韓利紅，田雪蓮，劉 潮，付小林，王遠獻

(曲靖師范學(xué)院 生物資源與食品工程學(xué)院，云南省高校特色果酒技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用工程研究中心，云南 曲靖 655011)

塊菌(truffle)又稱松露，為塊菌科(Tuberaceae)塊菌屬()菌根型野生食用菌，常生于針闊混交林，與多種宿主植物形成專性菌根共生體，主要分布在歐洲、大洋洲和我國西南地區(qū)。塊菌對生長環(huán)境要求苛刻，其人工培養(yǎng)已取得一定進展。塊菌氣味獨特，富含維生素、鞘脂類和微量元素等，屬珍稀名貴菌物，兼具營養(yǎng)、保健、藥用等多種功效于一體，深受各國人民的喜愛。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internally transcribed spacer，ITS)rDNA序列分析表明，塊菌至少包含180個種，其中，黑孢塊菌()和白塊菌()已有幾百年的食用歷史。波氏塊菌()廣泛分布于歐洲各地，在北美和大洋洲均有栽培。醇類、酮類、醛類、脂類和含硫化合物導(dǎo)致塊菌產(chǎn)生獨特的香味，不同種類塊菌香味不同，生長季節(jié)、生長環(huán)境也會影響塊菌的香味構(gòu)成成分。黑孢塊菌、印度塊菌()、攀枝花白塊菌()、中華夏塊菌()和擬凹陷塊菌()是5種主要分布在歐洲和中國的商業(yè)塊菌，其中，黑孢塊菌是含有香味成分最豐富的類群。白塊菌香味成分含量受個體影響較大，而受栽培地域的影響較小，土壤細菌群落影響了部分化合物成分含量。

作為遺傳信息識別和傳遞的載體，密碼子在生物遺傳和變異過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。除甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)外，其余氨基酸均由2～6個同義密碼子編碼。自然界中，不同物種對密碼子的使用并不是完全隨機的，甚至同一物種的不同基因?qū)γ艽a子的使用偏好性也不同，這種現(xiàn)象稱為密碼子使用偏性(codon usage bias，CUB)。CUB與鳥嘌呤和胞嘧啶(guanine and cytosine，GC)含量、第3位堿基使用頻率和重復(fù)序列等有關(guān)，會改變蛋白的翻譯效率和準(zhǔn)確性，對物種的表型和適應(yīng)性產(chǎn)生影響。CUB受到突變壓力和自然選擇等因素的影響，是物種適應(yīng)性進化的結(jié)果，可反映物種起源和進化方式。最優(yōu)密碼子往往對應(yīng)更豐富的轉(zhuǎn)運RNA(transfer RNA，tRNA)，在高表達基因中含量更豐富。密碼子使用偏性分析對于基因進化、環(huán)境適應(yīng)、植物基因工程和遺傳分析具有重要的生物學(xué)意義。目前，黑孢塊菌、白塊菌和波氏塊菌的全基因組數(shù)據(jù)已相繼公布，然而未見其密碼子使用偏性的報道。本研究系統(tǒng)分析3種塊菌基因組密碼子使用模式及其影響因素，以期為塊菌基因進化研究和遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列獲取與篩選

從Ensembl數(shù)據(jù)庫(http://fungi.ensembl.org/index.html)搜索并下載黑孢塊菌、白塊菌和波氏塊菌基因編碼序列(coding sequence，CDS)。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，僅篩選CDS以ATG起始，以終止密碼子TAA、TAG或TGA結(jié)尾，且長度大于300 bp的序列。

1.2 方法

1.2.1 密碼子組成分析

利用CodonW 1.4.2軟件(https://sourceforge.net/projects/codonw/)分析CDS的有效密碼子數(shù)(effective number of codons，ENC)、密碼子第3位上4種堿基腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶出現(xiàn)頻率(A3s、T3s、G3s、C3s)、GC含量、第3位同義密碼子上G和C的含量(GC3s)和最優(yōu)密碼子使用頻率(Fop)等。利用EMBOSS在線網(wǎng)站的cusp軟件分析相對同義密碼子使用度(relative synonymous codon usage，RSCU)。利用Mega X軟件對CDS進行核苷酸組成分析。

