楊 玲， 查 晴， 張倩茹， 葉佳雯， 楊 克， 劉 艷

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200011；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200025）

鈣化性主動(dòng)脈瓣膜病（calcific aortic valve disease，CAVD）作為常見(jiàn)的心血管疾病，其主要以主動(dòng)脈瓣膜及其周圍組織發(fā)生纖維化、硬化、鈣鹽沉積為特征[1-2]，并逐漸進(jìn)展為主動(dòng)脈瓣膜狹窄（aortic stenosis），而嚴(yán)重狹窄可致主動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué)改變，并引起左心室超負(fù)荷，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。主動(dòng)脈瓣膜硬化（aortic valve sclerosis）是CAVD的亞臨床表現(xiàn)，是一種無(wú)癥狀的主動(dòng)脈瓣增厚和鈣化，沒(méi)有血流動(dòng)力學(xué)改變[3]。CAVD的患病率逐年上升，據(jù)估計(jì)，在美國(guó)65歲以上的人群中有25%～30%存在主動(dòng)脈瓣膜硬化，并以每年2%的速度發(fā)展為主動(dòng)脈瓣膜狹窄[4-5]。雖然，針對(duì)主動(dòng)脈瓣膜硬化的診斷可通過(guò)臨床影像學(xué)方法，但影像學(xué)對(duì)疾病較早期患者預(yù)測(cè)價(jià)值較差，若能在較早期預(yù)測(cè)CAVD患者，將為臨床醫(yī)師提供更好的疾病預(yù)防和管理指導(dǎo)。為提供早期及時(shí)的診斷，新興生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)為CAVD的風(fēng)險(xiǎn)分層和干預(yù)時(shí)機(jī)提供了一種潛在的補(bǔ)充方法[6]。有文獻(xiàn)根據(jù)既往的研究結(jié)果，總結(jié)了可用于預(yù)測(cè)CAVD的嚴(yán)重程度、進(jìn)展和預(yù)后價(jià)值的潛在生物標(biāo)志物，如胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）、骨 橋 蛋 白(osteopontin,OPN)、瘦素（leptin）、胎球蛋白（fetuin A）等[7]。本文旨在探究GLP-1、OPN和CAVD的關(guān)系，并基于此設(shè)計(jì)一種預(yù)測(cè)模型，用于預(yù)測(cè)CAVD。

資料和方法

一、一般資料

選取2012年1月至2014年8月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院（瑞金醫(yī)院）心內(nèi)科住院患者（n=816），排除具有急性期感染（n=48）、風(fēng)濕性心臟瓣膜?。╪=10）、既往行主動(dòng)脈瓣置換術(shù)（n=33）、原發(fā)性心肌?。╪=35）、感染性心內(nèi)膜炎（n=10）、惡性腫瘤（n=22）、先天性心臟?。╪=16）、自身免疫性疾?。╪=14）、正在接受抗骨質(zhì)疏松治療（n=17）、估算的腎小球?yàn)V過(guò)率（estimate glomerular filtration rate，eGFR）＜30 mL/（min·1.73 m2）（n=30）、沒(méi)有心臟超聲影像學(xué)數(shù)據(jù)（n=51）、病史資料不全（n=55）和拒絕進(jìn)入研究（n=29）患者，最后共納入患者446例，通過(guò)SPSS20.0將患者按簡(jiǎn)單隨機(jī)法分為篩查隊(duì)列（n=202）和驗(yàn)證隊(duì)列（n=244）。CAVD被定義為不透明小葉，超聲提示主動(dòng)脈瓣瓣膜局部區(qū)域增厚或回聲增強(qiáng)，伴或不伴有經(jīng)主動(dòng)脈瓣流速峰值升高（≥2 m/s）[8]。本研究方案經(jīng)瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，且所有患者簽署知情同意書(shū)，倫理批準(zhǔn)書(shū)編號(hào)為（2016）臨倫審第（58）號(hào)。

