李燁榮，呂娟，王玉國，譚建新，邵彬彬，張菁菁

應(yīng)用多重競爭性PCR聯(lián)合毛細管電泳技術(shù)進行脊髓性肌萎縮癥攜帶者篩查

李燁榮，呂娟，王玉國，譚建新，邵彬彬，張菁菁

南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院(南京市婦幼保健院)遺傳醫(yī)學(xué)中心, 南京 210004

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy, SMA)是一種常染色體隱性遺傳、兒童致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。SMA致病基因為運動神經(jīng)元存活基因(survival motor neuron1,)。雖然檢測基因拷貝數(shù)的方法眾多，但目前適于大規(guī)模人群篩查的技術(shù)較少。為尋求一種快速準確的實驗技術(shù)可以用于人群中SMA攜帶者的大規(guī)模篩查，了解區(qū)域人群攜帶情況及常見變異的分布，本研究應(yīng)用多重競爭性PCR聯(lián)合毛細管電泳技術(shù)檢測12例SMA患者及其父母基因拷貝數(shù)，同時對江蘇地區(qū)151例健康孕婦人群基因進行拷貝數(shù)檢測，并通過多重連接依賴探針擴增(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)技術(shù)驗證檢測結(jié)果。多重競爭性PCR聯(lián)合毛細管電泳技術(shù)結(jié)果與MLPA結(jié)果一致，顯示12例SMA患者均為基因零拷貝，其父母的基因拷貝數(shù)均為單拷貝，151例健康人群中檢測出基因單拷貝3例(即SMA攜帶者)，占2.0%；基因雙拷貝134例，占88.7%；基因大于雙拷貝14例，占9.3%。因此，多重競爭性PCR聯(lián)合毛細管電泳技術(shù)作為一種快速、簡便和準確的檢測技術(shù)具有著應(yīng)用于人群中SMA攜帶者的大規(guī)模篩查的潛力。

脊髓性肌萎縮癥；多重競爭性PCR聯(lián)合毛細管電泳技術(shù)；基因；攜帶者篩查

脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy, SMA)指一類由于脊髓運動神經(jīng)元變性導(dǎo)致的進行性、對稱性近端骨骼肌無力和萎縮的一組疾病。其發(fā)病率為1/5000～1/10,000，屬常染色體隱性遺傳病，人群中的攜帶率為1/35～1/85[1]。

SMA致病基因為運動神經(jīng)元存活基因(survival motor neuron ,)，定位于染色體5q11.2-5q13.3區(qū)域，基因有兩個高度同源的和基因，兩者編碼區(qū)僅在外顯子7上相差1個堿基，同源性>99%?；蚓幋a有功能的全長SMN蛋白，而基因僅能表達少量(大約10%～20%)全長且有正常功能的SMN蛋白[2]，所以基因為SMA的致病基因，而基因作為修飾基因與SMA表型的嚴重程度相關(guān)[3]。SMA的發(fā)生90%～95%是由于基因的純合缺失導(dǎo)致，而3%～5%是由于基因點突變和部分缺失的復(fù)合雜合突變導(dǎo)致[4]。因此，對基因進行拷貝數(shù)檢測是SMA分子診斷和篩查的首選策略[5]。

雖然目前檢測基因拷貝數(shù)的方法眾多[6～10]，但是適于大規(guī)模人群篩查的技術(shù)較少，臨床上應(yīng)用較多的是多重連接依賴探針擴增技術(shù)和熒光定量PCR技術(shù)。本研究擬采用一種多重競爭性PCR聯(lián)合毛細管電泳技術(shù)檢測基因的拷貝數(shù)，該技術(shù)既能檢測及基因的拷貝數(shù)，同時對基因可能存在部分外顯子(如E1～E4，E6～E8)缺失給出提示，以尋求可用于人群中大規(guī)模篩查SMA攜帶者的新途徑，預(yù)防SMA患兒的出生。

