陳蓬鳳，鄒浩峰，蔡芳，隋勇，施建斌，蔡沙，熊添，陳學玲，黃師榮，梅新*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術研究所，湖北 武漢 430064；2.湘潭大學化工學院，湖南 湘潭 411105）

甘薯（Ipomoea batats Lan.）屬于旋花科甘薯屬一年生草本，又名紅薯、番薯、地瓜等，我國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國和消費國，甘薯富含淀粉、蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[1]，還含有多酚、花青素、黏蛋白、去氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）等多種功效成分。DHEA是一種非共軛的△5，6-雙鍵及可酯化的3β-羥基甾體，不溶于水，溶于石油醚、苯、氯仿、甲醇等有機溶劑。DHEA是人體血液循環(huán)中最為豐富的甾體物質(zhì)，不僅直接參與人體甾體激素的合成，還具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、減肥、改善卵巢功能等多種功效[2-7]。

目前DHEA主要依賴于化學合成，合成步驟復雜，中間產(chǎn)物較多，DHEA得率和純度不易控制[8-9]。相比之下，微生物法反應條件溫和，各種酶促反應可實現(xiàn)DHEA充分游離。周配[10]采用微生物發(fā)法，通過微生物代謝酶對甾醇側鏈進行專一性酶解，優(yōu)化了以菜籽甾醇、谷甾醇等植物甾醇為底物高效制備DHEA的工藝。與黃姜等原料中薯蕷皂素的存在形式相似，甘薯中DHEA并不是以游離形式存在，而是與葡萄糖結合成皂甙存在于細胞內(nèi)[3]。在相關研究中，甘薯中DHEA的提取工藝主要參考薯蕷皂素的提取方法[11-13]，包括預發(fā)酵、酸水解、索氏提取等步驟，而酸水解所使用的硫酸、鹽酸等強酸，易使皂甙裂解而破壞DHEA的結構，并同時產(chǎn)生大量酸性廢液難以處理，因此，亟需開發(fā)更為高效、環(huán)保的甘薯中DHEA提取方法。

米曲霉（Aspergillus oryzae）是食品工業(yè)中常用的微生物，含有淀粉酶、糖化酶、纖維素酶等多種酶系，其中，纖維素酶系的重要組分β-葡萄糖苷酶可水解多種糖苷鍵。目前，已有采用米曲霉發(fā)酵制備薯蕷皂素的報道[14-15]，但尚未見米曲霉發(fā)酵制備DHEA相關研究。本文以甘薯生全粉為原料，在對米曲酶發(fā)酵提取物定性分析基礎上，采用單因素與響應面試驗優(yōu)化米曲霉發(fā)酵提取甘薯中DHEA工藝，旨在為甘薯中功效成分高效提取及高附加值產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯生全粉：湖北根聚地農(nóng)業(yè)發(fā)展股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司；米曲霉孢子粉：沂水（山東臨沂）錦潤生物科技有限公司；蛋白胨：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；石油醚、氫氧化鈉、氯化鈉、濃HCl、濃H2SO4（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；DHEA標準溶液（1 mg/mL，甲醇為溶劑）：Sigma-aidrich（上海）貿(mào)易有限公司；甲醇（色譜級）：Thermo Fisher科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

Waters alliance e2695高效液相色譜儀：沃特世科技有限公司；UV-2800紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；BCM-1000型生物潔凈工作臺：蘇州鴻基潔凈科技股份有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱、GZX-9240 MBE電熱鼓風干燥箱：上海精宏試驗設備有限公司；YM 75立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械公司；SB-5200D超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米曲霉孢子懸浮液制備

無菌條件下，取兩環(huán)米曲霉孢子粉接種于已滅菌的PDA斜面培養(yǎng)基上，于30℃下培養(yǎng)7 d，至斜面鋪滿綠色新生孢子，后用0.9%無菌生理鹽水將斜面新生孢子沖洗于無菌錐形瓶中，加入0.05%（體積比）吐溫20，于30℃，150 r/min下振蕩20 min混勻后經(jīng)滅菌紗布過濾，收集濾液，用0.9%無菌生理鹽水沖洗濾渣2次～3次，合并收集濾液，用生理鹽水調(diào)整濾液中孢子濃度至1×107個/mL～3×107個/mL，即得米曲霉孢子懸浮液。