二、臨床資料采集

收集2個(gè)隊(duì)列患者的臨床資料，包括年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙和飲酒基本資料，既往是否有高血壓、糖尿病、冠心?。╟oronary heart disease,CAD）病史，以及空腹血糖、總膽固醇 （total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇 （low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇 （high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（creatinine，Cr）、eGFR等實(shí)驗(yàn)室檢查數(shù)據(jù)，降糖藥物使用情況及他汀類藥物使用情況。

三、樣本采集及生物標(biāo)志物檢測(cè)

所有受試者采集空腹靜脈血，并使用乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）抗凝。4℃1 500×g離心15 min，分離并收集血漿于-80℃冰箱中保存待用。血漿標(biāo)本通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清GLP-1（美國(guó)Abcam公司）及OPN（美國(guó)Abcam公司）濃度。檢測(cè)流程嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

四、年齡及性別分組

將研究人群按照性別分為男性組和女性組，按年齡分為青中年組（年齡＜65歲）和老年組（年齡≥65歲）2組，測(cè)試生物標(biāo)志物模型對(duì)不同性別和年齡組的預(yù)測(cè)能力。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0及R語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。應(yīng)用Kolmogorov-Smirnov/Shapiro-Wilk檢驗(yàn)及直方圖對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)分布計(jì)量資料采用±s表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)、四分位間距[M（Q1，Q3）]表示，計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示。正態(tài)分布計(jì)量資料組間差異比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布計(jì)量資料組間差異比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)Mann-Whitney U檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間差異采用2×2χ2檢驗(yàn)。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在篩查隊(duì)列中，采用SPSS 20.0中的二元Logistic回歸（向前選擇法）分析GLP-1、OPN以及各臨床指標(biāo)和CAVD之間的關(guān)系，確定納入模型的變量，再通過(guò)R語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)軟件，采用二元Logistic回歸構(gòu)建預(yù)測(cè)CAVD模型，并繪制Nomogram列線圖。采用受試者工作特征（receiver-operating characteristic，ROC）曲線分析評(píng)價(jià)模型在篩查隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中的的區(qū)分能力，計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC），此值與C統(tǒng)計(jì)量相當(dāng)[9]。在篩查隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中行Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)評(píng)估模型的一致性（P＞0.05視為模型擬合良好），并繪制校準(zhǔn)曲線[10]。

結(jié) 果

一、2隊(duì)列臨床基本特征

篩查隊(duì)列的202例患者中，CAVD患者共103例（51.0%），非CAVD患者99例（49.0%）。相比于非CAVD組，CAVD組年齡大、CAD患者占比高，BUN、Cr更高，而eGFR、GLP-1、OPN低（均P＜0.05）。性別、BMI、吸煙、飲酒、GGT、TC、TG、LDL-C、HDLC、空腹血糖、糖尿病及高血壓2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表1）。驗(yàn)證隊(duì)列244例患者中，CAVD患者共119例（48.8%），非CAVD患者125例（51.2%），與非CAVD組相比較，CAVD組除年齡大、CAD患者占比高，BUN、Cr更高，eGFR、GLP-1、OPN低（均P＜0.05）外，CAVD組TC、TG、LDL-C、HDL-C顯著低于非CAVD組（均P＜0.05），高血壓患者占比高（P＜0.05）；而性別、BMI、吸煙、飲酒、GGT、空腹血糖、糖尿病差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表2）。

表2 驗(yàn)證隊(duì)列患者臨床基本資料[±s/n（%）/M（Q1，Q3）]

表2 驗(yàn)證隊(duì)列患者臨床基本資料[±s/n（%）/M（Q1，Q3）]