1 對象與方法

1.1 樣本來源

選取南京市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心就診的12例SMA患者及其父母的樣本，同時選取2021年1月至2021年6月在南京市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心就診的表型正常的人群，對其進行SMA攜帶者篩查的宣教，其中151例自愿接受SMA攜帶者篩查，所有接受篩查的患者均簽署知情同意書。本項研究已獲得南京市婦幼保健院倫理委員會批準(寧婦倫字[2017]119號)。

1.2 外周血DNA的提取

采用外周血基因組DNA提取試劑盒(QIAGEN公司，德國)說明書提取外周血DNA，利用Nanodrop分光光度計(ThermoFisher，美國)測定DNA濃度和純度，260/280比值在1.7～2.0之間，用1×TE (pH 8.0)將DNA濃度調(diào)整至10 ng/μL后備用，檢測體系內(nèi)樣本DNA的加入量不宜過高或過低，以20 ng為宜。

1.3 多重競爭性PCR擴增

多重競爭性PCR技術(shù)聯(lián)合毛細管電泳技術(shù)主要用于多重目標基因片段的拷貝數(shù)檢測，其主要原理是通過定量合成針對每一個目標基因和每一個參照基因片段相對應(yīng)的競爭性DNA片段(競爭性DNA片段與各自對應(yīng)的基因片段僅有2～3 bp差別)，然后取一定量的競爭性DNA片段混合物與適量的待測樣本DNA混合，利用兩者僅有序列上微弱的差異，可以共用同一對引物進行擴增[11,12]，因此在同一反應(yīng)體系對競爭性DNA和待測樣本DNA的目標基因和參照基因共同擴增，由此實現(xiàn)在其他反應(yīng)條件一致下，競爭性DNA和待測樣本DNA競爭性擴增，且擴增效率接近一致，擴增產(chǎn)物量的比值就反應(yīng)初始模板拷貝數(shù)差異，擴增產(chǎn)物經(jīng)熒光毛細管電泳后根據(jù)擴增長度差異進行分離，獲取不同基因片段的檢測樣本峰(S)以及競爭性DNA峰(C)的峰高值，通過數(shù)據(jù)內(nèi)部標化，最后進行拷貝數(shù)分析(原理示意圖見圖1)。

參照文獻[13～16]設(shè)計用于檢測基因拷貝數(shù)的引物：(1)針對外顯子7(C)、外顯子8(G)及外顯子7(T)、外顯子8(A)上的特異堿基設(shè)計特異擴增引物對；(2)針對和基因分別設(shè)計7對和3對特異引物用于檢測拷貝數(shù)；(3)針對參照區(qū)段2p、20q、10p、16p設(shè)計對應(yīng)參照引物；(4)針對待測基因設(shè)計帶有通用熒光(5/6羧基熒光素，F(xiàn)AM)的引物(表1)。實驗包括若干檢測樣本、1個參照樣本和1個空白對照。單個樣本需同時進行2個PCR反應(yīng)(panel1和panel2，具體基因及擴增片段信息見表2)，每個反應(yīng)20 μL，包含2×PCR緩沖液G 10 μL，DNA聚合酶0.3 μL，PCR引物混合液2003 (或2004) 1 μL，1×競爭DNA混合液4003 (或4004) 2 μL(包含的每個競爭性DNA片段的DNA量為20 ng)，雙蒸水4.7 μL，模板DNA 2.0 μL。反應(yīng)體系配置完成后，振蕩均勻，2000 r/min 離心10 s，再放入基因擴增儀，按以下PCR程序進行擴增：98℃ 5 min→(94℃ 20 s, 64℃每個循環(huán)減少0.5℃ 40 s，72℃ 1 min)7 個循環(huán)→(94℃ 20 s, 60℃ 30 s, 72℃ 1 min) 28個循環(huán)→60 ℃ 30 min→4℃ 保存。