1.3.2 米曲霉發(fā)酵提取DHEA工藝

蛋白胨與甘薯生全粉按質(zhì)量比4%混合，再按一定液固比加入去離子水，攪拌混勻后置于121℃下滅菌15 min得發(fā)酵培養(yǎng)基，按一定體積比于發(fā)酵培養(yǎng)基中接種米曲霉孢子懸浮液，發(fā)酵一段時間后高溫滅菌終止發(fā)酵，發(fā)酵后培養(yǎng)基冷卻后于4 000 r/min下離心15 min，收集沉淀于50℃下干燥并粉碎過60目篩得發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵產(chǎn)物按10∶1（mL/g）液固比與石油醚充分混勻后于500 W下超聲輔助提取3次，每次20 min，合并收集提取液，旋蒸去除石油醚，再用色譜級甲醇定容至5 mL，得DHEA提取物。

1.3.3 提取物中DHEA的定性定量分析

采用紫外-可見分光光度計對DHEA標準溶液與提取物進行紫外光譜掃描；在此基礎上，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）比對標準溶液與提取物中DHEA保留時間，從而對提取物中DHEA結構進行定性分析。在定性分析基礎上，采用HPLC對提取物中DHEA含量進行測定，根據(jù)DHEA標準溶液峰面積、DHEA提取物峰面積，計算DHEA得率。色譜條件：流動相為甲醇：水=80∶20（體積比）、流速 0.4 mL/min、柱溫 42 ℃、進樣量 10 μL，檢測波長200 nm。DHEA得率計算方法如下。

式中：X 為 DHEA 得率，μg/100 g；S1為 DHEA 提取物峰面積；S2為DHEA標準溶液峰面積；V為提取物定容體積，mL；C為標準溶液濃度，μg/mL；m為甘薯生全粉樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗

分別考察米曲霉孢子懸浮液的接種量（以下簡稱接種量）（4%、6%、8%、10%、12%）、發(fā)酵時間（36、48、60、72、84 h）、發(fā)酵溫度（26、28、30、32、34 ℃）、液固比[5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）]等因素對以甘薯生全粉為原料米曲酶發(fā)酵提取DHEA得率的影響。單因素試驗過程中，在探討其他單因素時，接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、液固比、分別設定為6%、30℃、72h和15∶1（mL/g）。

1.3.5 響應面及對比試驗

基于單因素試驗，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，確定中心組合試驗因素與水平，以DHEA得率為響應值進行響應面試驗，優(yōu)化以甘薯生全粉為原料米曲霉發(fā)酵提取DHEA的工藝條件，并與酶解法、預發(fā)酵-酸解法提取甘薯DHEA的得率進行對比。

預發(fā)酵-酸解法：參照楊紅花等[13]的方法。取一定量甘薯生全粉，按液固比15∶1（mL/g）與去離子水混合，攪拌制成勻漿，于60℃水浴自然發(fā)酵24 h后，加入2%（體積比）濃H2SO4加至發(fā)酵后勻漿中，混合均勻后，于90℃下水解36 h，水解液加堿中和至中性，脫水收集殘渣干燥。干燥殘渣按液固比10∶1（mL/g）與石油醚混合并密閉提取40 min，收集提取液，減壓濃縮至原來體積的1/3，旋蒸去石油醚，色譜級甲醇定容，得DHEA提取物，采用HPLC進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示；分別采用SPSS8.0分析處理數(shù)據(jù)、OriginPro 8.5繪圖、Design-Expert 10方差回歸分析。

2 結果與分析

2.1 提取物中DHEA定性分析

以DHEA標準溶液為對照，提取物中DHEA紫外掃描及色譜分析結果如圖1所示。

圖1 DHEA標準溶液與提取物紫外光譜及色譜圖Fig.1 UV spectra and chromatograms of DHEA standards and extractions

從圖1中可以看出，標準溶液與提取物紫外光譜圖基本一致，紫外最大吸收波長分別為201 nm和199 nm；且色譜圖中二者保留時間基本吻合，可以確定提取物中含有DHEA，且結構與標準溶液中DHEA結構相同。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 不同接種量下DHEA得率

接種量對DHEA得率的影響如圖2所示。

圖2 接種量對DHEA得率的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the yield of DHEA