指標(biāo) 非CAVD（n=125） CAVD（n=119） t/U/χ2 P男性[n（%）] 69（55.2） 71（59.7） 0.497 0.481年齡(歲) 59.26±9.32 74.08±7.92 -13.357 0.000 BMI（kg/m2) 24（23，27） 25（23，28） -1.090 0.276飲酒[n（%）] 15（12.0） 7（5.9） 2.781 0.095吸煙[n（%）] 42（33.6） 27（22.7） 3.578 0.059 GGT（U/L） 20（14，33） 21（14，30） -0.147 0.883 TG（mmol/L） 1.44（1.12，2.08） 1.21（0.94，1.77） -3.213 0.001 TC（mmol/L） 4.20±1.02 3.81±1.10 2.885 0.004 HDL-C（mmol/L） 1.09（0.92，1.29） 1.04（0.91，1.19） -1.992 0.046 LDL-C（mmol/L） 2.35（1.82，3.08） 2.07（1.65，2.76） -2.390 0.017空腹血糖（mmol/L） 4.82（4.49，5.59） 4.94（4.55，5.86） -0.682 0.495 BUN（mmol/L） 5.1（3.9，6.1） 5.9（4.7，7.0） -3.451 0.000 Cr（μmol/L） 72（62，85） 82（69，96） -3.967 0.000 eGFR[mL/（min·1.73m2）] 87.71±28.09 62.62±18.19 8.237 0.000糖尿病[n（%）] 40（32.0） 33（27.7） 0.530 0.467高血壓[n（%）] 78（62.9） 91（76.5） 5.278 0.022 CAD[n（%）] 93（74.4） 104（87.4） 6.620 0.010降糖藥物治療[n（%）] 24（19.2） 15（12.6） 1.974 0.160他汀類藥物[n（%）] 109（87.2） 94（79.0） 2.938 0.087 GLP-1（ng/L） 14.58（9.82，18.74） 11.82（7.62，15.96） -3.108 0.003 OPN（ng/L） 5 242.36（3 732.77，6799.75） 3 941.64（1 469.97，7067.90） -2.937 0.003

二、血清生物標(biāo)志物與CAVD相關(guān)性分析

2隊(duì)列中相較于非CAVD組，GLP-1和OPN濃度在CAVD組均顯著性降低（P＜0.01）（見(jiàn)表1、2）。在篩查隊(duì)列中，Logistic回歸分析顯示，年齡、吸煙、HDL-C、GLP-1及OPN與CAVD發(fā)病顯著相關(guān)（均P＜0.05）（見(jiàn)表3）。因此，將HDL-C、GLP-1及OPN這3個(gè)血清標(biāo)志物作為構(gòu)建預(yù)測(cè)CAVD生物標(biāo)志物模型的變量。

表1 篩查隊(duì)列患者臨床基本資料[±s/n（%）/M（Q1，Q3）]

表1 篩查隊(duì)列患者臨床基本資料[±s/n（%）/M（Q1，Q3）]

指標(biāo) 非CAVD（n=99） CAVD（n=103） t/U/χ2 P男性[n（%）] 54（54.5） 64（62.1） 1.197 0.274年齡（歲） 60.19±8.24 73.44±7.65 -11.845 0.000 BMI（kg/m2） 24（22，26） 25（23，27） -1.366 0.172飲酒[n（%）] 14（14.1） 11（10.7） 0.558 0.455吸煙[n（%）] 24（24.2） 26（25.2） 0.027 0.869 GGT（U/L） 19（13，35） 21（16，28） -0.819 0.413 TG（mmol/L） 1.48（1.15，2.10） 1.43（1.02，2.14） -0.612 0.541 TC（mmol/L） 4.04±1.13 4.02±1.22 -0.119 0.906 HDL-C（mmol/L） 1.14（0.94，1.33） 1.08（0.90，1.24） -1.670 0.191 LDL-C（mmol/L） 2.34（1.72，2.77） 2.42（1.76，2.92） -0.479 0.584空腹血糖（mmol/L） 5.1（4.57，5.84） 5.1（4.70，5.90） -0.053 0.958 BUN（mmol/L） 5.0（4.2，5.7） 5.6（4.5，6.7） -2.647 0.008 Cr（umol/L） 73（63，84） 82（71，97） -4.162 0.000 eGFR[mL/（min·1.73m2）] 85.69±21.22 65.50±23.69 6.370 0.000糖尿病[n（%）] 35（35.4） 33（32.0） 0.248 0.618高血壓[n（%）] 66（66.7） 79（76.7） 2.508 0.113 CAD[n（%）] 65（65.7） 88（85.4） 10.750 0.001降糖藥物治療[n（%）] 16（16.2） 13（12.6） 0.515 0.473服用他汀類藥物[n（%）] 75（75.8） 88（85.4） 3.036 0.081 GLP-1（ng/L） 14.6（9.43，20.50） 11.14（7.68，13.84） -3.543 0.000 OPN（ng/L） 5 374.07（4 248.37，7 030.09） 4 391.5（1 496.13，7 436.65） -2.650 0.008