1.2.2 密碼子使用相似度分析

基因密碼子使用相似度分析可以反映不同物種的遺傳差異。使用同義密碼子RSCU值計算物種間密碼子使用度相似度參數(shù)。

(1)

(2)

式(1)和(2)中：(，)為物種A和B基因密碼子RSCU的夾角余弦值，表示二者總體密碼子使用模式的相似度；(，)表示物種B對物種A密碼子使用模式的影響與差異，(，)越趨于0，表示兩物種密碼子使用模式相似度越高；和分別代表物種A和物種B同義密碼子的RSCU值。

1.2.3 最優(yōu)密碼子分析

綜上，基于大學(xué)生實習(xí)支教的研究視角主要有：一是實習(xí)工作管理，教育教學(xué)管理，師范生專業(yè)素質(zhì)發(fā)展；二是實習(xí)學(xué)生實踐創(chuàng)新能力、心理問題、社會適應(yīng)性、綜合素質(zhì)等；三是實習(xí)支教大學(xué)生思想政治教育模式、方法、路徑等。研究中以實證性調(diào)研為主，基于本校本地的經(jīng)驗居多，缺乏普遍性規(guī)律的探討和理論總結(jié)與提升。河西學(xué)院援疆實習(xí)支教與以上研究結(jié)論有重合之處，但也有自己鮮明的特點，總結(jié)十年的做法與經(jīng)驗，對做好大學(xué)生思想政治教育具有一定的借鑒意義。

根據(jù)基因ENC值排序，選擇數(shù)值最低和最高5%的基因分別作為高表達基因(high expression genes，HEG)和低表達基因(low expression genes，LEG)。RSCU值大于1表明該密碼子使用偏性較強，該密碼子確定為高頻密碼子，如果同時滿足ΔRSCU(HEG-LEG)大于0.08，該密碼子確定為最優(yōu)密碼子。

1.2.4 奇偶偏性繪圖(Parity Rule 2 plot，PR2-plot)分析

根據(jù)Mega X軟件分析的A3、T3、C3和G3數(shù)值，計算G3/(G3+C3)和A3/(A3+T3)，分別作為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)繪圖。G3/(G3+C3)和A3/(A3+T3)分布靠近中心坐標(biāo)0.5，表示堿基使用不存在突變或選擇偏性。

1.2.5 ENC-GC3s關(guān)聯(lián)繪圖分析

ENC-GC3s關(guān)系可用于分析反映密碼子偏性的影響因素。分別以GC3s和ENC值作為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)繪制散點圖。ENC期望值計算公式為：

(3)

式(3)中，表示ECN值，表示GC3s的值。

1.2.6 中性繪圖分析

GC3與GC12(GC1和GC2的平均值)相關(guān)性分析反映密碼子使用偏性受堿基突變作用的強弱。以GC3和GC12分別作為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)繪制散點圖。

1.2.7 對應(yīng)性與相關(guān)性分析

對應(yīng)性分析(correspondence analysis，COA)從多維空間中提取密碼子使用偏性的影響變量，每個變量的占比表示對密碼子使用性影響的權(quán)重，反映其對密碼子使用影響大小。利用CodonW 1.4.2軟件根據(jù)59個密碼子(Met、Trp和3個終止密碼子除外)的RSCU值進行COA分析。參數(shù)間的相關(guān)性分析使用SPSS 23.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子使用偏性

黑孢塊菌、白塊菌和波氏塊菌基因組大小依次為124.95、192.78和97.19 Mb，分別含有7 496、9 431和12 345個基因，GC含量分別為44.9%、40.0%和46.4%。經(jīng)過篩選，分別從3種塊菌中獲得6 613、7 623和10 591條CDS進行密碼子使用偏性分析。堿基頻率分析顯示，3種塊菌編碼基因GC含量均明顯高于基因組GC含量，白塊菌C3s、G3s、GC3s、GC與三聯(lián)密碼子各位置上GC含量(GC1、GC2和GC3)均較高，其次為黑孢塊菌，波氏塊菌最低。編碼基因GC含量均大于AT含量，波氏塊菌T3s和A3s顯著高于黑孢塊菌和白塊菌(表1)。黑孢塊菌、白塊菌和波氏塊菌平均ENC值均大于55，小于35的基因數(shù)量分別為9、21和28，白塊菌基因平均ENC值略低于黑孢塊菌和波氏塊菌，表明3種塊菌多數(shù)基因密碼子偏性較弱，表達潛力較低。

