晉鵬飛 張浩然 王婷婷 陳玟琿 夏欣瑩 徐杭忠 呂浩 唐毅

(1 西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，水產(chǎn)科學(xué)重慶市重點實驗室，重慶 400715；2 淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶 400715；3 重慶市合川區(qū)水產(chǎn)發(fā)展指導(dǎo)站，重慶 401520)

抗生素的應(yīng)用有效控制了許多水產(chǎn)動物疾病的發(fā)生，但也給人類身體健康和生態(tài)環(huán)境帶來了許多不利影響[1]，尤其是病原菌對抗生素表現(xiàn)出耐藥性，致使對耐藥菌感染所引起疾病的治療變得更加困難，甚至面臨無藥可用的局面。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中減少抗生素的使用并最終實現(xiàn)水產(chǎn)品無抗養(yǎng)殖，是人們健康生活和時代發(fā)展的需要，也是未來水產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢[2]。中草藥用于水產(chǎn)動物病害防治由來已久，尤其在淡水養(yǎng)殖中應(yīng)用廣泛，因其具有天然性、多功能性、毒副作用小、低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性和可增強免疫力等多重優(yōu)點而備受關(guān)注[3-4]，是減少或替代抗生素使用的一大選擇[5-7]。同時，中草藥成分中的多種生物活性物質(zhì)對動物機體毒素的排出能起到重要的促進作用，已被廣泛應(yīng)用于細菌性疾病防治上[8]。目前中草藥的開發(fā)利用大多以提取物的形式形成產(chǎn)品，其活性成分及功效受提取方式的影響較大[9]。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)隸屬于弧菌科、氣單胞菌屬[10]，是一種典型的革蘭氏陰性短桿菌，為人-獸-魚共患病病原，廣泛分布于自然界各種水體環(huán)境中[11]。該菌能引起軟體動物、魚類、兩棲類、爬行類、鳥類及哺乳類等多種動物全身性敗血癥或局部感染[12]，是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物常見的病原菌之一。

本試驗選取五倍子、烏梅、訶子、大黃和五味子等5種常用中草藥，分別用50%乙醇、無水乙醇、氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯和石油醚對其進行粗提物提取，探討不同有機溶劑的提取效果，并采用中草藥提取物對嗜水氣單胞菌進行抑菌、殺菌試驗，以抑菌圈大小、最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)評價其抑菌、殺菌效果[13]，以期為中草藥有機溶劑萃取劑的優(yōu)化選擇及中草藥提取物在水產(chǎn)動物細菌性疾病防治中的應(yīng)用開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試中草藥

試驗用五倍子、烏梅、訶子、大黃和五味子等5種中草藥均購自重慶鑫斛藥房連鎖有限公司，其提取部位見表1。

表1 試驗用中草藥基本情況

1.1.2 供試菌

嗜水氣單胞菌由本實驗室從患有消化道不同程度出血等敗血癥的寬體金線蛭身體上分離鑒定。

1.1.3 主要試劑和儀器

試劑：NB肉湯培養(yǎng)基、NB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基均按常規(guī)方法配制[14]；二甲基亞砜(DMSO，>99.5%)溶液、無水乙醇、50%乙醇[使用無水乙醇和純水1∶1(v∶v)混合配制]、氯仿、甲醇、丙酮、乙酸乙酯和石油醚，以上所有試劑均為分析純，購于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

儀器設(shè)備：RE-5286A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，AR2140型電子天平(上海菁海儀器有限公司)，SPX-258B型恒溫生化培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，WK-150型超微粉碎機(青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司)，DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣儀器有限公司)，SHZ-DIII循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)，UPT-II-10T型超純水機(四川優(yōu)普超純科技有限公司)，BCN-1360型超凈工作臺(天津市泰斯特儀器有限公司)，GR60DA高壓滅菌器(智微廈門儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 中草藥提取物的制備及提取率計算

采用水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對供試中草藥進行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回流提取，具體方法：將各單味中草藥樣品粉碎，取每種樣品50 g裝入圓底燒瓶，加提取溶劑浸沒過藥材表面1～2 cm，在50～80 ℃水浴中加熱回流提取，保持沸騰約1 h，冷卻約30 min，濾出濾液，在藥渣中再加提取溶劑，分別進行第2和第3次加熱回流約30 min，收集3次濾液，轉(zhuǎn)移至經(jīng)精確稱量的100 mL錐形瓶中，濾液濃縮至膏狀物[15]，即得到中草藥提取物。精確稱量盛有中草藥提取物的錐形瓶質(zhì)量，減去該錐形瓶空瓶質(zhì)量，即為中草藥提取物質(zhì)量(g)。提取物經(jīng)高壓滅菌并密封后，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

提取率(%)=100×提取物質(zhì)量/中草藥生藥樣品質(zhì)量

(1)

