郭震華

（1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，黑龍江 佳木斯 154026；2 國(guó)家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

稻瘟病作為影響最為嚴(yán)重的一種世界性稻作病害，每年可造成水稻減產(chǎn)11%～30%[1]，嚴(yán)重制約著水稻的安全生產(chǎn)。黑龍江省作為北方稻區(qū)的第一水稻大省，水稻的面積和總產(chǎn)均超過全國(guó)水稻面積和總產(chǎn)的10%，是全國(guó)糧食安全的“壓艙石”和“穩(wěn)壓器”。而黑龍江地區(qū)稻瘟病時(shí)有發(fā)生，危害嚴(yán)重，嚴(yán)重時(shí)可造成減產(chǎn)15%～20%。稻瘟病在水稻整個(gè)生育期內(nèi)及各個(gè)部位均可發(fā)生，其中尤以葉瘟影響最為嚴(yán)重。因?yàn)榈疚敛?fù)雜的遺傳背景，快速變異的生理小種，一個(gè)新品種在推廣3～5 年左右就可能失去抗性[2]。將生物技術(shù)（分子標(biāo)記輔助選擇及轉(zhuǎn)基因技術(shù)等）應(yīng)用于抗稻瘟病育種中，可以將優(yōu)勢(shì)基因聚合到一起，縮短育種年限，加快育種進(jìn)程。

日本于20 世紀(jì)60 年代最先開始水稻抗稻瘟病基因的分析工作。截至2013 年5 月，共有64 個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)，78 個(gè)主效基因被報(bào)道。其中，Pi2，Piz-t，Pi9，Pia，Pib，Pita，Pid2，pi21，Pi36，Pi37，Pish，Pik，Pikm，Pi5，Pid3，Pb1，Pit，Pikp 等基因均被克隆，并且這些基因成簇的分布在除3 號(hào)染色體以外的其它染色體上。

Pi2 最初被定位在6 號(hào)染色體的標(biāo)記RG64與RZ612 間[3，4]，繼續(xù)精細(xì)定位，通過RG64 和AP22 將遺傳距離定位在0.9 cM 和1.2 cM[5]。由于Pi2 的廣譜抗性，在792 個(gè)從中國(guó)收集的稻瘟小種中，接近92.45%的小種不能侵染含有Pi2 的資源材料C101A51[6]。同時(shí)，C101A51 還抗13 個(gè)國(guó)家中的36 個(gè)稻瘟小種[7]。作為NBS-LRR 一類基因，Pi2 包含3839 bp 和116 bp 兩個(gè)內(nèi)含子，cDNA 全長(zhǎng)為3332 bp，編碼1032 個(gè)氨基酸。在3個(gè)LRRs 區(qū)域中，Pi2 與Pi-zt 的編碼氨基酸中存在8 個(gè)位點(diǎn)的差異，并且其中僅存在1 個(gè)位于xxLxLxx 基序中[8]。

高分辨率熔解曲線（HRM，high-resolution melting curve）技術(shù)是新興的一種基因分型技術(shù)，通過配套的軟硬件系統(tǒng)，可以快速自動(dòng)監(jiān)測(cè)DNA熔解曲線的變化，實(shí)現(xiàn)基因分型，分辨率可達(dá)單堿基差異，對(duì)SSR、SNP 及Indel 等不同類型變異有很好的區(qū)分效果[8]。由于不需要凝膠電泳等步驟，從而真正實(shí)現(xiàn)了閉管操作[9]，避免污染的可能。該方法目前已在玉米[10]、大麥[11]及水稻[12]等農(nóng)作物中得到很好的應(yīng)用。筆者擬利用與抗稻瘟病基因Pi2 緊密連鎖的HRM 分子標(biāo)記[13]，對(duì)黑龍江水稻種質(zhì)資源進(jìn)行基因分型，以期明確Pi2 基因在黑龍江水稻中的分布情況，為抗稻瘟病品種的合理利用及選育提供參考，為寒地水稻分子標(biāo)記輔助選擇育種（MAS）提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

選取67 份黑龍江省水稻主栽品種及優(yōu)異種質(zhì)資源為本研究供試水稻材料（表1），由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供，于2014 年種植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯水稻研究所試驗(yàn)地中。

