張九裕，孫楠，張薇，樊明濤, 1b

醋酸菌菌膜生產工藝條件優(yōu)化

張九裕1a，孫楠2，張薇2，樊明濤1a, 1b

（1.西北農林科技大學 a.生命科學學院 b.食品科學與工程學院，陜西 咸陽 712100；2.陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，西安 710119）

優(yōu)化用醋酸菌生產菌膜的最適培養(yǎng)條件和方法，以期獲得天然、安全的食品包裝用膜的生產工藝。以澀柿醋為原料，分離篩選出高產菌膜的優(yōu)良醋酸菌種，通過單因素和Plackett?Burman 等試驗設計優(yōu)化醋酸菌菌膜最適培養(yǎng)方法和工藝條件。從澀柿醋中分離純化獲得產膜醋酸菌，經鑒定為葡糖醋桿菌。用醋酸菌生產醋酸菌菌膜最優(yōu)培養(yǎng)條件：蔗糖質量分數(shù)為5%、蛋白胨質量分數(shù)為0.7%、酵母提取物質量分數(shù)為1.2%、檸檬酸鈉質量分數(shù)為0.15%、K2HPO4質量分數(shù)為0.16%、乙酸體積分數(shù)為1%、無水乙醇體積分數(shù)為2%，種齡為32 h，接種量為9%；培養(yǎng)5 d后，醋酸菌菌膜的平均產率為364.65 g/L，是優(yōu)化前的（246.03 g/L）的1.48倍。濕膜平均含水率為99.38%，復水率為71.09%～83.39%，菌膜干膜復水率高且復水速度快，復水1 min其含水率便可達到70%以上。醋酸菌用經過優(yōu)化選擇的培養(yǎng)液和方法，可生產出高質量的菌膜。

醋酸菌；菌膜；包裝；條件優(yōu)化

細菌纖維素（Bacterial cellulose）與一般的植物纖維素相比，具有純度高（由一個單糖單位組成的同聚多糖）、細膩、持水性高、復水性高以及濕態(tài)柔韌性強等優(yōu)良特性[1]。目前，細菌纖維素已在多個領域獲得商業(yè)化的應用，如食品工業(yè)中用作增稠劑、成型劑、結合劑等[2]；在醫(yī)學上常用作傷口敷料，如作為人工皮膚治療燒傷；在其他方面，如聲音震動薄膜、化妝品和生物材料方面也得到了較好的應用。Jipa等[3]報道，使用含乳酸鏈球菌素的細菌纖維素來包裝frankfurter香腸，有效地控制了李斯特桿菌并減少了香腸表面的好氧型細菌總數(shù)。Xiao等[4]發(fā)現(xiàn)細菌纖維素與多聚乳酸的復合物具有更好的細菌纖維素透明度和生物適應性，并且力學性能變得更好，該復合物更加適用于食品包裝。Hsiao等[5]發(fā)明了管狀細菌纖維素可直接應用于素食食品包裝。雖然，細菌纖維素的理化性質和柔韌性均優(yōu)于植物纖維素，在工業(yè)生產中有很廣泛的應用前景，但由于細菌纖維素的合成過程非常復雜，產量不高，使它在工業(yè)中的應用受到限制[6]。

醋酸菌菌膜（Acetic Acid Bacteria Pellicle，AP）是食醋生產過程或貯存中在醋液表面形成的一層凝膠狀薄膜，是醋酸菌發(fā)酵食醋時代謝的副產物，隨著醋液發(fā)酵或貯存時間的延長而慢慢變厚增多[7-8]，該層薄膜實際就是由食醋中含有的醋桿菌屬微生物發(fā)酵形成的一種細菌纖維素薄膜。醋酸菌膜在陜西、山西等地常加工成“醋粉”，視其為地方名食。筆者發(fā)現(xiàn)，用澀柿和杏等水果生產食醋時，在醋液表面極易產生大量的菌膜。

用醋酸菌加工的食品包裝膜天然、安全、環(huán)保，生產這種包裝膜是食品包裝材料的發(fā)展趨勢，迄今未見更多的研究報道。文中以試驗室自釀的澀柿醋為材料，從中分離篩選出產菌膜的優(yōu)勢菌株，通過試驗對醋酸菌高產菌膜的工藝條件進行優(yōu)化，以期通過微生物發(fā)酵，獲得可用于食品包裝的醋酸菌膜的生產技術和工藝參數(shù)，為包裝材料的生產和發(fā)展提供理論依據(jù)和實踐指導。