表1 三種塊菌堿基組成與密碼子使用參數(shù)

2.2 密碼子使用相似度

基因組密碼子使用相似度分析顯示，3種塊菌間差異性指數(shù)(，)數(shù)值較小，黑孢塊菌與白塊菌差異性指數(shù)為0.001 3，白塊菌與波氏塊菌為0.000 9，黑孢塊菌與波氏塊菌為0.000 4(圖1)，說明三者密碼子使用存在較高的相似度，遺傳分歧較小，其中，黑孢塊菌與波氏塊菌密碼子使用相似度最高，黑孢塊菌與白塊菌相似度最低，白塊菌的密碼子使用性與其他兩種塊菌存在一定差異。

圖1 三種塊菌基因組密碼子使用差異

2.3 最優(yōu)密碼子

黑孢塊菌、白塊菌和波氏塊菌基因組中，RSCU分別為0.52～1.45、0.62～1.38和0.58～1.43，RSCU值大于1的密碼子個數(shù)分別為30、32和30個，其中三者共有的高頻密碼子有24個，9個以A/T結(jié)尾，15個以G/C結(jié)尾(表2)。黑孢塊菌、白塊菌和波氏塊菌最優(yōu)密碼子的ΔRSCU最高值分別為0.82、0.79和0.76，最優(yōu)密碼子數(shù)(G/C和A/T結(jié)尾數(shù))分別為22(18，4)、19(15，4)和21(13，8)，包含14個共有的最優(yōu)密碼子，其中8個以C結(jié)尾，3個以G結(jié)尾，3個以T結(jié)尾，表明3種塊菌均偏好G/C結(jié)尾的密碼子，基因密碼子使用模式雖有差異但總體相似。

表2 三種塊菌基因組密碼子的密碼子使用度

2.4 密碼子變異影響因素

2.4.1 ENC-GC3s關(guān)聯(lián)分析

ENC-GC3s關(guān)聯(lián)繪圖可以反映GC3s對密碼子使用偏性的影響。3種塊菌少數(shù)基因位于ENC-GC3s關(guān)聯(lián)曲線上方，大多數(shù)基因位于下方，且遠離曲線(圖2)。3種塊菌中遠離曲線的基因特征存在明顯差異，其中，黑孢塊菌和白塊菌基因主要位于下部偏右的區(qū)域。黑孢塊菌中12個基因靠近左下角，這些基因ENC值較小，密碼子使用偏性較強，具有較高的表達潛力。波氏塊菌基因主要位于下部中間區(qū)域。ENC-GC3s關(guān)聯(lián)分析表明，3種塊菌基因密碼子使用偏性除了受到堿基突變影響外，還受到較強的翻譯選擇等其他

GC3s，第3位同義密碼子上G和C的含量。

因素的作用。相對而言，黑孢塊菌基因密碼子使用偏性受非堿基突變因素影響最強，其次是白塊菌，波氏塊菌基因密碼子使用偏性受非堿基突變因素影響最弱。

2.4.2 奇偶偏好分析

PR2-plot顯示密碼子第3位堿基使用的偏好性，可反映密碼子偏性形成的影響因素。總體上，3種塊菌密碼子G3/(G3+C3)介于0.492～0.496，A3/(A3+U3)介于0.440～0.445，表明第3位嘧啶含量(C+T)高于嘌呤含量(G+A)(圖3)。白塊菌少數(shù)基因密碼子嘌呤含量明顯高于嘧啶含量。密碼子第3位上4種堿基的不平衡分布，說明3種塊菌受堿基突變影響的同時，均受到了翻譯選擇等其他因素的影響，少數(shù)偏離中心點的基因受選擇作用影響更強。