從圖2可看出，隨接種量升高，DHEA得率呈明顯先上升后下降變化趨勢。當接種量介于4%～10%之間時，接種量對以甘薯生全粉為原料米曲酶發(fā)酵提取DHEA得率有顯著（p＜0.05）影響；接種量超過10%時，繼續(xù)提升接種量，DHEA得率無顯著變化；接種量為6%時，DHEA得率最高，達61.32 μg/100 g。一定范圍內(nèi)提高米曲酶孢子懸浮液接種量，可提升培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分利用率，豐富發(fā)酵液中酶的種類，提高酶的濃度和含量，進而提高DHEA得率[14]；但接種量超過一定范圍后，因短時間內(nèi)米曲酶菌絲體絕對數(shù)量急劇增加，引發(fā)培養(yǎng)基碳源氮源快速消耗，加之發(fā)酵液溶氧量不足，最終影響菌絲體生長及酶的合成[18]。

2.2.2 不同發(fā)酵時間下DHEA得率

發(fā)酵時間對DHEA得率的影響如圖3所示。

圖3 發(fā)酵時間對DHEA得率的影響Fig.3 Effect of fermentation time on the yield of DHEA

從圖3可看出，隨發(fā)酵時間延長，DHEA得率呈顯著先上升后下降變化趨勢（p＜0.05）。發(fā)酵36 h時，DHEA得率最低，僅為 12.20 μg/100 g；發(fā)酵 72 h 時，DHEA 得率最高，為79.34μg/100g。研究表明，發(fā)酵48h～72 h是米曲霉生長繁殖的高峰期，發(fā)酵時間不足，發(fā)酵液中菌絲體絕對數(shù)量不高，產(chǎn)酶不足進而影響DHEA得率[19]；發(fā)酵時間太長，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多，米曲酶生長減緩甚至衰亡，可水解糖苷鍵等酶的產(chǎn)量降低[20]，導致培養(yǎng)基中DHEA不能充分游離，最終其得率下降。

張清元覺得，唐小芹是孤兒院里最漂亮的女孩。她比那幫小家伙要大一些，但比張清元要小。黎院長就叫她小芹子。小芹子是一個從下江逃難來的女人留在河口的。張清元第一次見到小芹子是在河口。他之所以能記住小芹子，是因為她的嘴唇上長有一顆鮮亮突起的黑痣，圓圓的。他聽大人們說過，那顆痣就叫美人痣，乍一看有些刺眼，但看過之后就覺得這女孩漂亮，過目難忘。

2.2.3 不同發(fā)酵溫度下DHEA得率

發(fā)酵溫度對DHEA得率影響結果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵溫度對DHEA得率的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the yield of DHEA

由圖4可知，DHEA得率隨著發(fā)酵溫度升高呈顯著地（p＜0.05）先上升后下降變化趨勢，發(fā)酵溫度為26℃時，DHEA 得率最低，僅為 17.08 μg/100 g；發(fā)酵溫度為30℃時，DHEA得率最高，達96.57 μg/100 g，發(fā)酵溫度超過30℃時，菌絲體老化加速，其產(chǎn)酶能力及酶活下降[19]，導致DHEA得率降低。

2.2.4 不同液固比下DHEA得率

液固比對DHEA得率的影響如圖5所示。

圖5 液固比對DHEA得率的影響Fig.5 Effect of liquid-to-materials ratio on the yield of DHEA

從圖5可看出，隨液固比的升高，DHEA得率呈顯著（p＜0.05）地先上升后下降變化趨勢。液固比為25∶1（mL/g）時，DHEA得率最低，僅為19.34μg/100g；液固比為 15∶1（mL/g）時，DHEA 得率最高，達 73.56μg/100g。液固比高低直接影響米曲酶生長環(huán)境，如營養(yǎng)物質(zhì)的濃度、培養(yǎng)液滲透壓以及黏度等，液固比過高或過低均不利于米曲酶生長繁殖，導致其產(chǎn)酶能力下降，最終影響DHEA得率[17]。

2.3 響應面法優(yōu)化試驗設計及結果

2.3.1 回歸模型建立與方差分析

基于單因素試驗結果，依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，以接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、液固比為自變量，DHEA得率為響應值進行響應面試驗，優(yōu)化以甘薯生全粉為原料米曲霉發(fā)酵提取DHEA工藝條件。選取3個中心點，進行四因素三水平試驗，響應面試驗設計及結果如表1所示。