1 試驗

1.1 材料與儀器

主要材料：澀柿醋、杏醋，食品發(fā)酵試驗室釀制，2種醋液表面都長有1 cm厚的菌膜；葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、瓊脂、無水乙醇、冰乙酸、Na2HPO4、檸檬酸鈉、K2HPO4、CaCO3。

AE培養(yǎng)基[9]（醋酸乙醇培養(yǎng)基）組成：質量分數(shù)為0.5%的葡萄糖，質量分數(shù)為0.3%的酵母提取物，質量分數(shù)為0.4%的蛋白胨，質量分數(shù)為1.5%的瓊脂，體積分數(shù)為3%的無水乙醇，體積分數(shù)為3%的冰乙酸。

RAE培養(yǎng)基（強化AE）組成：質量分數(shù)為4%的葡萄糖，質量分數(shù)為1%的酵母提取物，質量分數(shù)為1%的蛋白胨，質量分數(shù)為0.338%的Na2HPO4，質量分數(shù)為0.15%的檸檬酸鈉，體積分數(shù)為2%的無水乙醇，體積分數(shù)為1%的冰乙酸，質量分數(shù)為1.5%的瓊脂。

增殖培養(yǎng)基組成：質量分數(shù)為4%的葡萄糖，質量分數(shù)為1%的酵母提取物，質量分數(shù)為1%的蛋白胨，質量分數(shù)為0.338%的Na2HPO4，質量分數(shù)為0.15%的檸檬酸鈉，體積分數(shù)為2%的無水乙醇，體積分數(shù)為1%的冰乙酸。

分離培養(yǎng)基組成：質量分數(shù)為10%的葡萄糖，質量分數(shù)為1%的酵母提取物，質量分數(shù)為2%的CaCO3，質量分數(shù)為1.5%的瓊脂。

斜面保藏培養(yǎng)基組成：質量分數(shù)為0.8%的酵母提取物，質量分數(shù)為2%的葡萄糖，質量分數(shù)為0.03%的CaCO3，質量分數(shù)為0.03%的瓊脂，質量分數(shù)為0.5%的蛋白胨，體積分數(shù)為0.5%的無水乙醇。

主要儀器設備：立式高壓滅菌器，上海佳騰試驗設備有限公司；恒溫振蕩器，躍進醫(yī)療機械廠；凈化工作臺，新苗醫(yī)療機械制造有限公司；電熱恒溫水槽，躍進醫(yī)療機械廠；智能恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；鼓風干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；Motic（BA200、BA300），光學顯微鏡。

1.2 醋酸菌培養(yǎng)

1.2.1 種子液制備

用無菌接種針分別從長有AP薄膜的杏醋、澀柿醋中挑取適量的菌膜至無菌研缽中，并在無菌條件下進行研磨后分別吸取10 mL至裝有90 mL已滅過菌的液體RAE培養(yǎng)基的三角瓶中，置于搖床（120 r/min、30 ℃）培養(yǎng)24 h。

1.2.2 接種培養(yǎng)

分別制備RAE培養(yǎng)基、AE培養(yǎng)基各500 mL，在121 ℃高壓下滅菌20 min，冷卻至50～60 ℃后加入無水乙醇和冰乙酸混勻，倒入平板；每平板接種子液0.2 mL，涂布，30 ℃倒置培養(yǎng)，每天觀察生長情況。

1.3 產膜菌種篩選分離

1.3.1 菌種分離

增殖培養(yǎng)：將菌膜與醋醪用無菌研缽在無菌條件下研磨后，吸取10 mL的菌懸液于裝有90 mL增殖培養(yǎng)基的三角瓶中，用搖床（120 r/min，30 ℃）培養(yǎng)24 h制成種子液。

稀釋涂布：吸取種子液用無菌水依次稀釋制成不同濃度梯度的菌懸液，選取3個較小濃度的菌懸液，分別吸取0.2 mL于平板中均勻涂布，每個濃度梯度做3組平行，置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～4 d后，觀察菌體的生長情況。查看是否生出小型菌落，菌落周圍出現(xiàn)透明圈的是醋酸桿菌，挑選透明圈較大的單菌落[10]進行革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，觀察結果如果顯示為革蘭氏陰性、短桿菌，則挑選其中分布均勻、透明圈大的單菌落移植于斜面培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24～48 h。