1.2.2 供試中草藥提取物藥液的配制

在中草藥提取物中加入適量二甲基亞砜作為助溶劑，用無菌生理鹽水稀釋，配成含生藥1.0 g/mL的供試藥液母液。

1.2.3 中草藥提取物體外抑菌圈直徑的測定

用牛津杯雙層瓊脂平板法測定供試藥液的抑菌效果。在無菌條件下，將約15 mL已滅菌的NB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入直徑90 mm的平板內(nèi)(下層)，待其凝固后再倒入約5 mL溫度在50 ℃左右并混有0.1 mL供試菌菌液(1×108cfu/mL)的NB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(上層)。在凝固后的上層培養(yǎng)基表面放置牛津杯(內(nèi)徑6 mm，外徑8 mm，高10 mm)，并輕壓使之與培養(yǎng)基無空隙接觸。杯中加入200 μL供試藥液，在28 ℃恒溫下培養(yǎng)16～18 h后觀察結(jié)果，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。判定標準：抑菌圈直徑≥20 mm，為極度敏感；15 mm≤抑菌圈直徑<20 mm，為高度敏感；10 mm≤抑菌圈直徑<15 mm，為中度敏感；抑菌圈直徑<10 mm，為低度敏感[16]。

1.2.4 中草藥最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定

取供試藥液母液，用無菌生理鹽水稀釋后配制成含生藥400 mg/mL的中草藥藥液，采用美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)推薦的常量稀釋法測定該藥液的最小抑菌濃度(MIC)，即取5組各13支滅菌小試管，在無菌條件下分別加入NB肉湯培養(yǎng)基1 mL，其中，1～10號管為試驗管，1號管分別加入上述單味中草藥藥液1 mL，混勻后吸取1 mL加入2號管，依次倍比稀釋至10號管，從10號管吸取1 mL藥液棄去，然后向每支管中分別加入0.1 mL濃度調(diào)整為1×106cfu/mL的菌液；11號管加入0.1 mL藥液作為陰性對照管；12號管加入0.1 mL菌液作為陽性對照管；13號管加入0.1 mL NB肉湯培養(yǎng)基作為空白對照。在28 ℃下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，如試管中液體完全清澈，表明無細菌生長；如液體渾濁，表明有細菌生長；對于藥液顏色較深、肉眼無法判斷的試管，取樣進一步做平板涂布培養(yǎng)。肉眼觀察，以無細菌生長試管中的最低藥物濃度為最小抑菌濃度(MIC)。吸取MIC值及其以上濃度的培養(yǎng)物0.1 mL涂布于NB營養(yǎng)瓊脂平板，在28 ℃下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，以無菌生長或菌落數(shù)<5個的藥液濃度為該藥物的最小殺菌濃度(MBC)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗和單因子方差分析(one-way ANOVA，LSD)。用Duncan’s多重比較方法分析組間差異顯著性，設(shè)顯著水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同提取溶劑對5種中草藥的提取效果

不同提取溶劑對5種中草藥的提取率見圖1。由圖1可見，同一種中草藥采用不同有機溶劑提取物，其提取率是不同的，有的還存在顯著差異(P<0.05)。其中，50%乙醇、無水乙醇和甲醇提取物對5種中草藥的提取效果顯著優(yōu)于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和石油醚，尤其甲醇的提取率最高，其提取率分別為五倍子46.09%、烏梅27.58%、訶子29.55%、大黃50.34%、五味子30.88%。提取效果相對最差的是石油醚，其提取率分別為五倍子1.98%、烏梅1.73%、訶子2.21%、大黃0.89%、五味子3.40%。不同溶劑提取物對5種中草藥的提取率由高到低依次排序，五倍子：甲醇、無水乙醇、50%乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚；烏梅：甲醇、50%乙醇、無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚；訶子：甲醇、無水乙醇、50%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿；大黃：甲醇、無水乙醇、50%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚；五味子：甲醇、無水乙醇、50%乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚。

注：上標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 五種中草藥不同溶劑提取物對嗜水氣單胞菌抑菌圈直徑的測定結(jié)果

5種中草藥的不同溶劑提取物對嗜水氣單胞菌均有抑菌作用，其抑菌圈直徑測定結(jié)果見圖2。由圖2可見，不同種類中草藥的不同溶劑提取物，其抑菌活性并不相同。嗜水氣單胞菌對五倍子的甲醇提取物、無水乙醇提取物和50%乙醇提取物等3種醇提物均表現(xiàn)為極度敏感，對大黃的甲醇提取物表現(xiàn)為高度敏感，對五倍子、大黃和五味子的氯仿提取物以及對烏梅、大黃和五味子的石油醚提取物呈低度敏感，對五倍子的丙酮提取物等共25種提取物均表現(xiàn)為中度敏感。五倍子的50%乙醇、無水乙醇和甲醇提取物的抑菌圈直徑顯著大于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和石油醚提取物的(P<0.05)，大黃的50%乙醇、無水乙醇和甲醇提取物的抑菌圈直徑顯著大于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和石油醚提取物的(P<0.05)，其他3種供試中草藥不同溶劑提取物抑菌圈直徑的差異沒有五倍子、大黃明顯。

注：上標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 五種中草藥不同溶劑提取物對嗜水氣單胞菌MIC和MBC的測定結(jié)果