圖3 三種塊菌PR2-plot分析

2.4.3 中性繪圖分析

Neutrality plot反映密碼子第一二位GC含量(GC12)和第3位GC含量(GC3)的相關(guān)性，用于評估密碼子受堿基突變的影響程度。相關(guān)性分析顯示，黑孢塊菌和波氏塊菌基因GC3與GC12均為極顯著相關(guān)(<0.01)，白塊菌為顯著相關(guān)(<0.05)，但3種塊菌GC3與GC12擬合優(yōu)度值均較低(分別為0.001 5、0.000 8和0.007 9)，線性回歸斜率分別為0.019 7、0.015 5和0.050 8，黑孢塊菌和白塊菌基因在中心圖中的分布整體靠右，波氏塊菌略偏右(圖4)，表明3種塊菌基因密碼子使用偏性主要受自然選擇等多種因素影響，相比較而言，黑孢塊菌和白塊菌受選擇壓力因素影響大于波氏塊菌。

圖4 三種塊菌中性繪圖分析

2.4.4 對應(yīng)性與相關(guān)性分析

基于RSCU值的對應(yīng)性分析可以了解3種塊菌密碼子使用性的影響因素。前4個軸累計解釋黑孢塊菌、白塊菌和波氏塊菌基因組變異的31.37%、29.65%和27.43%，其中第一軸(Axis 1)分別解釋了3種塊菌基因組變異權(quán)重的12.24%、10.63%和9.40%，第二軸(Axis 1)分別解釋了變異權(quán)重的9.41%、9.58%和9.14%，其余軸的權(quán)重均小于5.40%，表明第一軸和第二軸是影響塊菌密碼子使用性的主要因素。不同GC含量的基因在3種塊菌基因組中的占比差異明顯，黑孢塊菌、白塊菌和波氏塊菌中GC含量小于45%的基因占比分別為1.01%、7.81%和4.32%，GC含量為45%～60%的基因占比分別為97.05%、68.98%和94.98%，GC含量大于60%的基因占比分別為1.94%、23.22%和0.71%。GC含量為45%～60%的基因均勻分布在坐標(biāo)軸的中心區(qū)域；GC含量小于45%的基因分布表現(xiàn)出明顯的差異，具體表現(xiàn)為在黑孢塊菌中偏左，在白塊菌中偏右，在波氏塊菌中偏下；GC含量大于60%的基因分布與小于45%的基因位置正相反，在黑孢塊菌中偏右，在白塊菌中偏左，在波氏塊菌偏上(圖5)。

圖5 三種塊菌基因組對應(yīng)性分析

為進一步分析密碼子使用偏好的影響因素，對密碼子使用參數(shù)與向量軸相關(guān)性進行分析，發(fā)現(xiàn)黑孢塊菌第一軸與GC3s、GC和Fop呈極顯著正相關(guān)，而與ENC值呈極顯著負相關(guān)，第二軸的結(jié)果與第一軸基本相反；白塊菌第一軸與ENC值呈極顯著正相關(guān)，而與GC3s、GC和Fop呈極顯著負相關(guān)，第二軸與GC3s、GC和ENC值呈極顯著正相關(guān)，而與Fop呈極顯著負相關(guān)；波氏塊菌第一軸與ENC值呈極顯著正相關(guān)，而與GC和Fop呈極顯著負相關(guān)，第二軸與GC3s、GC和Fop呈極顯著正相關(guān)，第二軸與ENC值呈極顯著負相關(guān)(表3)。