劃線分離：待斜面長出豐厚的菌苔后，挑取斜面菌種進行劃線分離，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后鏡檢，若為純培養(yǎng)物，則轉入斜面保存培養(yǎng)基，在4 ℃下保藏。

1.3.2 菌種鑒定

菌落形態(tài)觀察：觀察記錄培養(yǎng)3～5 d的平板培養(yǎng)基中菌落的形態(tài)。

生理生化試驗[11-16]：根據(jù)細菌常規(guī)生理生化試驗方法，對初步篩選菌種進行鑒定。

1.4 醋酸菌產膜生產條件優(yōu)化

1.4.1 種齡和接種量選擇

1）種齡選擇。挑取適量斜面保藏菌種于增殖培養(yǎng)基中，振蕩混勻后用8層紗布封口，置于搖床（120 r/min、30 ℃）依次振蕩培養(yǎng)16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 h后，測定菌液光密度（OD值）[17]（600 nm），并以5%的接種量接入裝有100 mL基礎培養(yǎng)基的三角瓶（量程為250 mL）中，振蕩混勻后用8層紗布封口，30 ℃靜置培養(yǎng)5 d，測定AP的產率。

2）接種量選擇。接種量是指移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比。挑取斜面菌種于裝有增殖培養(yǎng)基的三角瓶中，振蕩混勻后用8層紗布封口，并以得出的最適種齡為培養(yǎng)時間，分別以1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%的接種量接入裝有100 mL基礎培養(yǎng)基的三角瓶（量程為250 mL）中，振蕩混勻后用8層紗布封口，30 ℃靜置培養(yǎng)5 d，測定AP的產率。

1.4.2 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

1）碳源選擇及用量確定。以質量分數(shù)為4%的不同單一碳源（葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇），分別替代原基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖，同時設定空白對照（即在基礎培養(yǎng)基中不添加葡萄糖），分別接入體積分數(shù)為5%的種子液，30 ℃靜置培養(yǎng)5 d后測定AP的產率，選出AP產率高的碳源并確定其最適添加量[14]。質量分數(shù)水平為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%。

2）氮源用量確定。通過查閱相關文獻并綜合經濟考慮，試驗選用有機氮源酵母提取物和蛋白胨，分別確定最適質量分數(shù)，分別將質量分數(shù)為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的酵母提取物，質量分數(shù)為0.1%、0.4%、0.7%、1.0%、1.3%的蛋白胨添加到基礎培養(yǎng)基中，在30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d后，分別測定AP的產率。

3）無機鹽選擇及用量確定。以質量分數(shù)為3%的不同無機鹽（Na2HPO4、檸檬酸鈉、K2HPO4、MgSO4）代替原基礎培養(yǎng)基中的Na2HPO4和檸檬酸鈉，30 ℃靜置培養(yǎng)5 d后測定AP的產率，選出AP產率高的無機鹽并確定其最適用量。

4）有機酸選擇及用量確定。以體積分數(shù)為1%的不同有機酸（檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、富馬酸、冰乙酸）代替原基礎培養(yǎng)基中的冰乙酸，并設定空白對照，30 ℃靜置培養(yǎng)5 d后測定AP的產率，選出AP產率高的有機酸并確定其最適用量。體積分數(shù)水平為0%、1%、2%、3%、4%。

5）無水乙醇用量確定。在基礎培養(yǎng)基中分別添加體積分數(shù)為0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的無水乙醇，在30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d后測定AP的產率。

以上每組試驗均設3組平行。

1.4.3 Plackett?Burman 試驗設計

根據(jù)葡糖醋桿菌代謝產細菌纖維素的一般影響因素以及前期的單因素試驗，設計Plackett?Burman試驗[18]，選取蔗糖、酵母提取物、K2HPO4、檸檬酸鈉、蛋白胨、冰乙酸、無水乙醇為試驗因素，以AP濕膜質量為評價指標，利用Minitab 16統(tǒng)計軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進行分析，因素及編碼水平見表1。