表1 響應面試驗設計及結果Table 1 Test design and results of response surface experiment

采用Box-Behnken方法對試驗結果進行多元回歸擬合，得到DHEA得率對試驗自變量的二次多項回歸方程：Y=96.64+7.4A+0.1B-2.43C-0.33D-5.48AB+1.75AC-0.89AD+10.82BC+1.43BD-1.02CD-34.55A2-34.82B2-43.79C2-50.21D2。

回歸模型及方差分析見表2。

表2 回歸模型及方差分析Table 2 Regression model and analysis of variance

由表2可知，回歸模型極顯著（p＜0.01），且失擬項不顯著（p＞0.05），說明殘差是由隨機誤差引起。計算結果顯示，模型校正決定系數(shù)（Radj2）為0.923 5，證明該模型可解釋92.35%的響應值變化；模型相關系數(shù)（R2）為0.961 7，表明該回歸方程擬合度高，能用來預測以甘薯生全粉為原料米曲酶發(fā)酵提取DHEA的發(fā)酵工藝。表2還反映了4個自變量對響應值DHEA得率的影響程度，各因素對DHEA得率影響大小順序：接種量＞發(fā)酵溫度＞液固比＞發(fā)酵時間。其中，因素A和BC的交互作用對DHEA得率有顯著影響（p＜0.05）。

2.3.2 響應面分析與優(yōu)化

等高線圖能直觀展現(xiàn)各因素對響應值的影響程度，以及各參數(shù)之間的相互作用，圓形表明兩因素間相互作用對DHEA得率的影響不顯著。接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、液固比之間交互作用對DHEA得率的影響如圖6所示。

圖6 各因素之間的交互作用對DHEA得率影響的等高線圖Fig.6 Contour map of the influence of the interaction between various factors on the yield of DHEA

從圖6的等高線圖可以看出，以DHEA得率為響應值，AB、AC、AD、BD、CD 的交互作用等高線均呈圓形，說明這些因素對DHEA得率無交互影響；而BC交互作用等高線呈橢圓形，結合表2的回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結果，表明BC間交互作用對DHEA得率有顯著影響，即發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間的交互作用對DHEA得率有顯著影響。響應面試驗優(yōu)化得到以甘薯生全粉為原料米曲霉發(fā)酵提取DHEA的最佳工藝：米曲酶孢子懸浮液接種量6.21%，發(fā)酵溫度29.95℃，發(fā)酵時間71.86 h，甘薯生全粉與蛋白胨混合物與去離子水的液固比 14.98∶1（mL/g），此工藝下 DHEA 理論得率為 97.07 μg/100 g。

2.4 驗證與對比試驗

基于實際操作可行性，開展米曲酶發(fā)酵提取甘薯生全粉中DHEA工藝預測模型準確性的驗證試驗，選取接種量6%，發(fā)酵時間72 h，發(fā)酵溫度30℃，液固比15∶1（mL/g）等工藝參數(shù)，DHEA 得率 94.70 μg/100 g，與理論值97.07 μg/100 g基本吻合。說明響應面分析方法對米曲霉發(fā)酵提取甘薯生全粉中DHEA的發(fā)酵條件優(yōu)化是可行的。

米曲霉發(fā)酵提取甘薯生全粉中DHEA得率與其他方法比較結果如表3所示。

表3 不同制備方法的DHEA得率對比Table 3 Comparison of DHEA yields of different extraction methods

從表3中可看出，米曲霉發(fā)酵提取DHEA得率顯著（p＜0.05）高于現(xiàn)有的預發(fā)酵-酸解法、酶解法。

3 結論

去氫表雄酮是甘薯中一種功能性成分，目前米曲霉發(fā)酵提取甘薯中DHEA的相關研究較少。本文探討優(yōu)化以甘薯生全粉為原料米曲霉發(fā)酵提取DHEA工藝，基于單因素試驗結果，進行響應面試驗優(yōu)化并驗證得到米曲霉發(fā)酵提取甘薯生全粉中DHEA最佳工藝條件為：接種量6%，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間72 h，液固比 15∶1（mL/g），此條件下 DHEA 得率為 94.70 μg/100 g，且得率顯著（p＜0.05）高于現(xiàn)有的酶解法、預發(fā)酵-酸解法等方法。米曲霉發(fā)酵提取甘薯DHEA可為甘薯中功效成分深度發(fā)掘利用以及甘薯高附加值產(chǎn)品開發(fā)提供依據(jù)和技術支持。