李喬，都鳳華，沙丙含

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

格氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri）又稱加氏乳桿菌，是一種革蘭氏陽性菌[1]，具有多種功能性的益生菌，是存在于人體內(nèi)的天然菌叢[2]。格氏乳桿菌適宜生長環(huán)境溫度為30℃～37℃。最適生長pH值為6～7，在pH值為2時(shí)依舊可以存活，存活率在2%左右[3]。格氏乳桿菌具有可維持人體腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)等多種益生功能[4]，如可通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)厚壁菌門和擬桿菌門的比例防止體重的過度增加[5-7]。格氏乳桿菌的代謝產(chǎn)物可抑制腸道對(duì)膽汁酸的重吸收以及增強(qiáng)人體對(duì)酸性類固醇排泄能力，從而具有降低膽固醇的作用[8-10]；菌體代謝產(chǎn)物可以通過與脂多糖的結(jié)合，阻止脂多糖對(duì)細(xì)胞受體的作用，干擾細(xì)胞外激酶調(diào)節(jié)信號(hào)、撕裂蛋白激酶信號(hào)通路達(dá)到消炎、抗菌的效果[11-13]。格氏乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)自由基具有較強(qiáng)的清除能力，是一種良好的天然抗氧化劑[14-16]。格氏乳桿菌可產(chǎn)生抗菌肽，經(jīng)試驗(yàn)研究，這些細(xì)菌素對(duì)引起食品腐敗的細(xì)菌具有廣譜抗菌活性，因此格氏乳桿菌可代替抗生素、作為生物防腐劑[17]。

微膠囊化可改善芯材的形態(tài)、味道和色澤等物理性質(zhì)；控制被包埋物質(zhì)的溶解釋放的時(shí)間和速度[18]。微膠囊技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于食品行業(yè)，如用于改善食品添加劑（調(diào)味劑、食用色素、膨松劑）的顏色氣味；提高營養(yǎng)強(qiáng)化劑與生物活性物質(zhì)（維生素、多肽）的穩(wěn)定性。國內(nèi)外相關(guān)研究人員通過改變包埋材料、微膠囊化方法等，不斷優(yōu)化乳桿菌包埋的制備工藝，保護(hù)乳桿菌不受外界不良環(huán)境影響，使其能抵御胃液的腐蝕并在腸道中定殖[19-21]，從而增強(qiáng)其對(duì)人體的益生作用。本研究采用內(nèi)源乳化法，以格氏乳桿菌作為芯材，海藻酸鈉、殼聚糖為壁材，制備雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊，為擴(kuò)大格氏乳桿菌使用范圍提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

格氏乳桿菌：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；殼聚糖、海藻酸鈉、冰乙酸、碳酸鈣、乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器（SN-MS-6D1）：尚普儀器設(shè)備有限公司；搖床（TB-200B）：天呈試驗(yàn)儀器制造有限公司；蒸汽滅菌器（LDZX-30KBS）：申安醫(yī)療器械廠；冷凍機(jī)（Sigma 2-16k）：博勱儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊制備工藝流程

將10 mL濃縮菌泥與質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%的海藻酸鈉溶液按照體積比1∶4菌膠比混合后，加入2%碳酸鈣并攪拌均勻。然后按照體積比1∶6的水油比加大豆油（含Span80），攪拌形成乳狀液，15 min后加入20 mL含有冰乙酸的大豆油，攪拌30 min后，加入洗滌介質(zhì)，離心收集后置于10 mL殼聚糖溶液中，置于磁力攪拌器上（400 r/min）攪拌20 min，靜置后過濾收集微膠囊[22]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

選擇殼聚糖溶液濃度（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）、成膜時(shí)間（5、10、15、20、25 min）3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分析各因素對(duì)雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊包埋率的影響。

1.3.3 雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊制備工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

對(duì)成膜時(shí)間、殼聚糖溶液濃度、pH值3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，因素水平如表1所示。以包埋率作為響應(yīng)值，確定雙層包埋微膠囊的最佳制備工藝組合。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface

1.3.4 格氏乳桿菌微膠囊包埋率的測定

稱取1.0 g微膠囊，置于10 mL磷酸鹽緩沖液中，用高速剪切機(jī)進(jìn)行破碎處理（19 000 r/min，2 min），37℃恒溫振蕩，使微膠囊溶解并釋放菌體，經(jīng)梯度稀釋后，吸取適宜稀釋度的菌懸液涂布于固體培養(yǎng)基上，37℃下厭氧培養(yǎng)48 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)[7]。微膠囊的包埋率計(jì)算公式如下。