表1 Plackett?Burman試驗因素及編碼水平

Tab.1 Experimental factors and coding level of Plackett?Burman

1.4.4 響應曲面（RSM）試驗設計

結合Plackett–Burman試驗的結果來確定影響AP產率的主要因素及其水平范圍，再采用Box–Benhnken試驗設計方法對細菌纖維素培養(yǎng)條件進行響應曲面分析試驗，從而獲得培養(yǎng)AP的最適培養(yǎng)基[19-20]。因素水平及編碼見表2。

表2 Box?Behnken試驗因素及編碼水平

Tab.2 Experimental factors and coding level of Box-Behnken

1.4.5 醋酸菌菌膜參數(shù)測定

1）菌膜的處理及AP產率。將培養(yǎng)好的膜從三角瓶中取出，用蒸餾水沖洗數(shù)次，浸泡一夜（除去膜中的培養(yǎng)基和表面的雜質），再用濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液90 ℃浸泡處理2 h，直到膜呈乳白色，半透明狀；將膜取出用水清洗數(shù)次，用體積分數(shù)為0.5%的乙酸溶液浸泡5 min，再用蒸餾水沖洗數(shù)次，直至用pH試紙測其表面水分為中性時，除去AP濕膜表面的多余水分，即為細菌纖維素濕膜；將細菌纖維素濕膜置于干燥箱中（90±3）℃下烘至完全干燥，即為細菌纖維素干膜[21-22]。AP產率計算方法為：

AP產率=濕膜質量/培養(yǎng)液體積

2）AP濕膜含水率與干膜復水率計算。

AP濕膜的含水率計算式為：

AP的干膜稱完質量后，放入培養(yǎng)皿中并向其中加入蒸餾水，浸泡24 h后，取出用濾紙吸干表面水分，稱量其吸水后的質量，計算醋酸菌菌膜干膜的復水率：

2 結果與分析

2.1 產膜醋酸菌的形態(tài)和生化鑒定

將產膜醋酸菌接種于柿醋中，培養(yǎng)5 d。發(fā)現(xiàn)2種果醋所制種子液在RAE、AE培養(yǎng)基上均能產膜，但在RAE培養(yǎng)基上的生長速度均比在AE培養(yǎng)基上要快。杏醋醋酸菌所產膜易碎不易揭起，柿醋醋酸菌所產膜韌性較強，不易碎且易揭起。故選擇RAE培養(yǎng)基作為產膜醋酸菌的基礎培養(yǎng)基，選擇長有AP膜的澀柿醋作為分離產膜菌種的原材料。用RAE培養(yǎng)培養(yǎng)從澀柿醋中分離的產膜醋酸菌，進行了菌落形態(tài)觀察和生理生化特征測定。

菌體形態(tài)結果見圖1—2，分離的醋酸菌菌落表面光滑乳白色，菌體呈短桿狀，單個或成對出現(xiàn)，革蘭氏染色呈陰性。生理生化特征試驗結果見表3。依據(jù)菌體形態(tài)觀察及生理生化試驗結果，初步確定篩選分離所得菌種為葡糖醋桿菌（）。

圖1 醋酸菌菌落形態(tài)

圖2 醋酸菌顯微觀察

表3 菌種生理生化特征鑒定

Tab.3 Biochemical and physiologica characteristics of bacteria

2.2 培養(yǎng)基瓊脂對醋酸菌產膜的影響

在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中瓊脂含量越低，其膜生長速度越快越容易揭起，并分別以瓊脂質量分數(shù)為0%、0.5%、0.9%、1%、1.2%、1.5%進行驗證。結果表明培養(yǎng)1 d，液體培養(yǎng)基表面便覆蓋一層薄膜，可揭起，而添加瓊脂的量越大，其醋酸菌產菌膜的速率越慢，約2 d培養(yǎng)基表面才長出膜，培養(yǎng)5 d膜仍不易揭起，且液體培養(yǎng)不易被雜菌污染，故選擇液體培養(yǎng)基作為AP生產培養(yǎng)基。

2.3 種齡對菌膜產率的影響

種齡即“種子”的群體生長年齡，種齡的長短都會影響AP的產率，種齡不夠或種齡過長都會使AP的產率下降，因此，選擇合適的種齡對提高AP產率有著重要作用。由圖3可知，種齡在32 h時，菌液OD值最高，說明此時菌液密度最高，種子活力最高。同時以培養(yǎng)32 h的種子培養(yǎng)液接種培養(yǎng)5 d后所得AP濕膜產率也均高于其他培養(yǎng)時間，見圖4，說明種齡為32 h時最適合發(fā)酵生產AP。