圖1 多重競爭性PCR技術(shù)聯(lián)合毛細管電泳技術(shù)原理圖

表1 PCR擴增的基因片段及引物序列

紅色堿基是額外添加的堿基，其作用為調(diào)整PCR產(chǎn)物長度便于毛細管電泳。

1.4 擴增產(chǎn)物熒光毛細管電泳分離

依次吸取每個樣本的Panel1和Panel2各0.75 μL PCR產(chǎn)物一同加入9 μL 500LIZ?標準品/Hi-Di混合液(0.1 μL /8.9 μL)中，震蕩混勻后，95℃ 5 min變性后放入ABI3500基因分析儀(ThermoFisher，美國)。

1.5 數(shù)據(jù)讀取及分析

通過GeneMapper軟件讀取原始數(shù)據(jù)，設(shè)置相應(yīng)參數(shù)后(SMAF1008 Panels/SMAF1008_STR_bins/ GS500LIZ(From75)等)，核對峰型圖并導(dǎo)出位點信息。通過GeneMapper得到參照基因片段和目標基因片段的檢測樣本峰(S)和與之對應(yīng)的競爭性DNA峰(C)的峰高值，分析每個基因片段的S/C峰高比值(稱R值)，然后將目標基因R值除以參照基因R值獲得RR值(用于校正不同檢測樣本DNA用量差異)，通過將檢測樣本的RR值除以參照樣本的RR值(用于校正不同基因片段對應(yīng)競爭性DNA的用量差異)后再乘以參照樣本在該目標基因上的拷貝數(shù)，即可獲得目標基因的精確拷貝數(shù)，計算公式如下，對每個樣本的拷貝數(shù)檢測數(shù)據(jù)，本研究會給出一個數(shù)據(jù)質(zhì)量(QC)評估信息：對于0.00～0.20判讀為0拷貝，0.80～1.20判讀為1拷貝，1.70～2.30判讀為2拷貝，2.70～3.30判讀為3拷貝，3.60～4.40判讀為4拷貝。

1、1：檢測樣本中目標基因的檢測樣本峰、競爭性DNA峰；0、0：檢測樣本中參照基因的檢測樣本峰、競爭性DNA峰；1-1、1-1：參照樣本中目標基因的檢測樣本峰、競爭性DNA峰；0-0、C0-0：參照樣本中參照基因的檢測樣本峰、競爭性DNA峰。

1.6 多重連接依賴探針擴增技術(shù)

本研究采用的是多重連接依賴探針擴增(mul-tiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA) P021 試劑盒(MRC-Holland公司，荷蘭)對基因E7、E8外顯子及基因E7、E8外顯子進行拷貝數(shù)驗證。MLPA的每一個探針都包含2個寡核苷酸片段，分別為一段引物序列和一段特異性序列，這2個寡核苷酸片段與DNA靶序列雜交，通過軟件分析擴增峰的降低、升高來判斷靶序列的拷貝數(shù)缺失和重復(fù)。具體操作步驟如下：(1)DNA變性及雜交：稀釋樣本濃度至20 ng/μL，于98℃變性5 min，降至25℃加入探針后60℃雜交16 h；(2)連接反應(yīng)：待PCR儀降至54℃時加入32 μL連接酶混合液，54℃孵育15 min，98℃變性5 min后使連接酶失活；(3) PCR擴增反應(yīng)：取10 μL連接產(chǎn)物，加入已配制好的PCR混合液(熒光引物、DNA聚合酶、緩沖液和雙蒸水)，反應(yīng)體系為50 μL，進行PCR反應(yīng)：95℃變性30 s，62℃退火35 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35次，再72℃延伸20 min，25℃保溫；(4)毛細管電泳：取1.0 μL PCR產(chǎn)物，加入8.5 μL Hi-Di甲酰胺(ThermFisher，美國)及0.5 μL LIZ-500Marker (ThermFisher，美國)，產(chǎn)物通過ABI3500基因分析儀(ThermFisher，美國)進行檢測；(5)數(shù)據(jù)分析：得到的數(shù)據(jù)用Coffalyser V8.0軟件分析(http://www. mlpa.com/coffalyser)。應(yīng)用Excel軟件進行Ratio值的均數(shù)的計算。Ratio值<0.7時結(jié)果判讀為缺失，0.7≤Ratio值<1.3時判讀為正常，1.3≤Ratio值時判讀為重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重競爭性PCR聯(lián)合毛細管電泳技術(shù)數(shù)據(jù)分析

