趙麗琴， 郭偉劍， 余諾亞， 吳珺瑋， 張 俊

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院腫瘤科，上海 200025；2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，上海 200032）

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率居第5位，死亡率居第4位[1]。而在我國，胃癌發(fā)病率顯著高于世界平均水平，發(fā)病率和死亡率均居第3位[2]。晚期胃癌患者極易出現(xiàn)惡病質(zhì)，是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因之一。惡病質(zhì)本質(zhì)上是腫瘤或腫瘤治療導(dǎo)致的代謝紊亂綜合征，目前尚無行之有效的治療方法[3]。

激活素A（activin A）是轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族中的一種分泌型細胞因子，其下游信號通路與TGF-β信號通路有相似之處。既往研究表明激活素A在胚胎發(fā)育、干細胞維持和分化、造血、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、抗腫瘤免疫等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用[4-5]，也有研究發(fā)現(xiàn)激活素A促進小鼠骨骼肌萎縮和體重下降，促進腫瘤惡病質(zhì)的發(fā)展[6]，通過靶向激活素A，可明顯抑制在太空微重力環(huán)境下小鼠骨骼肌萎縮和骨質(zhì)丟失[7]，在結(jié)直腸癌等惡性腫瘤患者中也觀察到激活素A水平與腫瘤惡病質(zhì)顯著相關(guān)[5]。

激活素A促進惡病質(zhì)發(fā)展的機制目前尚不完全清楚。通常認為某些腫瘤可分泌大量激活素A，干擾正常組織代謝，導(dǎo)致惡病質(zhì)發(fā)生、發(fā)展[3]。Ghosh等[8]發(fā)現(xiàn)，果蠅中激活素A通過調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)酶和三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶的表達，影響胰島素釋放，在糖代謝和維持酸堿穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)激活素A的重要受體2A（activin A receptor type 2A，ACVR2A）在胃癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[9]。有報道稱激活素A可抑制某些胃癌細胞系增殖，但其在胃癌轉(zhuǎn)移、糖酵解中的作用鮮見報道[10-11]。本研究旨在探索激活素A在胃癌細胞遷移和有氧糖酵解中的功能和可能的作用機制，以及激活素A編碼基因抑制素βA亞基（inhibinβA,INHBA）表達與胃癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

材料與方法

一、材料與試劑

MGC803胃癌細胞系為本課題組實驗室保存，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，該細胞系經(jīng)短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat,STR）基因型鑒定，確定為MGC803胃癌細胞。激活素A購自美國R&D Systems公司（貨號：338-AC），根據(jù)試劑說明書采用4 mmol/L HCL溶解激活素A至濃度為10 ng/μL。Transwell小室為日本康寧（Corning）公司產(chǎn)品，乳酸檢測試劑盒（貨號：K627-100）和葡萄糖攝取檢測試劑盒（貨號：K676-100）購自美國BioVision公司。磷酸化Smad2/3（phosphorylated Smad2/3,pSmad2/3）、snail、slug、波形 蛋 白 （vimentin,VIM）、N-鈣 黏 著 蛋 白（N-cadherin）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2、MMP9一抗購自美國Cell Signaling Technology公司，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIFIA）一抗購自美國Novus Biologicals公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）A、LDHB、己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）、果糖二磷酸醛縮酶A（aldolase A，ALDOA）、葡萄糖轉(zhuǎn)運體（glucose transporter,Glut）1、Glut3、Glut4一抗均購自中國武漢Proteintech公司。辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體均購自Cell Signaling Technology公司。

二、方法

1.激活素A作用濃度篩選：經(jīng)典激活素信號通路中，pSmad2/3是其下游信號通路被激活的標(biāo)志，pSmad2/3水平可反映經(jīng)典激活素信號通路激活情況。既往文獻中大多采用5～30 ng/mL的激活素A處理細胞，并研究激活素A的生物學(xué)功能[10,12-13]；本研究分別采用0、5、10、20、40、80 ng/mL等不同濃度的激活素A，處理MGC803細胞24 h后，提取細胞總蛋白，BCA（bicinchoninic acid）法測定蛋白濃度，蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting，Wb）檢測激活素A下游靶基因Smad2/3磷酸化情況，即pSmad2/3水平，若pSmad2/3明顯升高，則表明激活素A下游信號通路被激活，選取該作用濃度，開展后續(xù)的功能實驗。

