檀 振，劉意億，張厚澤，王靖雯，農(nóng)旭華*

（1.熱帶藥用資源化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158；2.熱帶藥用植物化學(xué)海南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 海口 571158）

海洋沉積物腐殖質(zhì)含量豐富，是海洋微生物重要的棲息地之一。從海洋沉積物來(lái)源微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中尋找結(jié)構(gòu)新穎的活性化合物是藥物先導(dǎo)分子發(fā)現(xiàn)的重要途徑。海洋放線(xiàn)菌分布廣泛，種類(lèi)多樣，其活性次級(jí)代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的藥用潛力[1]。從現(xiàn)有的研究報(bào)道來(lái)看，海洋沉積物中的放線(xiàn)菌大多為鏈霉菌屬。近年來(lái)，從海洋沉積物來(lái)源鏈霉菌中分離鑒定出生物堿、大環(huán)內(nèi)酯、肽類(lèi)等多種類(lèi)型的次級(jí)代謝產(chǎn)物，表現(xiàn)出抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒等顯著的生物活性[2]。

植物病原真菌是農(nóng)作物主要的病害，常常引起農(nóng)作物發(fā)生枯萎病、炭疽病等，造成農(nóng)作物減產(chǎn)[3]。目前的防控措施主要是通過(guò)使用化學(xué)農(nóng)藥來(lái)控制，如氟、砷等殺蟲(chóng)劑及滴滴涕等。然而，長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥不僅使病原真菌產(chǎn)生耐藥性，還引起嚴(yán)重的食品安全和環(huán)境污染問(wèn)題[4]。因此，尋找高效安全的綠色替代農(nóng)藥是當(dāng)前需要解決的問(wèn)題，也是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必然選擇。海洋放線(xiàn)菌長(zhǎng)期生活在高鹽和低溫等復(fù)雜環(huán)境，形成自身獨(dú)特的代謝調(diào)控途徑，次級(jí)代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)多樣性和顯著的生物活性，是研制高效、環(huán)境友好型農(nóng)藥的寶貴資源[5]。本文以一株海洋沉積物來(lái)源放線(xiàn)菌為研究對(duì)象，從其次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離鑒定10 個(gè)單體化合物，分別為cyclo-（trans-4-OH-D-Pro-D-Phe）（1），cyclo-（D-Pro-D-Phe）（2），cyclo-（L-Ala-L-Phe）（3），cyclo-（L-leucine-L-proline）（4），cyclo-（L-Leu-trans-4-hydroxy-L-Pro）（5），cyclo-（D-Pro-DIle）（6），trans-2-methylcinnamic acid（7），indole-3-carboxaldehyde（8），2-pyrrolecarboxylic acid（9），2-hydroxy phenyl acetic acid（10）（圖1）。應(yīng)用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)4 株植物病原真菌展開(kāi)活性篩選，發(fā)現(xiàn)化合物10 在100μg/disc下對(duì)水稻稻瘟真菌Pyricularia oryzaeHNM 1003具有微弱的抑制活性，抑制圈直徑為8 mm。

圖1 化合物1～10的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structures of compounds 1～10

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

核磁共振儀Bruker AV-400MHz，瑞士Bruker 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELA N-1001，日本東京理化；冷卻水循環(huán)裝置EYELA COOLACE CA-IIII，日本東京理化；真空泵EYELA A-10000S，日本東京理化；制備高效液相色譜儀Agilent 1260 系列，色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18 column（250 mm×9.4 mm，5μm），美國(guó)安捷倫公司；硅膠（200～400目），青島海洋化工廠(chǎng)產(chǎn)品。提取分離用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿等均為工業(yè)用化學(xué)純產(chǎn)品，重蒸后使用，高效液相制備流動(dòng)相的甲醇為色譜級(jí)。

1.2 海洋放線(xiàn)菌Streptomyces sp. AHMU XC 2026 次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離