所有樣本經(jīng)過多重競爭性PCR聯(lián)合毛細管電泳技術(shù)方法檢測，通過計算所有樣本的基因拷貝數(shù)結(jié)果，進行統(tǒng)計分析獲得基因為0～4拷貝的QC (數(shù)據(jù)質(zhì)量)值分布情況(表3，圖2)，其中單拷貝與雙拷貝2個標準偏差之差為0.65，3個標準偏差之差值為0.48。所有QC值組內(nèi)變異系數(shù)均小于10%。所有樣本QC值對應(yīng)的基因拷貝數(shù)與MLPA分析結(jié)果一致。

2.2 12例SMA患者及其父母的SMN1、SMN2基因型結(jié)果

通過多重競爭性PCR聯(lián)合毛細管電泳檢測技術(shù)分析檢測12例SMA患者及其父母的樣本，檢測結(jié)果顯示12例SMA患者基因均為零拷貝(圖3，A和E；B為其標準對照)，基因為2拷貝的為5例、3拷貝的為7例，其父母的基因拷貝數(shù)均為單拷貝(圖3，C和F；D為其標準對照)，基因為零拷貝有1例、單拷貝的有5例、雙拷貝的有13例及3拷貝的有5例。通過多重競爭性PCR聯(lián)合毛細管電泳技術(shù)分析檢測結(jié)果與MLPA法符合率達100.0%。

表3 SMN基因拷貝數(shù)的QC值分布情況

圖2 SMN基因QC值分布

3.3 151例本地人群樣本SMN1、SMN2基因型結(jié)果

在151例本地人群中，基因拷貝數(shù)為1的有3例，攜帶者頻率為2.0%；雙拷貝的134例，占88.7%；大于雙拷貝的14例，占9.3%，不同拷貝數(shù)對應(yīng)的拷貝數(shù)結(jié)果見表4。其結(jié)果與MLPA法檢測結(jié)果一致。

圖3 1例SMA患者及1例SMA攜帶者的基因型

R-：競爭性DNA片段；A，B：1例SMA患者及標準對照的基因型原始峰圖；C，D：1例SMA攜帶者及標準對照的基因型原始峰圖；E：該例SMA患者的基因型柱形圖：SMA患者的基因型為(E7 E8)=0、(E7 E8)=2、(US E2a E2b E4 E5 E6 DS)=2、(E4I E4II E5)=1；F：該例SMA攜帶者的基因型柱形圖：SMA攜帶者的基因型為(E7 E8)=1、(E7 E8)=1、(US E2a E2b E4 E5 E6 DS)=2、(E4I E4II E5)=1。

表4 151例人群樣本的SMN1及SMN2基因拷貝數(shù)

3 討論

SMA是一種常見的致死性神經(jīng)肌肉遺傳病，根據(jù)發(fā)病年齡和進程將SMA分為四種類型[17]：I型(嬰兒型)、II型(中間型)、III型(少年型)和IV型(成年型)。I型病情最嚴重，約占總病例的45%，一般于出生后6月內(nèi)發(fā)病，大多數(shù)患兒在2歲內(nèi)死于呼吸衰竭。II型約占40%，于出生后6～18個發(fā)病，患兒表現(xiàn)為能坐但無法站立和行走，生存期取決于呼吸肌麻痹程度，一般超過2歲。III型和IV型屬于輕型，對生存期無明顯影響。SMA病情嚴重，人群中攜帶率高且致病基因較明確，根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(American College of Medical Genetics, ACMG)[18]、美國婦產(chǎn)科學(xué)會(American College of Obstetricians and Gynecologists, ACOG)[19]建議，應(yīng)對所有育齡人群進行SMA攜帶者篩查。早在2011年中國臺灣地區(qū)已為當?shù)?0萬余人進行SMA攜帶者篩查[20]，而大陸地區(qū)的大樣本量篩查起步較晚，但近幾年已有多篇文獻報道各個省及地區(qū)的攜帶者篩查情況[21～24]，SMA篩查已逐步成為臨床常規(guī)篩查項目。

