在黑龍江省分布相對較少，需要加強該基因在黑龍江省抗稻瘟病育種的應用。

圖1 Pi2 基因的HRM 溶解曲線峰值

圖2 Pi2 基因的HRM 標記分型

3 結論與討論

隨著分子標記輔助選擇在育種中的廣泛應用，各類分子標記不斷出現，而最為準確的是基于抗性基因本身的序列差異開發(fā)的分子標記，稱為功能標記（FMs），此類標記可以對目標性狀表型進行直接反映，對通過重組可能引起遺傳信息的丟失實現有效減少，實現FMs 與目標性狀直接關聯(lián)[15-17]。HRM技術與常規(guī)PCR 技術區(qū)別主要在于不再需要凝膠電泳步驟，直接對PCR 產物在管中進行分析，減少實驗步驟，大大縮短實驗時間，提高實驗效率，同時降低了實驗可能存在的污染率。利用該技術開發(fā)的功能標記已在玉米[10]、小麥[18]、大麥[11]及水稻[12]等農作物中成功應用。本研究所用到的HRM 標記是針對基因本身內部SNP 位點，利用HRM技術開發(fā)得到的，一方面作為功能基因標記，可以準確的發(fā)現種質間存在的基因差異，同時，基于HRM技術，又實現了高效快速的優(yōu)點，可以進行大規(guī)模的基因分型及篩查，大大提高了基因檢測及標記輔助選擇的效率。

目前已定位的主效抗稻瘟病基因中，一半以上是以基因簇的形式存在于水稻各染色體上。Pi2，Pi9，Pi50，Pigm，Pizh，Piz，Piz-t 與Piz 都是復等位基因。小粒野生稻含有Pi9，Fukunishiki 含有Pi2/Piz5，二八占含有Pi50。在抗稻瘟病植株中，Pi9 表達不受稻瘟病侵染誘導，并且作為一個廣譜抗稻瘟病基因，已報道Pi9 抗21 個生理小種。據推測，Pi9 的廣譜抗瘟病性的分子機制的原因是，Pi9 能識別各生理小種的保守分子或不同分子。作為一個廣譜抗稻瘟病基因，Pi2 的親本為C101A51，該品種對來自13 個國家的43 個稻瘟病菌株中的36 個表現高抗[7]。同時，當Pi2 基因與Pi1 及Pi4 等其他抗稻瘟病基因聚合時，在不改變后代材料的農藝性狀前提下，可以顯著地提高水稻抗稻瘟病頻率，不但可以提高葉瘟的抗性，還可以提高抗穗頸瘟的能力[18-20]。

針對水稻品種稻瘟病抗性而言，單個基因的抗性可能會隨著病原菌生理小種的變化在幾年內逐漸喪失，因此通過聚合育種的方法將多個稻瘟病抗性基因導入同一品種中，即可抵抗多種生理小種的侵害，從而達到廣譜抗性的目的。本研究中龍粳12、哈99774、龍粳31、龍粳39、龍粳54、龍交10-989、龍粳53、彩及zlm55-1 共9 份種質含有pi2 抗性基因，對稻瘟病各生理小種有著較為廣泛的抗性，為抗稻瘟病育種研究提供了有利的種質資源。

黑龍江省作為北方稻區(qū)水稻第一大省，稻瘟病一直以來是嚴重影響水稻產量的第一大病害。對部分黑龍江主栽品種及優(yōu)異種質資源的pi2 基因的分型鑒定，結果表明，67 份種質中，僅有龍粳12、哈99774、龍粳31 等9 份種質資源含有純合pi2 基因，占參試種質的13.43%。可見，pi2 抗稻瘟病基因雖然是一個廣譜抗性基因，對稻瘟病抗性廣，但在黑龍江分布相對較少，應當加大pi2 抗稻瘟病基因的導入，通過分子標記輔助手段，提高該基因在黑龍江種質資源中的分布，對黑龍江的抗稻瘟病品種的選育及提高抗病基因的合理利用有著重要的參考價值。