1.2.1 菌種材料

菌株從連云港市海州灣-15 cm深海岸帶（34.944°N 119.210°E）沉積物樣品中分離得到，并通過(guò)16S序列比對(duì)進(jìn)行菌種鑒定。

1.2.2 菌種發(fā)酵培養(yǎng)基

可溶性淀粉2%，葡萄糖1%，細(xì)菌學(xué)蛋白胨0.5%，酵母提取物0.5%，NaCl 0.4%，K2HPO40.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCO30.2%。

1.2.3 浸膏的提取發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心得到菌液和菌體，菌液使用等體積的乙酸乙酯萃取3次得到浸膏；菌體使用丙酮萃取3次，再用乙酸乙酯反萃，得到浸膏；二者合并。

1.2.4 化合物的分離

浸膏5 g 用氯仿和甲醇溶解，過(guò)正相色譜柱，石油醚-乙酸乙酯兩相體系作為洗脫液（V/V，10%，20%，30%，50%，100%），再用氯仿-甲醇體系（V/V，10%～30%）洗脫，經(jīng)TLC 分析合并得到9個(gè)餾分（Fr.1～Fr.9）。餾分Fr.5（301 mg）過(guò)正相色譜柱，石油醚-乙酸乙酯為洗脫液（V/V，10%，20%，30%，50%，100%），經(jīng)TLC分析合并得到3 個(gè)亞餾分（Fr.5-1～Fr.5-3）；亞餾分Fr.5-2 通過(guò)RP-HPLC 制備（流動(dòng)相MeOH∶H2O = 55∶45，2 mL/min）得到化合物9（11mg，tR= 4.8 min）；亞餾分Fr.5-3 重結(jié)晶得到化合物10（151 mg）。餾分Fr.6（243 mg）過(guò)正相色譜柱，石油醚-乙酸乙酯體系洗脫（20%、30%、50%、100%），結(jié)合TLC分析合并得到4個(gè)亞餾分（Fr.6-1～Fr.6-4）；亞餾分Fr.6-2經(jīng)RP-HPLC 制備（流動(dòng)相MeOH∶H2O=45∶55，2 mL/min）得到化合物7（10 mg，tR=30 min）；亞餾分Fr.6-4經(jīng)RP-HPLC 制備（流動(dòng)相MeOH∶H2O=55∶45，2 mL/min）得到化合物8（20 mg，tR=2.4 min）。餾分Fr.8（1.83 g）過(guò)正相色譜柱，石油醚-乙酸乙酯體系洗脫（30%～100%），經(jīng)TLC分析合并得到3個(gè)亞餾分（Fr.8-1～Fr.8-3）；亞餾分Fr.8-1由RP-HPLC 制備（流動(dòng)相MeOH∶H2O=35∶65，2 mL/min）得到化合物6（27 mg，tR=5.2 min），4（116 mg，tR=10.3 min）和2（12 mg，tR=12.5 min）；亞餾分Fr.8-2重結(jié)晶得到化合物5（45 mg）。餾分Fr.9（2.13g）過(guò)正相色譜柱，氯仿-甲醇體系洗脫（V/V，10%～30%），經(jīng)TLC分析合并得到4個(gè)亞餾分（Fr.9-1～Fr.9-4）；亞餾分Fr.9-2經(jīng)RP-HPLC 制備（流動(dòng)相MeOH∶H2O=27∶73，2 mL/min）得到化合物3（8 mg，tR=25 min）和1（50 mg，tR=27 min）。

1.3 抗植物病原真菌活性測(cè)試

按照文獻(xiàn)[6]采用濾紙片擴(kuò)散法，使用涂布棒把水稻稻瘟真菌Pyricularia oryzaeHNM 1003、芒果炭疽病菌Colletotrichum asianumHNM 408、橡膠樹(shù)炭疽病菌Colletotrichum acutatumHNMRC 178 和香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporumHNM 1003 孢子均勻涂布在含PDA 培養(yǎng)基平板上。將單體化合物樣品用DMSO 配制為20 mg/mL，待用。用打孔器將濾紙制成直徑為6 mm的無(wú)菌小圓紙片，貼于準(zhǔn)備好的含指示菌PDA培養(yǎng)基平板中。用定量移液槍吸取5μL待測(cè)化合物樣品滴加在濾紙片上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈。重復(fù)3次，同時(shí)以多菌靈為陽(yáng)性對(duì)照，DMSO為空白對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2. 1 菌株鑒定