5種中草藥的不同溶劑提取物對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)見表2。由表2可見，5種中草藥的甲醇提取物均表現(xiàn)出相對最強的抑殺菌活性，MIC和MBC均在1.56～6.25 mg/mL；其次是50%乙醇提取物，MIC和MBC分別在1.56～12.50 mg/mL和3.13～25.00 mg/mL；再次是無水乙醇提取物，MIC和MBC分別在3.13～12.50 mg/mL和3.13～25.00 mg/mL。氯仿和石油醚提取物的抑殺菌活性相對較差甚至無殺菌作用，MIC和MBC分別在25.00～100.00 mg/mL和50.00 mg/mL～無殺菌作用。由表2還可看出，五倍子、大黃的醇提物對供試菌的抑殺菌效果明顯優(yōu)于其他3種中草藥任何一種有機溶劑的提取物，尤其五倍子的甲醇提取物抑殺菌效果最佳，其次是大黃的甲醇提取物，二者對菌液濃度為1×106cfu/mL的嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)均為1.56 mg/mL，最小殺菌濃度(MBC)分別為1.56、3.13 mg/mL。

表2 5種中草藥不同溶劑提取物對嗜水氣單胞菌的MIC和MBC測定結(jié)果 單位：mg/mL

3 討論

相關(guān)研究表明，多種中草藥提取物對水產(chǎn)動物病原菌具有不同程度的抗菌活性[3-4]。然而，影響中草藥抗菌活性的重要因素之一是其有效成分的提取。中草藥有效成分的提取方法有多種[15,17]，其中溶劑提取法是常用方法之一，其基本原理是根據(jù)中草藥中的各種成分在溶劑中的溶解性質(zhì)選用適宜的溶劑，將有效成分從藥材組織內(nèi)溶解出來[18]。中草藥提取物的提取效果和所提取有效成分類別與量的多少隨所選用溶劑(提取劑)的不同而不同，其發(fā)揮的藥效也相應(yīng)不同[19]。從本研究結(jié)果看，3種醇溶劑(50%乙醇、無水乙醇和甲醇)對五倍子等5種供試中草藥提取物(醇提物)的提取率均較高，甲醇的提取效果尤為突出，提取效果相對較差的是氯仿、乙酸乙酯和丙酮，最差的是石油醚。這表明，可選擇該3種醇溶劑作為5種供試中草藥提取物的萃取劑，尤以甲醇為佳。

本研究中，五倍子的3種醇提物對嗜水氣單胞菌(1×106cfu/mL)的MIC分別為3.13、3.13、1.56 mg/mL，MBC分別為6.25、6.25、1.56 mg/mL。在菌液濃度為1×108cfu/mL的條件下，其抑菌圈直徑分別為(21.5±0.3)、(22.0±0.8)、(24.5±0.4)mm。大黃的3種醇提物對嗜水氣單胞菌的MIC分別為1.56、3.13、1.56 mg/mL，MBC均為3.13 mg/mL。在菌液濃度為1×108cfu/mL的條件下，其抑菌圈直徑分別為(14.9±0.4)、(14.5±0.7)、(16.1±0.3)mm。由此可見，五倍子和大黃對嗜水氣單胞菌具有較強的抑殺菌能力。推測其原因，五倍子中的主要有效成分沒食子酸和鞣質(zhì)可使細菌內(nèi)的蛋白質(zhì)變性沉淀，使胞內(nèi)原生質(zhì)凝固，影響細菌的各種代謝活性，從而抑制細菌生長[20]；大黃中的主要有效成分大黃素和大黃酸可使細菌DNA發(fā)生突變，造成DNA損傷，抑制細菌生長[21](大黃素)，以及抑制糖代謝中間產(chǎn)物氧化脫氫而與DNA結(jié)合，干擾蛋白質(zhì)合成，進而抑制細菌生長[22](大黃酸)?？率萚17]的研究表明，五倍子和大黃的50%乙醇提取物對嗜水氣單胞菌(8×107cfu/mL)具有較強的抑菌活性，其抑菌圈直徑分別為(24.29±0.89)、(15.05±0.50)mm，這與本研究結(jié)果基本一致。姚嘉赟等[23]報道，五倍子和大黃的95%乙醇提取物對嗜水氣單胞菌(1×109cfu/mL)的體外抑菌圈直徑分別為(13.7±1.04)mm、≤7 mm。姜巨峰等[24]研究指出，五倍子對嗜水氣單胞菌具有較強的體外抑菌能力，當菌液濃度為6×105個/mL時，其MIC只有0.780 mg/mL。這與本研究結(jié)果不同，原因可能與中草藥本身的質(zhì)量、供試菌液和萃取劑濃度、提取工藝等不同有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，五倍子和大黃的3種醇溶劑(50%乙醇、無水乙醇和甲醇)提取物對嗜水氣單胞菌均具有較強的抗菌活性，但其抗菌的功能性成分有待于進一步分析研究。另外，本試驗所選取的5種中草藥中，烏梅、訶子未列入2020版“水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙”已批準的水產(chǎn)養(yǎng)殖用獸藥名錄，因此，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應(yīng)注意用藥規(guī)范、用藥安全。