2.細胞遷移能力檢測：包括Transwell小室法和劃痕實驗。①Transwell小室法：取對數(shù)生長期的MGC803細胞，分為對照組和激活素A處理組，分別用相同體積的4 mmol/L HCL和20 ng/mL的激活素A處理48 h。將2組細胞消化吹打成單細胞懸液，離心后棄上清，再用不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)細胞密度。利用康寧8μm孔徑的小室和配套的24孔板進行細胞遷移實驗，下室內(nèi)加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，上室中加入用不含血清的DMEM培養(yǎng)基重懸的MGC803細胞。2組均設(shè)置3復(fù)孔，每孔加入4萬個細胞，36 h后終止培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照，觀察2組遷移過去的細胞數(shù)目的差別。②劃痕實驗：取對照組和激活素A處理組細胞，將細胞接種到6孔板中，接種密度為過夜后融合率能達到100%。第2天用同一只無菌吸頭在2組細胞上進行劃痕，劃痕完成后，用無菌磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗細胞3次，然后更換新鮮的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，2組中繼續(xù)加4 mmol/L HCL和終濃度為20 ng/mL的激活素A處理，將細胞放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0 h、48 h后取出細胞，在顯微鏡下觀察拍照，測量劃痕的寬度，比較2組細胞劃痕愈合的速度。

3.細胞有氧糖酵解水平檢測：測定乳酸產(chǎn)生量和葡萄糖攝取量可反映細胞糖酵解水平，在有氧培養(yǎng)條件下，測定乳酸產(chǎn)生和葡萄糖攝取情況來檢測激活素A對胃癌細胞有氧糖酵解的影響。包括乳酸生成檢測和葡萄糖攝取檢測。①乳酸生成檢測：取對照組和激活素A處理組細胞，2組細胞用胰酶消化后在細胞自動計數(shù)儀上進行計數(shù)，12孔板中每孔接種8萬個細胞，每組細胞設(shè)3復(fù)孔，約6～8 h后細胞貼壁，棄去原培養(yǎng)基，每孔中換無血清培養(yǎng)基500μL，放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，從每孔中吸出培養(yǎng)基上清100μL，放入-80℃冰箱中凍融1次。采用BioVision公司的乳酸檢測試劑盒，按照試劑盒說明書操作步驟檢測培養(yǎng)基上清中的乳酸濃度。②葡萄糖攝取檢測：取對照組和激活素A處理組細胞，2組細胞用胰酶消化后在細胞自動計數(shù)儀上進行計數(shù)，將細胞接種到96孔板中，每孔接種1萬個細胞，待細胞貼壁后（約6～8 h），采用BioVision公司的葡萄糖攝取檢測試劑盒檢測2組細胞攝取葡萄糖能力的差別。

4.Wb檢測蛋白表達：采用放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液提取細胞總蛋白，將細胞置于冰上，用預(yù)冷的PBS洗細胞2次，加入適量已添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞，用細胞刮將細胞和裂解液一起刮下，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，置于冰上繼續(xù)裂解約30 min。采用BCA法對蛋白濃度進行測定，根據(jù)試劑盒說明書步驟操作，最后用已添加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液將蛋白調(diào)整至相同濃度。Wb檢測：制備10%的聚丙烯酰胺凝膠，將凝膠夾好后放入電泳槽內(nèi)，加入電泳液，向凝膠的每個孔內(nèi)加入30μg蛋白樣品，并在合適位置加入蛋白預(yù)染標(biāo)志物指示分子量，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4℃孵育過夜，再用TBST溶液洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，TBST溶液洗膜3次后，曝光顯影。

5.激活素A編碼基因INHBA在胃癌中的表達及對預(yù)后影響的分析：在基因表達譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis,GEPIA）在線平臺 （http://gepia.cancer-pku.cn/index.html）中分析INHBA與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation,EMT）、糖酵解相關(guān)基因表達的相關(guān)性，了解INHBA在胃癌組織和癌旁正常組織中表達的差異，該在線平臺的基因表達數(shù)據(jù)來源于癌癥基因組圖譜（the cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫。利用Kaplan-meier Plotter數(shù)據(jù)庫（https://kmplot.com）分析來源于基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫 （GSE14210、GSE15459、GSE22377、GSE29272、GSE51105）的593例胃癌患者和來源于TCGA數(shù)據(jù)庫的375例胃癌患者腫瘤組織中INHBA表達水平與胃癌患者生存的相關(guān)性。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用R語言（Version 3.5.1）進行統(tǒng)計學(xué)分析，圖形繪制采用Graphpad Prism 5.0軟件。實驗均重復(fù)3次或3次以上，結(jié)果以±s表示。若無特殊說明，2組間差異的比較應(yīng)用雙側(cè)t檢驗。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、合適的激活素A作用濃度