以所提取的總DNA 為模板，利用通用引物27F（5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1525R（5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到其16S rDNA序列，經(jīng)純化測(cè)序后，菌株Streptomycessp.XC2026的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 517 bp（基因登錄號(hào)為CP064057.1），通過(guò)比較基因序列的同源性，發(fā)現(xiàn)與Streptomycessp.ZJ306（基因登錄號(hào)為KF954540.1）序列99%吻合，故鑒定為Streptomyces（圖2）。

圖2 放線(xiàn)菌Streptomyces sp.AHMU XC 2026的形態(tài)學(xué)特征Figure 2 Specific morphological characteristics of Streptomyces sp.AHMU XC 2026

2.2 單體化合物的波譜數(shù)據(jù)

化合物1：白色無(wú)定性粉末，ESI-MS數(shù)據(jù)為m/z283.1（［M+Na］+），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：7.29（5H，m，Ph），4.41（1H，m，H-4），4.32（1H，dd，J=6.4，11.2 Hz，H-6），4.20（1H，dd，J=4.8，5.2 Hz，H-9），3.53（1H，dd，J=4.8，12.4 Hz，H-3α），3.18（1H，d，J=12.4 Hz，H-3β），3.10（1H，dd，J=5.2，14.4 Hz，H-10a），3.03（1H，dd，J=4.8，14.4 Hz，H-10b），1.96（1H，dd，J=6.4，12.8 Hz，H-5a），1.53（1H，m，H-5b）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：169.6（C，C-1），165.3（C，C-7），137.3（C，C-11），129.9（CH，C-12，C-16），128.1（CH，C-13，C-15），126.4（CH，C-14），66.8（CH，C-4），57.0（CH，C-6），55.7（CH，C-9），53.9（CH2，C-3），37.3（CH2，C-5），35.3（CH2，C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[7]的基本一致，故鑒定該化合物為cyclo-（trans-4-OH-D-Pro-D-Phe）。

化合物2：白色無(wú)定性粉末，ESI-MS數(shù)據(jù)為m/z243.0（［M-H］-），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：7.26（5H，m，Ph），4.36（1H，t，J=5.2 Hz，H-9），4.00（1H，dd，J=6.8，9.6 Hz，H-6），3.39（1H，m，H-3a），3.35（1H，m，H-3b），3.09（1H，dd，J=5.2，14.4 Hz，H-10a），3.09（1H，dd，J=5.2，14.4 Hz，H-10b），2.03（1H，m，H-5a），1.75（1H，m，H-5b），1.71（1H，m，H-4a），1.44（1H，m，H-4b）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：169.0（C，C-1），165.1（C，C-7），137.2（C，C-11），129.9（CH，C-13，C-15），128.0（CH，C-12，C-16），126.4（CH，C-14），58.4（CH，C-6），55.7（CH，C-9），44.6（CH2，C-3），35.4（CH2，C-10），27.8（CH2，C-5），21.9（CH2，C-4）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[7]的基本一致，故鑒定該化合物為cyclo-（D-Pro-D-Phe）。

化合物3：白色無(wú)定性粉末，ESI-MS 數(shù)據(jù)為m/z219.1（［M+H］+），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH7.29（5H，m，Ph），4.18（1H，m，H-3），3.63（1H，m，H-6），3.14（1H，dd，J=3.6，13.6 Hz，H-7a），2.87（1H，dd，J=4.8，13.6 Hz，H-7b），0.45（3H，d，J=7.2 Hz，H-14）；