表3 二元Logistic回歸分析各臨床變量及生物標(biāo)志物與CAVD間關(guān)系

考慮到OPN的比值比（odds ratio，OR）值接近于1，將OPN根據(jù)其濃度按值升序分為十等分，使其由計(jì)量資料轉(zhuǎn)換為有序分類資料納入模型。

三、基于生物標(biāo)志物及臨床變量的CAVD預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建及驗(yàn)證

在篩查隊(duì)列中，根據(jù)已經(jīng)得到的3個(gè)變量，采用二元Logistic回歸構(gòu)建預(yù)測(cè)CAVD模型，并繪制Nomogram列線圖（見(jiàn)圖1）。如圖2A和B所示，模型在篩查隊(duì)列及驗(yàn)證隊(duì)列均具有良好的鑒別能力，在篩查隊(duì)列中C統(tǒng)計(jì)量為0.73[95%置信區(qū)間（confidence interval,CI）：0.66～0.80]，在驗(yàn)證隊(duì)列中C統(tǒng)計(jì)量為0.70（95%CI：0.64～0.77）。Hosmer-Lemeshow檢驗(yàn)顯示，在2個(gè)隊(duì)列中模型均擬合良好（篩查隊(duì)列：P=0.14，驗(yàn)證隊(duì)列：P=0.23），并繪制校準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖2C和D），可發(fā)現(xiàn)模型在篩查隊(duì)列及驗(yàn)證隊(duì)列均具有良好的一致性。

圖1 基于生物標(biāo)志物的CAVD預(yù)測(cè)模型

圖2 生物標(biāo)志物模型對(duì)CAVD的預(yù)測(cè)評(píng)估

將GLP-1、OPN和HDL-C從相應(yīng)的濃度值向上劃一條直線到“分值”線。根據(jù)3種生物標(biāo)志物的累積分值，在列線圖的“總分值”線與“CAVD發(fā)病率”線之間畫(huà)一條向下的垂線，計(jì)算CAVD發(fā)病率。

決策曲線分析（decision curve analysis,DCA）曲線可發(fā)現(xiàn)，不論是在篩查隊(duì)列還是驗(yàn)證隊(duì)列中，新的生物標(biāo)志物模型均較臨床因素模型凈效益增加（見(jiàn)圖3A和B）。

圖3 生物標(biāo)志物模型與臨床危險(xiǎn)因素模型DCA曲線

四、年齡/性別分層比較分析

不論是篩查隊(duì)列還是驗(yàn)證隊(duì)列，生物標(biāo)志物模型在不同性別和年齡組中均表現(xiàn)良好。其中，在性別分層分析中，預(yù)測(cè)模型對(duì)男性患者具相對(duì)更好的預(yù)測(cè)能力；在年齡分層分析中，預(yù)測(cè)模型對(duì)中青年組仍具良好預(yù)測(cè)能力（見(jiàn)表4）。

表4 在年齡、性別分層組中生物標(biāo)志物模型預(yù)測(cè)CAVD表現(xiàn)