圖3 種齡對醋酸菌生長影響

圖4 種齡對AP產率的影響

2.4 接種量對AP產率的影響

接種量過多或過少均不利于AP生產，接種量過多會導致培養(yǎng)底物前期消耗過快，同時菌體濃度過大會導致培養(yǎng)基中的溶氧量過少，致使大量菌體死亡，從而影響AP產率；接種量過少，AP的合成速度變慢，致使AP產率下降。由圖5可知，當接種量在9%以下時，AP產率隨接種量的增加產率不斷增加，但當接種量高于9%時AP產率反而下降，因此確定9%為最佳接種量，AP濕膜產率為260 g/L。

圖5 接種量對AP產率的影響

2.5 碳源對AP產率的影響

每種微生物的生理特性不同，所能利用的碳源種類也不一樣，培養(yǎng)基中添加不同的碳源，葡糖醋桿菌的利用程度不一樣，則醋酸菌菌膜的產率就有差異[18]。該試驗在基礎培養(yǎng)基的上添加質量分數(shù)為4%的不同單一碳源，以不含碳源的培養(yǎng)基作為空白對照，在30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d后，結果見圖6。

圖6 不同碳源對AP產率的影響

碳源種類不同，發(fā)酵所獲得的AP產率不同，葡萄糖、蔗糖和甘露醇作為碳源，產率較高，其中蔗糖產率高于甘露醇和葡萄糖，蔗糖作為碳源更有利于葡糖醋桿菌代謝產生AP，故選擇蔗糖為碳源，并確定其最適用量。由圖7可知，蔗糖質量分數(shù)為4%時，AP產率最高。

2.6 氮源用量對醋酸菌菌膜產率的影響

氮源是微生物發(fā)酵的主要原料之一，有無機氮源和有機氮源之分，通過查閱文獻并從經濟角度考慮[19]，試驗選擇蛋白胨、酵母提取物作為氮源發(fā)酵生產AP。AP產率隨蛋白胨和酵母提取物質量分數(shù)的變化趨勢分別見圖8—9。

圖7 蔗糖質量分數(shù)對AP產率的影響

圖8 蛋白胨質量分數(shù)對AP產率的影響

圖9 酵母提取物質量分數(shù)對AP產率的影響

結果顯示AP產率在酵母提取物質量分數(shù)為1.2%，蛋白胨質量分數(shù)為0.7%時最高。

2.7 無機鹽對醋酸菌菌膜產率的影響

無機鹽是微生物生命過程中不可缺少的營養(yǎng)物質，不同的無機鹽對不同微生物的生長繁殖所起到的作用也不一樣。不同無機鹽對AP產率的影響圖10，其中K2HPO4和檸檬酸鈉對AP產率影響較為明顯，因此試驗選擇K2HPO4和檸檬酸鈉作為生產AP的無機鹽。

通過設定不同的質量分數(shù)梯度確定K2HPO4和檸檬酸鈉最適質量分數(shù)以獲得較高產率的AP。從圖11和圖12所示結果可以看出，當K2HPO4質量分數(shù)為0.3%，檸檬酸鈉質量分數(shù)為0.15%時AP產率最高。

圖10 不同無機鹽對AP產率的影響

圖11 K2HPO4質量分數(shù)對AP產率的影響

圖12 檸檬酸鈉質量分數(shù)對AP產率的影響

2.8 有機酸對醋酸菌菌膜產率的影響

在增殖培養(yǎng)基的基礎上添加體積分數(shù)為1%的不同有機酸代替乙酸，在30 ℃下靜置培養(yǎng)5 d后結果見圖13。乙酸對AP產率影響較為明顯，蘋果酸與檸檬酸對其產率影響不大，而富馬酸與酒石酸對AP產率不僅沒有促進作用，而且抑制了菌體生長，降低了AP產率，故而選擇乙酸作為進一步優(yōu)化的有機酸。AP產率隨乙酸濃度變化趨勢見圖14，當乙酸體積分數(shù)為0.1%時，菌體能產生最大量的AP。當乙酸的體積分數(shù)過大時，抑制了菌體生長反而降低了AP的產率。