激活素A 0、5、10、20、40、80 ng/mL分別處理MGC803細胞24 h，Wb檢測pSmad2的相對表達水平分別為1.000±0.027、1.802±0.130、1.761±0.072、2.819±0.110、3.062±0.158、2.767±0.138，20 ng/mL的激活素A可顯著上調(diào)pSmad2/3的表達，更高濃度的激活素A并不能進一步上調(diào)pSmad2/3的表達（均P＜0.01）（見圖1）。因此選擇20 ng/mL的濃度進行后續(xù)的功能實驗。

圖1 MGC803胃癌細胞中激活素A可激活激活素下游Smad信號通路

二、激活素A促進胃癌細胞的遷移和有氧糖酵解

Transwell細胞遷移實驗顯示，與對照組細胞比較，經(jīng)激活素處理后的細胞遷移能力顯著增強（每高倍鏡視野遷移的細胞數(shù)為：161.333±14.572比56.000±9.849，P＜0.001）（見圖2A）。

劃痕實驗結(jié)果顯示，激活素處理組較對照組劃痕愈合比例明顯升高（48 h后劃痕愈合比例為：62.000%±5.568%比35.667%±4.041%，P＜0.01）（見圖2B）。

圖2 激活素A可促進胃癌細胞遷移

與對照組相比，激活素A處理組細胞乳酸產(chǎn)生明顯增加（相對乳酸產(chǎn)生量1.713±0.076比1.0±0.126，P＜0.01），葡萄糖攝取明顯增加（相對葡萄糖攝取量2.857±0.215比1.0±0.097，P＜0.001）。

三、激活素A可促進EMT相關(guān)基因和GLUT3的表達

通過在線工具GEPIA分析TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌組織測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)INHBA與SNAI1（編碼Snail）（r=0.47,P=0）、SNAI2（編碼slug）（r=0.51,P=0）、VIM（編碼VIM）（r=0.37,P=2.1×10-14）、MMP2（r=0.64,P=0）、MMP9（r=0.27,P=2.8×10-8）等多個EMT相關(guān)基因表達呈顯著正相關(guān)（見圖3A～E）。

Wb檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，20 ng/mL激活素A處理24 h后的胃癌細胞snail（187%比100%,P＜0.05）、slug（191%比100%,P＜0.05）、波形蛋白（156%比100%,P＜0.05）、MMP2蛋白（145%比100%,P＜0.05）表達升高，MMP9（89%比100%,P=0.254）、N-鈣黏著蛋白（129%比100%，P=0.089）變化不明顯（見圖3F）。

圖3 激活素A對EMT相關(guān)基因和GLUT3表達的影響

INHBA與糖酵解相關(guān)基因HIF1A（編碼HIF-1α）（r=0.45,P=0）、SLC2A3（編碼GLUT3）（r=0.42,P=0）表達呈顯著正相關(guān)（見圖4A），Wb檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)20 ng/mL激活素A處理24 h后的胃癌細胞，GLUT3蛋白表達明顯升高（328%比100%,P＜0.05），LDHA（108%比100%,P=0.875）、LDHB（92%比100%,P=0.768）、HK2（117%比100%,P=0.743）、GLUT1（86%比100%,P=0.272）、GLUT4（115%比100%,P=0.657）、ALDOA（96%比100%,P=0.833）等其他糖酵解相關(guān)基因表達無明顯變化（見圖4B），HIF-1α未檢測到清晰條帶，可能與常氧條件下HIF-1α表達量很低有關(guān)。