討 論

既往研究表明，CAVD臨床危險(xiǎn)因素包括性別、肥胖、高血壓、糖尿病、吸煙，其中男性、罹患高血壓、糖尿病、肥胖、吸煙史患者CAVD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更高[11]。因此，采用DCA比較新的生物標(biāo)志物模型（包括GLP-1、OPN和HDL-C）相比臨床危險(xiǎn)因素模型（包括性別、BMI、糖尿病史、高血壓史及吸煙史）在篩查隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中的凈收益[12]。年齡與CAVD發(fā)病呈現(xiàn)高度相關(guān)性，此外，研究中男性患者占比更高，既往研究也表明性別和年齡對(duì)CAVD的發(fā)生發(fā)展具有重要影響[13]。在本研究中，基于R語(yǔ)言和邏輯回歸的結(jié)合，開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種新的生物標(biāo)志物模型，包含GLP-1、OPN及HDL-C，用于預(yù)測(cè)CAVD。該模型在篩查和驗(yàn)證隊(duì)列以及不同年齡、性別組中均表現(xiàn)出良好的鑒別能力。目前對(duì)于CAVD仍缺乏敏感和特異的早期診斷和延緩進(jìn)展的方法，不少研究嘗試使用他汀類藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑來(lái)延緩CAVD進(jìn)展均以失敗而告終[14-15]。對(duì)于CAVD的治療僅限于主動(dòng)脈瓣置換術(shù)以挽救疾病嚴(yán)重階段患者，因此，需尋找新的生物標(biāo)志物并探究可能的藥理學(xué)靶點(diǎn)。本研究為CAVD早期診斷及可能的治療靶點(diǎn)提供了一種方向。

既往也有不少GLP-1、OPN、HDL與CAVD的相關(guān)性研究[16-18]，但主要集中在單個(gè)生物標(biāo)志物和CAVD之間的關(guān)聯(lián)。CAVD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程涉及多種機(jī)制參與，多因子協(xié)同評(píng)估能取得更好的效果。本研究聯(lián)合探究了GLP-1、OPN以及HDL-C和CAVD的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不論是在篩查隊(duì)列還是驗(yàn)證隊(duì)列，這三者在CAVD組的血漿水平較非CAVD組均明顯降低，而針對(duì)GLP-1和HDL-C，目前臨床上已有調(diào)節(jié)其水平相關(guān)的藥物，提高GLP-1或HDL-C水平也許能成為未來(lái)CAVD治療的藥理學(xué)靶點(diǎn)[19]。此外，本研究觀察到CAVD組OPN水平較非CAVD組降低，似乎和既往一些研究結(jié)論相反，這可能歸因于以下3點(diǎn)：①檢測(cè)的OPN濃度是血清濃度而非瓣膜中的濃度；②OPN翻譯后修飾對(duì)其生物學(xué)功能具有很大的影響[20]，而本研究檢測(cè)的是血清中的總OPN濃度，可能對(duì)結(jié)果造成一定影響；③本研究入選人群均為心血管內(nèi)科住院患者，其中大多數(shù)是CAD患者，受試者來(lái)源可能對(duì)結(jié)果造成一定影響。因此，OPN在CAVD中的作用還有待進(jìn)一步研究，在未來(lái)研究中應(yīng)該將修飾后OPN水平考慮在內(nèi)。

本研究雖然嘗試并成功構(gòu)建CAVD的生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)模型，但是該預(yù)測(cè)模型需在多中心或大樣本量人群加以驗(yàn)證，這是該疾病預(yù)測(cè)模型未來(lái)研究方向，同時(shí)也是本研究的局限性。此外，隨著CAVD臨床及基礎(chǔ)進(jìn)一步深入研究，可發(fā)現(xiàn)其他更多新型標(biāo)志物，而這些指標(biāo)的納入將進(jìn)一步完善CAVD預(yù)測(cè)模型，因此，針對(duì)新的生物標(biāo)志物的研究也是未來(lái)研究方向之一。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建并驗(yàn)證了一種預(yù)測(cè)CAVD的模型，該模型的鑒別能力和準(zhǔn)確性均表現(xiàn)良好，甚至在年輕患者中仍表現(xiàn)出了良好的預(yù)測(cè)能力，這使臨床醫(yī)師能夠早期識(shí)別高風(fēng)險(xiǎn)CAVD患者，為臨床干預(yù)時(shí)機(jī)和治療策略提供有力指征。