圖13 不同有機酸對AP產率的影響

圖14 乙酸體積分數(shù)對AP產率的影響

2.9 無水乙醇用量確定

葡糖醋桿菌能夠將較低體積分數(shù)的無水乙醇轉化成生命活動所需要的高能化合物，因此較低體積分數(shù)的無水乙醇可以促進葡糖醋桿菌發(fā)酵產生醋酸菌菌膜[20]。如圖15所示，當無水乙醇體積分數(shù)低于2%時，菌體細胞代謝所需要的能量能夠得到滿足，促進AP的生成，AP產率增加。當無水乙醇體積分數(shù)大于2%時，隨著其體積分數(shù)的增加，菌體生長受到抑制，AP產率降低。綜上，無水乙醇體積分數(shù)為2%時，促進作用最為明顯，AP產率最大。

圖15 乙醇體積分數(shù)對AP產率的影響

2.10 AP培養(yǎng)基優(yōu)化

在前期單因素試驗的基礎上，以蔗糖、蛋白胨、酵母提取物、K2HPO4、檸檬酸鈉、乙酸、無水乙醇為考察因素，利用Plackett–Burman試驗設計，進行12組試驗，數(shù)據(jù)分析結果見表4。由表4可知，主效應中影響AP產率的主要因素為蔗糖（=0.002）、無水乙醇（=0.003）、K2HPO4（=0.009），主要因素的值均小于 0.050，可以作為進一步優(yōu)化的關鍵因素。其他因素對AP產率影響不大（>0.05），在進一步研究中作為條件因素考慮。

2.11 培養(yǎng)基組成與醋酸菌菌膜產率關系的二次方程的建立

參照前期的單因素試驗及Plackett–Burman試驗，對影響菌體代謝合成AP的主要因素蔗糖、K2HPO4、無水乙醇按Box–Behnken試驗設計進行17組試驗（培養(yǎng)基其他成分按單因素試驗結果配制：蛋白胨質量分數(shù)為0.7%、酵母提取物質量分數(shù)為1.2%、檸檬酸鈉質量分數(shù)為0.15%、乙酸質量分數(shù)為1%），結果見表5。

表4 Plackett?Burman試驗主效應分析

Tab.4 Analysis of main effects for Plackett?Burman experiment

表5 Box–Behnken 試驗設計結果

Tab.5 Results of Box - Behnken experiment design

利用design expert軟件對表5中的試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到AP產率（）對自變量蔗糖（1）、K2HPO4（2）、乙醇（3）的多元回歸方程為：

=35.92+0.331?1.222+2.63+0.3612?3.5213+2.4823?6.6412?0.3722?5.4732

由方差分析可知（表6），此模型極顯著（<0.000 1），失擬項不顯著（=0.467 6），預測值與真實值間有高度相關性（2=0.996 6），說明模型與實際擬合良好，可應用于AP生產產率的分析與預測。

從表7培養(yǎng)基成分的回歸方程系數(shù)顯著性檢驗結果可以看出，在模型參數(shù)中1與3、2與3之間的交互作用對AP產率的影響極顯著，1與2的交互作用對AP產率的影響不顯著。

2.12 AP表觀形態(tài)觀察

靜態(tài)培養(yǎng)條件下，AP膜浮于液體培養(yǎng)基表面。AP膜經水處理后呈現(xiàn)乳黃色不透明狀，經堿液處理后呈白色或乳白色半透明狀，外表光滑細膩，類似凍狀，有彈性，經（90±3）℃處理后，結構致密，韌性強[21-22]。未處理的AP濕膜、經水處理后的AP濕膜、經堿液處理后的AP濕膜、干膜表觀形態(tài)對照見圖16。

2.13 AP濕膜含水率與干膜復水率

由表8可得，醋酸菌菌膜膜具有很強的持水性，醋酸菌菌膜濕膜平均含水率為99.38%，最低含水率也可達到99.22%，最高可達99.53%，復水率為71.09%～83.39%，AP干膜不僅復水率高且復水速度快，復水1 min其含水率便可達到70%以上。