表3 密碼子使用參數(shù)的相關(guān)性分析

3 討論

塊菌是一類生長在地下的珍稀野生藥食兼用的大型真菌，具有極高的營養(yǎng)保健價值。國際市場上塊菌售價昂貴，尤其受歐美地區(qū)消費者青睞，目前塊菌還無法完全實現(xiàn)人工栽培，隨著塊菌需求越來越高，塊菌遭到惡性采摘，產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境破壞嚴(yán)重。針對塊菌地理分布和營養(yǎng)成分開展了大量研究?；蚪M密碼子使用性研究對于塊菌品種選育和栽培機制研究具有重要意義。鑒于多個塊菌物種的基因組已被發(fā)布，本研究通過分析黑孢塊菌、白塊菌和波氏塊菌基因密碼子使用特征，發(fā)現(xiàn)3種塊菌基因組密碼子使用模式具有較高的相似度，均僅有一二十個基因ENC值小于35，基因表達潛力較低，基因密碼子使用偏性不強。與白塊菌相比，黑孢塊菌密碼子使用性更接近波氏塊菌。3種塊菌編碼基因G/C使用比例高于A/T。研究發(fā)現(xiàn)，藥用真菌豬苓()基因平均GC含量為58.0%，蛹蟲草()核基因GC含量高達59.35%，與塊菌結(jié)果一致，而雙孢蘑菇()和專性寄生真菌落葉松-楊柵銹菌(-)基因平均GC含量和GC3s小于AT含量和AT3s。不同真菌基因組堿基構(gòu)成與密碼子使用偏性差異，可能與物種進化過程所受的選擇壓力和環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)。

密碼子優(yōu)化可提高基因的轉(zhuǎn)錄水平，是異源蛋白質(zhì)高效表達的重要方式。最優(yōu)密碼子的研究是實現(xiàn)密碼子優(yōu)化的基礎(chǔ)。3種塊菌基因組密碼子RSCU取值范圍為0.5～1.5，大部分基因同義密碼子RSCU值相差較小，雖然均含有30個以上的高頻密碼子，但高頻密碼子的RSCU值并不高。3種塊菌最優(yōu)密碼子的選擇具有相似之處，均偏好G/C結(jié)尾的密碼子，含有14個共有最優(yōu)密碼子，但ΔRSCU值均偏小，均有一定比例的A/T結(jié)尾的最優(yōu)密碼子，表明其密碼子使用性偏性不強。雙孢蘑菇14個最優(yōu)密碼子以C/T結(jié)尾，豬苓23個最優(yōu)密碼子多以G/C結(jié)尾，而蛹蟲草16個最優(yōu)密碼子均以G/C結(jié)尾。不同真菌最優(yōu)密碼子的偏好性顯示出較高多樣性，其形成因素可能與物種生長環(huán)境和進化壓力有關(guān)。

密碼子使用偏性形成主要受堿基突變和自然選擇壓力等因素的影響，與物種的生長環(huán)境、生存方式等因素有關(guān)，為了解物種的分子進化和環(huán)境適應(yīng)提供信息。高表達基因密碼子使用偏性主要受選擇作用影響，而低表達基因主要受堿基突變影響。繪圖分析顯示，3種塊菌大部分基因遠離ENC-plot曲線，偏離PR2-plot中心點，GC12和GC3顯著相關(guān)，但擬合優(yōu)度值較低，表明塊菌密碼子使用偏性形成主要受選擇壓力影響，少數(shù)基因主要受堿基突變影響。對應(yīng)性分析顯示，3種塊菌密碼子使用性的主要影響因素與GC堿基含量有關(guān)，該結(jié)果與繪圖分析均表明翻譯選擇等多種因素影響了密碼子使用偏性形成。相關(guān)性分析顯示，黑孢塊菌第一軸與ENC呈極顯著負相關(guān)，而與Fop呈極顯著正相關(guān)，表明翻譯選擇是影響黑孢塊菌密碼子偏性的主要因因素。白塊菌第一軸與黑孢塊菌結(jié)果正相反，表明非翻譯選擇等其他因素影響了白塊菌的密碼子偏性。波氏塊菌影響因素與白塊菌類似，但其第二軸代表了翻譯選擇因素對密碼子偏性的影響?？傊?，3種塊菌物種相比，黑孢塊菌密碼子偏性主要受翻譯選擇壓力影響，其次為白塊菌，波氏塊菌受選擇壓力影響相對較弱。3種塊菌密碼子使用偏性形成與雙孢蘑菇、蛹蟲草、豬苓等大型真菌主要受選擇壓力影響類似，而與病原菌落葉松-楊柵銹菌主要受突變壓力不同。