目前臨床常用檢測SMA拷貝數(shù)的方法包括MLPA和熒光定量PCR技術(shù)。MLPA技術(shù)是一種高效、特異的基因檢測技術(shù)，不僅可對基因的拷貝數(shù)缺失定性檢測，還可對待測靶點拷貝數(shù)進行半定量分析，檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，但其試劑、儀器等耗材價格昂貴、非國產(chǎn)化，并且操作步驟多、檢測時間長、對技術(shù)人員的技術(shù)能力要求較高等缺點，導(dǎo)致MLPA不適于大規(guī)模的人群篩查[25,26]。相對而言，定量PCR平臺在國內(nèi)的普及更為廣泛，現(xiàn)已成為分子篩查領(lǐng)域的重要技術(shù)。熒光定量PCR技術(shù)操作簡單，可以較快速準確的檢測出基因的第7、8號外顯子[27]，但無法檢測基因以及SMA的其他相關(guān)基因，使得臨床開展有一定的局限性[25]。鑒于MLPA及熒光定量PCR技術(shù)都存在不同的弊端，因此，迫切需要尋求一種適用于中國人群的SMA攜帶者篩查的技術(shù)體系，既能同時檢測和基因的拷貝數(shù)，又能達到技術(shù)簡便、快速、有效且成本較低，能適于大規(guī)模人群篩查的目的。

本研究采用多重競爭性PCR聯(lián)合毛細管電泳技術(shù)檢測基因的拷貝數(shù)，因脊髓性肌萎縮癥(SMA)的致病基因比較特殊，基因為致病基因，基因為修飾基因，SMA的致病95%都是因為基因外顯子7缺失導(dǎo)致，而基因外顯子7拷貝數(shù)與臨床表型相關(guān)。和基因高度同源，僅在外顯子7上相差1個堿基(c.840C>T)，所以本研究在設(shè)計引物時都會跨越這個唯一不同的堿基區(qū)域以區(qū)分基因和基因，這也是目前應(yīng)用的MLPA和定量PCR引物或探針設(shè)計時遵循的原則[28,29]。該方法通過一定量的競爭性DNA片段混合物(每個競爭性DNA片段與各自對應(yīng)基因片段通常僅有2～3bp差別)與適量的檢測樣本DNA混合，反應(yīng)體系通過擴增和毛細管電泳，得到檢測樣本及競爭性DNA片段的參照基因和目標基因峰高值，通過對檢測樣本峰與競爭性DNA峰間進行校正、與參照樣本比對，使結(jié)果更加可靠準確，最后直接得出待檢基因相應(yīng)的拷貝數(shù)。該方法不僅檢測位點范圍更廣，相對于熒光定量PCR僅能檢測的E7E8位點，還增加了E7E8和(包括E4和E5)位點，同時可以檢測其余7個位于同源區(qū)的位點，即(USE2aE2bE4E5E6DS)，其對應(yīng)拷貝數(shù)理論上為“”，可輔助判讀；而且該方法操作簡單，僅需進行PCR和毛細管電泳，檢測周期短，實驗用時遠遠少于為MLPA技術(shù)，分析過程經(jīng)過多重校正與比較，相對提高其結(jié)果的準確性和可重復(fù)性，并且其檢測結(jié)果通過柱形圖判讀，簡便直觀(表5)。