13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：167.7（C，C-1），165.8（C，C-4），136.0（C，C-8），130.4（CH，C-9，C-13），128.1（CH，C-10，C-12），126.7（CH，C-11），55.3（CH，C-3），49.7（CH，C-6），38.3（CH2，C-7），19.7（CH3，C-14）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[8]的基本一致，故鑒定該化合物為cyclo-（L-Ala-L-Phe）。

化合物4：白色無(wú)定性粉末，ESI-MS 數(shù)據(jù)為m/z211.2（［M+H］+），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：4.20（1H，t，J=8.0 Hz，H-6），4.01（1H，dd，J=5.6，6.4 Hz，H-9），3.39（2H，m，H-3），2.15（1H，m，H-5a），1.94（1H，m，H-5b），1.85（2H，m，H-4），1.81（2H，m，H-10），1.38（1H，m，H-11），0.87（3H，d，J= 6.4 Hz，H-12），0.86（3H，d，J=6.4 Hz，H-13）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：170.5（C，C-1），166.7（C，C-7），58.5（CH，C-6），52.7（CH，C-9），44.9（CH2，C-3），37.8（CH2，C-10），27.5（CH2，C-5），24.1（CH，C-11），22.9（CH2，C-4），22.5（CH3，C-12），22.0（CH3，C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[7]的基本一致，故鑒定該化合物為cyclo-（L-leucine-L-proline）。

化合物5：白色無(wú)定性粉末，ESI-MS數(shù)據(jù)為m/z249.1（［M+Na］+），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：8.00（1H，s，NH），5.12（1H，s，4-OH），4.41（1H，dd，J=3.5，10.8 Hz，H-6），4.29（1H，m，H-4），4.06（1H，t，J=6.0 Hz，H-9），3.50（1H，dd，J=4.4，12.4 Hz，H-3a），3.24（1H，d，J=12.4 Hz，H-3b），2.07（1H，dd，J=6.8，13.2 Hz，H-5a），1.96（1H，m，H-5b），1.87（1H，m，H-11），1.80（1H，m，H-10a），1.38（1H，m，H-10b），0.87（3H，d，J=6.4 Hz，H-12），0.86（3H，d，J=6.4 Hz，H-13）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：170.8（C，C-7），166.6（C，C-1），67.1（CH，C-4），57.1（CH，C-6），53.7（CH2，C-3），52.6（CH，C-9），37.8（CH2，C-10），36.7（CH2，C-5），24.1（CH，C-11），22.8（CH3，C-12），21.9（CH3，C-13）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[9]的基本一致，故鑒定該化合物為cyclo-[L-Leu-trans-4-hydroxy-L-Pro]。

化合物6：白色無(wú)定性粉末，ESI-MS 數(shù)據(jù)為m/z219.1（［M+H］+），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：4.13（1H，dd，J=1.6，7.2 Hz，H-6），3.91（1H，brs，H-9），3.60（1H，m，H-3a），3.37（1H，m，H-3b），2.37（1H，m，H-10），2.16（1H，m，H-5a），1.88（1H，m，H-5b），1.82（2H，m，H-4），1.01（3H，d，J=7.2 Hz，H-11），0.85（3H，d，J= 7.2 Hz，H-12）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：170.3（C，C-1），165.3（C，C-7），59.5（CH，C-9），58.3（CH，C-6），44.7（CH2，C-3），27.9（CH，C-10），27.8（CH2，C-5），22.1（CH2，C-4），18.4（CH3，C-11），16.4（CH3，C-12）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[7]的基本一致，故鑒定該化合物為cyclo-（D-Pro-DIle）。