圖4 激活素A對糖酵解相關(guān)基因及GLUT3蛋白表達的影響

四、INHBA在胃癌組織中的表達及對患者生存的影響

利用GEPIA在線工具分析TCGA胃癌數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)INHBA在胃癌組織中表達水平顯著高于癌旁胃黏膜組織 （P＜0.05）（見圖5A～B）。Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，來源于GEO數(shù)據(jù)庫的患者中，INHBA高表達組患者總生存（overall survival,OS）時間[風(fēng)險比（hazard ratio，HR）=1.33，P=0.008 6]和無進展生存（progression-free survival，PFS）時間（HR=1.36，P=0.013）均較低表達組患者短（見圖5C～D）。來源于TCGA數(shù)據(jù)庫的患者中，INHBA高表達組患者OS時間（HR=1.62，P=0.004 4）和PFS時間（HR=3.13，P=0.007 3）也較低表達組患者短（見圖5E～F）。

圖5 激活素A編碼基因INHBA在胃癌組織中的表達

討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移和惡病質(zhì)都是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要原因。有氧糖酵解是腫瘤細胞代謝異常的特征之一[14]，與正常細胞不同，腫瘤細胞即使在正常氧分壓環(huán)境中，也主要通過糖酵解獲取能量，這種現(xiàn)象就是“瓦爾堡效應(yīng)”（Warburg effect），即有氧糖酵解[15]。有氧糖酵解雖然產(chǎn)能效率較低，但反應(yīng)步驟少，因此單位時間內(nèi)產(chǎn)生的ATP較多。更重要的是糖酵解過程中生成的碳中間體可以作為腫瘤細胞合成生物大分子的原料，有利于腫瘤細胞分裂增殖。此外糖酵解的終產(chǎn)物乳酸，可以降低腫瘤微環(huán)境pH值，過低的pH值可能減弱免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，有利于腫瘤細胞免疫逃逸[16]。有氧糖酵解對腫瘤細胞的增殖轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，糖酵解調(diào)控基因可能成為抗腫瘤治療的新靶點[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)激活素A可以調(diào)控胃癌細胞有氧糖酵解。經(jīng)典激活素信號通路中，激活素A通過與細胞膜上具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的Ⅱ型受體結(jié)合，進而招募、磷酸化、激活Ⅰ型受體，激活的Ⅰ型受體與細胞質(zhì)中的2種Smad蛋白（Smad2和Smad3）短暫相互作用，并使之磷酸化，磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4結(jié)合，由此產(chǎn)生的Smad復(fù)合物進入細胞核，與多種靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控靶基因表達。經(jīng)20 ng/mL激活素A處理后，胃癌細胞pSmad2/3表達水平明顯上調(diào)，在隨后的機制探索中觀察到激活素A可上調(diào)GLUT3蛋白表達。GLUT3是糖代謝中的重要基因，腫瘤組織GLUT3的高表達有利于腫瘤細胞攝取葡萄糖，因此考慮激活素A可能通過上調(diào)GLUT3表達促進胃癌細胞有氧糖酵解。最近有研究證實Smad可與HIFIA形成復(fù)合體，通過調(diào)控c-Myc促進有氧糖酵解[18]。將在以后的實驗中對激活素A調(diào)控糖酵解的分子機制進行深入研究。

本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)激活素A重要受體ACVR2A在胃癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[9]。ACVR2A基因編碼區(qū)存在2個微衛(wèi)星位點，在高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定胃癌患者中ACVR2A突變率高達70%以上，突變后ACVR2A則失去了轉(zhuǎn)導(dǎo)激活素信號的能力。本研究也發(fā)現(xiàn)激活素A可促進胃癌細胞遷移，EMT是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要機制，激活素A可上調(diào)EMT相關(guān)基因表達。另有研究表明，腫瘤細胞有氧糖酵解水平升高和腫瘤細胞遷移能力的增強顯著相關(guān)[19]。考慮激活素A一方面可能通過激活EMT信號通路促進胃癌細胞遷移，另一方面可能通過增強胃癌細胞有氧糖酵解，促進胃癌細胞遷移。通過公共數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)激活素A編碼基因INHBA在胃癌組織中表達水平顯著高于癌旁胃黏膜組織，高表達INHBA的胃癌患者OS和PFS時間均顯著短于低表達者。

綜上，本研究結(jié)果提示，TGF-β超家族細胞因子激活素A可促進胃癌細胞遷移和有氧糖酵解，機制可能是激活素A可促進EMT通路關(guān)鍵基因及GLUT3的表達。激活素A編碼基因INHBA高表達可作胃癌患者預(yù)后不良的標(biāo)志。該細胞因子可能成為抑制胃癌轉(zhuǎn)移和改善惡病質(zhì)的作用靶點。