式中：A為解囊液菌落數(shù)，cfu/mL；B為制備微膠囊的原菌液菌落數(shù)，cfu/mL。

1.3.5 格氏乳桿菌微膠囊在模擬胃腸液中存活試驗(yàn)

取1.0 g制得的微膠囊置于50 mL人工模擬胃液中，于37℃、100 r/min恒溫?fù)u床中振蕩，分別于0、30、60、90、120 min時(shí)離心收集微膠囊，用生理鹽水洗滌后，置于適量磷酸鹽緩沖液中溶解，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。同時(shí)以1.0 g未包埋格氏乳桿菌作為對(duì)照組。

稱取1.0 g制得的微膠囊置于50 mL人工模擬腸液中，于37℃、100 r/min恒溫?fù)u床中振蕩，分別對(duì)振蕩0、30、60、90、120 min 時(shí)的微膠囊進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

1.3.6 格氏乳桿菌微膠囊貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)

將制得的微膠囊放置于-18℃與常溫（25℃）條件中，儲(chǔ)藏4周。每隔1周對(duì)儲(chǔ)存的微膠囊取樣并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。同時(shí)以1 g未包埋格氏乳桿菌作為對(duì)照組。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果采用測定平均值。利用Design-Expert 10.0.1軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 殼聚糖濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響

殼聚糖濃度對(duì)微膠囊的包埋率的影響如圖1所示。

圖1 殼聚糖濃度對(duì)微膠囊包埋率的影響Fig.1 Effect of chitosan concentration on the encapsulation rate of microcapsules

由圖1可知，微膠囊的包埋率隨著殼聚糖濃度的增大而升高，當(dāng)殼聚糖濃度為0.6%時(shí)，微膠囊的包埋率最高，然而當(dāng)殼聚糖濃度繼續(xù)增加時(shí)包埋率呈下降趨勢。這可能是由于在一定范圍內(nèi)，殼聚糖濃度越高，殼聚糖與海藻酸鈉形成的聚電解質(zhì)復(fù)合膜越致密，減少了格氏乳桿菌菌體的外泄，從而有效地提高了微膠囊的包埋率。當(dāng)殼聚糖濃度繼續(xù)增高時(shí)，溶液的黏度增加、流動(dòng)性降低，從而影響了殼聚糖與海藻酸鈉的交聯(lián)反應(yīng)。因此最佳殼聚糖濃度為0.6%。

2.1.2 殼聚糖溶液pH值對(duì)微膠囊包埋率的影響

殼聚糖溶液pH值對(duì)微膠囊包埋率的影響如圖2所示。

圖2 殼聚糖溶液的pH值對(duì)微膠囊包埋率的影響Fig.2 Effect of pH of chitosan solution on the encapsulation rate of microcapsules

由圖2可知，微膠囊的包埋率隨著殼聚糖溶液pH值的增大而升高，當(dāng)pH值為5.0時(shí)，微膠囊的包埋率最高，然而當(dāng)pH值繼續(xù)增加時(shí)包埋率呈下降趨勢。這可能是由于殼聚糖溶液pH值較高時(shí)，殼聚糖分子鏈上的銨根離子以NH2+為主，與-COO-反應(yīng)的-NH3+數(shù)量較少，靜電吸引力減弱，形成的膜機(jī)械強(qiáng)度較低，從而降低了微膠囊的包埋率。因此殼聚糖溶液最佳pH值為5.0。

2.1.3 成膜時(shí)間對(duì)微膠囊包埋效果的影響

成膜時(shí)間對(duì)微膠囊包埋效果的影響如圖3所示。

圖3 成膜時(shí)間對(duì)微膠囊包埋率的影響Fig.3 Effect of film formation time on the encapsulation rate of microcapsules

由圖3可知，微膠囊的包埋率隨著成膜時(shí)間的延長而升高，當(dāng)成膜時(shí)間為15 min時(shí)，微膠囊的包埋率最高，然而當(dāng)成膜時(shí)間繼續(xù)延長時(shí)包埋率呈下降趨勢。這可能是由于成膜時(shí)間較長影響了殼聚糖與海藻酸鈉間的靜電吸引力，導(dǎo)致殼聚糖與海藻酸鈉形成的聚電解質(zhì)復(fù)合膜的機(jī)械強(qiáng)度降低，從而降低了微膠囊的包埋率。因此最佳成膜時(shí)間為15 min。

2.2 雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊制備工藝響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

為進(jìn)一步研究變量之間交互作用的影響關(guān)系，使用響應(yīng)面分析法篩選包埋率最佳制備工藝?；贐ox-Benhnken采樣原理，對(duì)A成膜時(shí)間、B殼聚糖濃度、C pH值3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，從而確定雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊制備工藝的最佳組合。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