化合物7：白色粉末，ESI-MS 數(shù)據(jù)為m/z162.2（［M+H］+），1H NMR（400 MHZ，DMSO-d6）δH：7.66（1H，d，J=15.6 Hz，H-3），7.54（1H，J=1.6，8.0 Hz，H-5），7.28（1H，overlapped，H-7），7.25（1H，overlapped，H-6），7.23（1H，overlapped，H-8），6.53（1H，d，J=15.6 Hz，H-2），2.36（3H，s，H3-10）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：166.7（C，C-1），136.7（C，C-5），136.5（CH，C-3），133.7（C，C-4），130.6（CH，C-6），129.1（CH，C-7），126.3（CH，C-8），125.9（CH，C-9），123.5（CH，C-2），19.3（CH3，C-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[10]比對(duì)，鑒定該化合物為trans-2-methylcinnamic acid（反式-2-甲基-肉桂酸）。

化合物8：白色粉末，ESI-MS 數(shù)據(jù)為m/z151.1（［M-H］-），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：6.99（1H，td，J=1.6，7.6 Hz，H-7），6.92（1H，dd，J=1.6，7.6 Hz，H-8），6.65（1H，t，J=7.6 Hz，H-6），6.61（1H，d，J=7.6 Hz，H-5），3.19（2H，s，H-2）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：176.2（C，C-1），158.1（C，C-4），130.1（CH，C-8），127.1（CH，C-6），124.9（C，C-3），117.9（CH，C-7），117.0（CH，C-5），44.3（CH2，C-2）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[11]的基本一致，故鑒定該化合物為2-hydroxy phenyl acetic acid（2-羥基苯乙酸）。

化合物9：白色無(wú)定形粉末，ESI-MS 數(shù)據(jù)為m/z146.0（［M+H］+），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：9.92（1H，s，H-8），8.28（1H，s，H-2），8.09（1H，d，J=7.6 Hz，H-4），7.53（1H，d，J=7.6 Hz，H-7），7.27（2H，overlapped，H-5，H-6）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：184.9（C，C-8），138.6（CH，C-2），137.1（C，C-7a），124.1（C，C-3a），123.4（CH，C-6），122.1（CH，C-5），120.8（CH，C-4），118.1（C，C-3），112.5（CH，C-7）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[11]的基本一致，故鑒定該化合物為indole-3-carboxaldehyde（3-吲哚甲醛）。

化合物10：無(wú)色粉末，ESI-MS 數(shù)據(jù)為m/z110.2（［M-H］-），1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δH：11.64（1H，s，NH），6.94（1H，dd，J=2.4，4.5 Hz，H-3），6.79（1H，br m，H-4），6.13（1H，J=2.4，8.4 Hz，H-5）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δC：162.7（C，C-6），123.9（CH，C-5），123.5（C，C-2），115.4（CH，C-3），110.0（CH，C-4）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[12]的基本一致，故鑒定該化合物為2-pyrrolecarboxylic acid（2-吡咯甲酸）。

2.3 抗植物病原真菌活性結(jié)果

抗菌結(jié)果顯示化合物10在100μg/disc條件下能夠抑制Pyricularia oryzaeHNM 1003的生長(zhǎng)，其抑制圈直徑為8 mm，在相同條件下陽(yáng)性對(duì)照多菌靈抑制直徑為30 mm，DMSO 溶劑作為陰性對(duì)照未顯示任何抑制活性。

3 結(jié)論

本文從海洋沉積物來(lái)源的放線(xiàn)菌Streptomycessp.AHMU XC 2026次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離到10個(gè)單體化合物，包括6 個(gè)二酮哌嗪（1～6），反式-2-甲基-肉桂酸（7），2-羥基苯乙酸（8），3-吲哚甲醛（9）和2-吡咯甲酸（10），其中化合物7為首次從自然界中分離到的天然產(chǎn)物。對(duì)這些化合物的抗植物病原真菌活性篩選表明，化合物10對(duì)水稻稻瘟真菌Pyricularia oryzaeHNM 1003具有微弱的抑制活性，以它為模板修飾結(jié)構(gòu)進(jìn)而提高抗真菌活性還有挖掘的空間。同時(shí)，化合物10為該菌株主要的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一，含量較高（3%以上），暗示著該化合物可能還有其它化學(xué)生態(tài)學(xué)功能。