本研究對12例SMA患者及其父母，以及151例人群樣本進行和基因拷貝數(shù)檢測，結(jié)果均與MLPA技術(shù)結(jié)果一致，評估該技術(shù)對SMA相關(guān)基因拷貝數(shù)檢測的準確性。檢測結(jié)果顯示12例SMA患者的基因均為0拷貝，其父母均為基因單拷貝，即為SMA攜帶者；對自愿接受SMA攜帶者篩查的表型正常的人群151例進行檢測，結(jié)果顯示，基因單拷貝的有3例，攜帶者頻率為2.0%，與之前關(guān)于中國人群SMA致病基因攜帶者頻率的報道相近[30]；雙拷貝的134例，占88.7%；大于雙拷貝的14例，占9.3%，所有結(jié)果與MLPA結(jié)果一致。

表5 多重競爭性PCR聯(lián)合毛細管電泳技術(shù)、MLPA和熒光定量PCR技術(shù)特點對比

本研究旨在采用一種快速準確的實驗技術(shù)可以用于人群中SMA攜帶者的大規(guī)模篩查，了解區(qū)域人群攜帶情況及常見變異的分布，同時也為構(gòu)建適合中國人群SMA攜帶者篩查的技術(shù)體系提供研究基礎(chǔ)。從以上研究結(jié)果看來，該方法不僅具有成本低廉、操作步驟簡單、結(jié)果判讀簡便直觀等優(yōu)勢，同時其敏感性和特異性高，有潛力應(yīng)用于人群中SMA的大規(guī)模篩查，但仍需進一步擴大樣本量以評估該方法在大樣本篩查中的應(yīng)用。此外，該方法也有其局限性，對于人群中少見的“2+0”型攜帶者及其他點突變患者無法檢出，還需進行連鎖分析或測序分析等檢測確定。選擇適合人群中SMA大規(guī)模篩查的技術(shù)方法并對高危夫婦進行生育指導(dǎo)，及早進行產(chǎn)前診斷或植入前診斷，就可以有效防止SMA患兒的出生，有效降低SMA的發(fā)病率，對提高我國人口素質(zhì)有重要意義。

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Application of multiplex competitive PCR combined with capillary electrophoresis in carrier screening of spinal muscular atrophy

Yerong Li, Juan Lv, Yuguo Wang, Jianxin Tan, Binbin Shao, Jingjing Zhang

Spinal muscular atrophy (SMA) is an autosomal recessive, fatal neurological disorder in children. The pathogenic gene of SMA is survival motor neuron1 (). There are many methods to detectgene copy number, but few techniques are suitable for large-scale population screening. In order to find a rapid and accurate experimental technique for mass screening of SMA carriers in the population, thegene copy number of 12 SMA patients and their parents was analyzed by multiplex competitive PCR combined with capillary electrophoresis. Meanwhile, the copy number ofgene in 151 healthy pregnant women in Jiangsu was screened with the MLPA technology to confirm their copy number of thegenes. The results showed that the 12 SMA patients had 0 copy ofgene, and all their parents had 1 copy ofgene only. Among 151 healthy subjects, 3 cases (2.0%) had 1 copy ofgene, and hence designated as SMA carriers. One hundred and thirty-four cases (88.7%) had 2 copies of thegene. There were 14 cases (9.3%) with more than 2 copies of thegene. Therefore, multiplex competitive PCR combined with capillary electrophoresis is a rapid, simple and accurate method for the detection of SMA carriers; and potentially applicable to mass screening of SMA carriers in the population.

spinal muscular atrophy; multiplex competitive PCRcombined with capillary electrophoresis;gene; carrier screening

2022-03-29;

2022-05-13;

2022-06-01

國家自然科學(xué)基金項目(編號：82001612)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.82001612)]

李燁榮，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：婦產(chǎn)科學(xué)，優(yōu)生學(xué)。E-mail: lyr15835364548@163.com

張菁菁，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：婦產(chǎn)科學(xué)，優(yōu)生學(xué)。E-mail: 18913384682@163.com

10.16288/j.yczz.22-042

(責(zé)任編委: 盧大儒)