表1 實(shí)驗(yàn)所需品種（系）及其來源

1.2 方法

1.2.1 水稻基因組DNA 提取 苗期分別取各試驗(yàn)材料的新鮮葉片，等量混合，按照McCouch[14]提供的方法進(jìn)行DNA 的提取。

1.2.2 用于HRM 分析的多重巢式PCR 擴(kuò)增多重巢式PCR 共包括以下兩輪擴(kuò)增反應(yīng)：

第一輪PCR：2×Power Taq PCR Master Mix母液5 μl，外引物F/R（10 μmoL-1）各0.3 μl，基因組DNA0.5 μl，總體積10 μl，ddH2O 補(bǔ)足。PCR 程序：95 ℃預(yù)變性5 min，35 個(gè)循環(huán)，20sec 95 ℃變性，20sec 57 ℃退火，10sec 72 ℃延伸；5 min 72 ℃延伸。擴(kuò)增程序在Gene-Amp9700 型PCR 儀（Applied Biosystems, USA）上進(jìn)行。

反應(yīng)結(jié)束后PCR 管加200 μl 雙蒸水，稀釋第一輪產(chǎn)物。

第二輪PCR：2×Power Taq PCR Master Mix母液4 μl，內(nèi)引物F/R（10 μmoL-1）各0.3 μl，第一輪稀釋PCR 產(chǎn)物0.5 μl，20×EvaGreen 染料（Biotium, USA）0.5 μl，內(nèi)外標(biāo)樣各1 μl，最后ddH2O 補(bǔ)足10 μl。擴(kuò)增程序在Gene-Amp9700 型PCR 儀（Applied Biosystems, USA）上進(jìn)行。PCR程序：95 ℃預(yù)變性2 min，22 個(gè)循環(huán)95 ℃變性20 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s；最后95 ℃延伸2 min。

1.2.3 利用LightScanner96 系統(tǒng)HRM 分析第二輪PCR 產(chǎn)物中加入20 μL 礦物油（SIGMA公司），將PCR 產(chǎn)物離心轉(zhuǎn)移至HRM檢測(cè)板中，2000 rpm 離心2 min，檢查無氣泡，放入LightScanner96 高分辨率熔解曲線分析系統(tǒng)（Idaho Technology Inc, USA）進(jìn)行HRM檢測(cè)，起點(diǎn)溫度為60 ℃，終點(diǎn)溫度為95 ℃，平均15 min 一板PCR 反應(yīng)。反應(yīng)完成后，通過配套的LightScanner Call-IT、Small Amplicon 及LightScanner 分析系統(tǒng)分別進(jìn)行基因型分析、自動(dòng)化分析及HRM檢測(cè)。

用于PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的引物名稱、序列、位置及片段大小等詳細(xì)信息見表2。

表2 檢測(cè)Pi2 基因的HRM 標(biāo)記

2 結(jié)果與分析

對(duì)黑龍江水稻種質(zhì)資源進(jìn)行基因分型。通過兩輪的PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增終產(chǎn)物由于DNA 雙鏈上突變位點(diǎn)的退火溫度（Tm 值）不同，產(chǎn)生不同的峰值，從而區(qū)分不同基因型。

基于Pi2 基因?qū)?yīng)的HRM 標(biāo)記檢測(cè)可以看出，灰色曲線為堿基為G 的稻瘟病感性基因Pi2，而紅色曲線為堿基為T 的稻瘟病抗性基因pi2。可以看出，pi2 因T 堿基氫鍵多于pi2 的G 堿基，其溶解溫度（Tm 值）為79～79.5 ℃，而Pi2 的溶解溫度（Tm 值）為78.5 ℃，明顯低于pi2 的，從而產(chǎn)生不同的峰值，可以清晰的區(qū)分不同基因型（圖1）。由圖2 可以看出，67 份材料的基因型通過不同顏色表示出，其中紅色的為抗性基因pi2 的種質(zhì)資源材料，灰色的為感性基因Pi2 的種質(zhì)資源材料。通過分析比對(duì)，67 份種質(zhì)資源中，共有9 份含資源抗性基因pi2，分別為，龍粳12、哈99774、龍粳31、龍粳39、龍粳54、龍交10-989、龍粳53、彩及zlm55-1，僅占參試種質(zhì)資源的13.43%，其余58份為含感性基因Pi2 資源。可見，pi2 抗稻瘟病基因在黑龍江省分布相對(duì)較少，需要加強(qiáng)該基因在黑龍江省抗稻瘟病育種的應(yīng)用。