表6 AP 發(fā)酵培養(yǎng)基多元二次方程方差分析

Tab.6 Anova for multivariate quadratic equation of AP fermentation medium

表7 培養(yǎng)基成分回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

Tab.7 Regression equation coefficient significance test of medium components

注：**表示在0.01水平上的顯著性。

圖16 AP形態(tài)

表8 AP 濕膜含水率和干膜復水率

Tab.8 AP wet membrane water content and dry film rehydration rate

3 結語

以柿醋菌膜為材料，從中篩選分離出高產醋酸菌菌膜的菌種，運用單因素試驗獲得各因素水平范圍，再通過響應曲面（RSM）試驗設計對醋酸菌菌膜培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以獲得最佳生產條件。同時，對醋酸菌菌膜膜的基本性質做了研究，得到結論如下。

1）分離的產菌膜菌株經形態(tài)觀察及生理生化鑒定后得出，該菌種為葡糖醋桿菌（）。

2）通過單因素試驗，確定了最佳培養(yǎng)條件（接種量為9%，種齡為32 h，培養(yǎng)時間為5 d）和各因素用量水平范圍。

3）通過Plackett–Burman 試驗選出影響細菌纖維產率的主要因素為蔗糖、無水乙醇、K2HPO4。

4）利用響應曲面優(yōu)化試驗，并綜合各試驗設計結果得出最優(yōu)生產培養(yǎng)基成分組成：蔗糖質量分數(shù)為5%、蛋白胨質量分數(shù)為0.7%、酵母提取物質量分數(shù)為1.2%、檸檬酸鈉質量分數(shù)為0.15%、K2HPO4質量分數(shù)為0.16%、冰乙酸體積分數(shù)為1%、無水乙醇體積分數(shù)為2%，在此條件下得到的實際AP的平均產率為364.65 g/L，是優(yōu)化前的（246.03 g/L）的1.48倍；醋酸菌菌膜濕膜平均含水率為99.38%，復水率為71.09%～83.39%，AP干膜不僅復水率高且復水速度快，復水1 min其含水率便可達到70%以上。

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Optimization of Production Conditions of Acetic Acid Bacteria Pellicle

ZHANG Jiu-yu1a, SUN Nan2, ZHANG Wei2, FAN Ming-tao1a, 1b

(1a. College of Life Science b. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Shaanxi Xianyang 712100, China; 2. College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi'an 710119, China)

The work aims to optimize the optimum culture conditions and methods for production of bacterial pellicle with acetic acid bacteria to obtain a natural and safe production process of pellicle for food packaging. Astringent persimmon vinegar was used as raw material, and excellent acetic acid bacteria with high yield membrane were isolated and screened. The optimum culture method and technological conditions of acetic acid pellicle were optimized by single factor and Plackett?Burman experimental design. The pellicle producing acetic acid bacteria was isolated and purified from astringent persimmon vinegar and identified as gluconacetobacter xylinum. The optimum conditions for culture of pellicle with acetic acid bacteria were as follows: sucrose 5% (mass fraction), peptone 0.7% (mass fraction), yeast extract 1.2% (mass fraction), sodium citrate 0.15% (mass fraction), K2HPO40.16% (mass fraction), acetic acid 1% (v/v), absolute ethanol 2% (v/v), seed age 32 h, inoculation amount 9%, cultured for 5 days. The average yield of pellicle was 364.65 g/L, which was 1.48 times as high as that before optimization (246.03 g/L). The average moisture content of wet pellicle was 99.38%, and the rehydration rate was 71.09%-83.39%. The rehydration rate of dry membrane was high and the rehydration speed was fast. The water content can reach more than 70% after one minute of rehydration. With the optimized culture medium and method, high-quality pellicle can be produced with acetic acid bacteria.

acetic acid bacteria; pellicle; packaging; condition optimization

TS206

A

1001-3563(2022)13-0031-11

10.19554/j.cnki.1001-3563.2022.13.005

2021?08?27

大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（X202010712283）；西安市科技計劃（20193044YF032NS032）；中國富硒產業(yè)研究院2019年富硒專項“236”計劃（2019QCY–2.3–02）

張九裕（2001—），女，西北農林科技大學本科生，主攻生物科學。

樊明濤（1963—），男，博士，西北農林科技大學教授、博導，主要研究方向為食品生物技術與食品安全。

責任編輯：曾鈺嬋