利用Design-Expert 10.0.1軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立二次回歸模型，擬合得到二次多元回歸方程：Y=76.03+0.471 3A-0.4512B+2.76C-1.92AB-1.78AC+1.54BC-5.27A2-6.79B2-4.4C2。

F值可用來檢驗(yàn)各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性的高低。F值越大，則響應(yīng)變量的顯著性程度越高。當(dāng)模型顯著性檢驗(yàn)p＜0.05，說明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從表3中可以看出，3種工藝條件對(duì)包埋率影響大小順序：C>A>B，即pH值＞成膜時(shí)間＞殼聚糖濃度。模型的決定系數(shù)R2為0.986 8，而R2adj=0.969 7，能夠解釋試驗(yàn)96.97%的響應(yīng)值變異，且與預(yù)測相關(guān)系數(shù)Pred R2（0.821 8）接近，說明此試驗(yàn)?zāi)Ｐ团c真實(shí)數(shù)據(jù)擬合程度良好，具有實(shí)踐指導(dǎo)意義，由此可以用該模型來分析和預(yù)測包埋率最優(yōu)工藝。

由響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到格氏乳桿菌微膠囊包埋最佳工藝：成膜時(shí)間為15 min、殼聚糖濃度為0.6%、pH值為5.2，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得平均包埋率為76.52%，接近模型預(yù)測結(jié)果，表明此響應(yīng)面模型分析優(yōu)化包埋工藝的方法有效可行。

2.3 格氏乳桿菌微膠囊在模擬胃腸液中存活試驗(yàn)

格氏乳桿菌微膠囊在人工模擬胃液中菌體的存活率如圖4所示。

圖4 格氏乳桿菌微膠囊在人工模擬胃液中菌體的存活率Fig.4 Survival of microencapsulated Lactobacillus gasseri in simulated gastric fluid

如圖4可知，在胃液作用下菌體存活率不斷下降。經(jīng)人工模擬胃液處理2 h后，雙層包埋微膠囊的存活率為84.1%，大于未包埋菌體的存活率。結(jié)果表明在人工模擬胃液中，經(jīng)雙層包埋的格氏乳桿菌存活率大于未經(jīng)微膠囊化的格氏乳桿菌。

格氏乳桿菌微膠囊在人工模擬腸液中菌體的存活率如圖5所示。

圖5 格氏乳桿菌微膠囊在人工模擬腸液中菌體的存活率Fig.5 Survival of microencapsulated Lactobacillus gasseri in simulated intestinal fluid

由圖5可知，經(jīng)人工模擬腸液反應(yīng)1.5 h后，雙層包埋格氏乳桿菌的活菌數(shù)不再發(fā)生變化。結(jié)果表明格氏乳桿菌微膠囊腸溶性較好，有利于格氏乳桿菌在人體腸道中定殖。

2.4 格氏乳桿菌微膠囊貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)

格氏乳桿菌微膠囊在不同條件環(huán)境下的貯藏穩(wěn)定性如圖6、圖7所示。

圖6 格氏乳桿菌微膠囊在-18℃條件下的貯藏穩(wěn)定性Fig.6 Storage life of microencapsulated Lactobacillus gasseri at-18℃

圖7 格氏乳桿菌微膠囊在常溫條件下的貯藏穩(wěn)定性Fig.7 Storage life of microencapsulated Lactobacillus gasseri at room temperature

由圖6、圖7可知，在室溫（25℃）和-18℃條件環(huán)境下，微膠囊中的活菌數(shù)隨著時(shí)間的延長不斷下降，貯藏28 d后試驗(yàn)組樣品中的活菌數(shù)分別為8.31、7.14 lg（CFU/g）。經(jīng)雙層包埋后微膠囊的活菌數(shù)遠(yuǎn)高于未包埋的活菌數(shù)，說明在不同環(huán)境下微膠囊化對(duì)菌體都具有較強(qiáng)的保護(hù)作用。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，最佳制備工藝參數(shù)為成膜時(shí)間為15 min、殼聚糖濃度為0.6%、pH值為5.2。制得雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊的包埋率為76.52%。經(jīng)各試驗(yàn)表明工藝優(yōu)化后制得的微膠囊耐酸性明顯增大，在人工腸液中1.0 h～1.5 h內(nèi)可完全釋放，貯藏穩(wěn)定性明顯提高。本試驗(yàn)說明雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊具有一定的耐酸性、貯藏性，能夠提高格氏乳桿菌在人體內(nèi)的益生作用，擴(kuò)大了格氏乳桿菌的使用范圍，可為格氏乳桿菌作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑、生物防腐劑等應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐提供更多的基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。