圖1 Pi2 基因的HRM 溶解曲線峰值

圖2 Pi2 基因的HRM 標(biāo)記分型

3 結(jié)論與討論

隨著分子標(biāo)記輔助選擇在育種中的廣泛應(yīng)用，各類分子標(biāo)記不斷出現(xiàn)，而最為準(zhǔn)確的是基于抗性基因本身的序列差異開發(fā)的分子標(biāo)記，稱為功能標(biāo)記（FMs），此類標(biāo)記可以對(duì)目標(biāo)性狀表型進(jìn)行直接反映，對(duì)通過重組可能引起遺傳信息的丟失實(shí)現(xiàn)有效減少，實(shí)現(xiàn)FMs 與目標(biāo)性狀直接關(guān)聯(lián)[15-17]。HRM技術(shù)與常規(guī)PCR 技術(shù)區(qū)別主要在于不再需要凝膠電泳步驟，直接對(duì)PCR 產(chǎn)物在管中進(jìn)行分析，減少實(shí)驗(yàn)步驟，大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，同時(shí)降低了實(shí)驗(yàn)可能存在的污染率。利用該技術(shù)開發(fā)的功能標(biāo)記已在玉米[10]、小麥[18]、大麥[11]及水稻[12]等農(nóng)作物中成功應(yīng)用。本研究所用到的HRM 標(biāo)記是針對(duì)基因本身內(nèi)部SNP 位點(diǎn)，利用HRM技術(shù)開發(fā)得到的，一方面作為功能基因標(biāo)記，可以準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)種質(zhì)間存在的基因差異，同時(shí)，基于HRM技術(shù)，又實(shí)現(xiàn)了高效快速的優(yōu)點(diǎn)，可以進(jìn)行大規(guī)模的基因分型及篩查，大大提高了基因檢測(cè)及標(biāo)記輔助選擇的效率。

目前已定位的主效抗稻瘟病基因中，一半以上是以基因簇的形式存在于水稻各染色體上。Pi2，Pi9，Pi50，Pigm，Pizh，Piz，Piz-t 與Piz 都是復(fù)等位基因。小粒野生稻含有Pi9，F(xiàn)ukunishiki 含有Pi2/Piz5，二八占含有Pi50。在抗稻瘟病植株中，Pi9 表達(dá)不受稻瘟病侵染誘導(dǎo)，并且作為一個(gè)廣譜抗稻瘟病基因，已報(bào)道Pi9 抗21 個(gè)生理小種。據(jù)推測(cè)，Pi9 的廣譜抗瘟病性的分子機(jī)制的原因是，Pi9 能識(shí)別各生理小種的保守分子或不同分子。作為一個(gè)廣譜抗稻瘟病基因，Pi2 的親本為C101A51，該品種對(duì)來自13 個(gè)國(guó)家的43 個(gè)稻瘟病菌株中的36 個(gè)表現(xiàn)高抗[7]。同時(shí)，當(dāng)Pi2 基因與Pi1 及Pi4 等其他抗稻瘟病基因聚合時(shí)，在不改變后代材料的農(nóng)藝性狀前提下，可以顯著地提高水稻抗稻瘟病頻率，不但可以提高葉瘟的抗性，還可以提高抗穗頸瘟的能力[18-20]。

針對(duì)水稻品種稻瘟病抗性而言，單個(gè)基因的抗性可能會(huì)隨著病原菌生理小種的變化在幾年內(nèi)逐漸喪失，因此通過聚合育種的方法將多個(gè)稻瘟病抗性基因?qū)胪黄贩N中，即可抵抗多種生理小種的侵害，從而達(dá)到廣譜抗性的目的。本研究中龍粳12、哈99774、龍粳31、龍粳39、龍粳54、龍交10-989、龍粳53、彩及zlm55-1 共9 份種質(zhì)含有pi2 抗性基因，對(duì)稻瘟病各生理小種有著較為廣泛的抗性，為抗稻瘟病育種研究提供了有利的種質(zhì)資源。

黑龍江省作為北方稻區(qū)水稻第一大省，稻瘟病一直以來是嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量的第一大病害。對(duì)部分黑龍江主栽品種及優(yōu)異種質(zhì)資源的pi2 基因的分型鑒定，結(jié)果表明，67 份種質(zhì)中，僅有龍粳12、哈99774、龍粳31 等9 份種質(zhì)資源含有純合pi2 基因，占參試種質(zhì)的13.43%?？梢姡琾i2 抗稻瘟病基因雖然是一個(gè)廣譜抗性基因，對(duì)稻瘟病抗性廣，但在黑龍江分布相對(duì)較少，應(yīng)當(dāng)加大pi2 抗稻瘟病基因的導(dǎo)入，通過分子標(biāo)記輔助手段，提高該基因在黑龍江種質(zhì)資源中的分布，對(duì)黑龍江的抗稻瘟病品種的選育及提高抗病基因的合理利用有著重要的參考價(jià)值。