吳琳 邱建維 黃靈芝

(浙江特殊教育職業(yè)學(xué)院，浙江 杭州 310023)

癲癇是病理生理學(xué)中極為常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病原因復(fù)雜，部分癲癇患者不能有效控制，可發(fā)展為難治性典型，另外，癲癇的發(fā)作還能夠誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙、視物能力障礙及情緒障礙等一系列問(wèn)題〔1〕。miRNA是一類(lèi)具有廣泛作用的非編碼RNA，參與調(diào)控疾病、正常生理過(guò)程〔2〕。癲癇的發(fā)生與miRNA的異常表達(dá)具有密切關(guān)系，已有多種miRNA被證實(shí)可能參與癲癇進(jìn)展〔3〕。有報(bào)道表明〔4，5〕，miR-29a在神經(jīng)損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。目前尚不清楚miR-29a在癲癇中的作用及機(jī)制。本研究旨在探討miR-29a調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)對(duì)癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 SD大鼠，雌雄各半，6～8周齡，體重180～220 g，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，許可證號(hào)：SCXK(浙)2019-0002。原位末端標(biāo)記(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)；兔抗c-Myc抗體由美國(guó)Cell Signaling Technology公司生產(chǎn)；丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；兔抗β-catenin抗體由美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司生產(chǎn)；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程研究所有限公司生產(chǎn)；兔抗Bax抗體由美國(guó)GeneTex公司生產(chǎn)；miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒由賽爾瑞成(北京)生命科學(xué)技術(shù)有限公司生產(chǎn)；mimics control、miR-29a mimics由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；兔抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2抗體由美國(guó)Abcam公司生產(chǎn)；硫酸阿托品、氯化鋰、Wnt/β-catenin激活劑SB216763由上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)；匹羅卡品(毛果蕓香堿)，規(guī)格：100mg，純度≥98%，由北京沃凱生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2模型構(gòu)建〔5〕大鼠經(jīng)過(guò)適應(yīng)性飼養(yǎng)后，按照氯化鋰-匹羅卡品方法構(gòu)建癲癇大鼠模型。步驟為：首先腹腔注射3 mmol/kg氯化鋰，18 h后，繼續(xù)腹腔注射1 mg/kg硫酸阿托品，30 min后，再次注射35 mg/kg匹羅卡品。然后按照Racine分級(jí)方法測(cè)定癲癇發(fā)作的級(jí)別，大鼠癲癇發(fā)作級(jí)別達(dá)到Ⅳ級(jí)后，視為造模成功。癲癇發(fā)作后，大鼠恢復(fù)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)文獻(xiàn)〔5〕。

1.3實(shí)驗(yàn)分組處理 48只癲癇大鼠隨機(jī)分成模型組、miR-NC組、miR-29a組、miR-29a+SB216763組，每組12只，選擇12只正常大鼠作為對(duì)照組。miR-NC、miR-29a組分別在造模成功后大鼠狀態(tài)良好時(shí)腦側(cè)室注射10 μl mimics control(10 mg/kg)、miR-29a mimics(10 mg/kg)〔6〕，miR-29a+SB216763組在造模成功后在大鼠狀態(tài)良好時(shí)腦側(cè)室注射10 μl miR-29a mimics(10 mg/kg)和10 μl Wnt/β-catenin激活劑SB216763(0.1 g/μl)〔7〕，連續(xù)注射7 d。模型組和對(duì)照組大鼠注射等量的生理鹽水。從第8天開(kāi)始進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，空間探索檢測(cè)后，水合氯醛麻醉大鼠，取大鼠海馬神經(jīng)組織，用于實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4qRT-PCR方法檢測(cè)miR-29a表達(dá) 取大鼠海馬神經(jīng)組織，添加Trizol試劑提取總RNA。以miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒對(duì)miR-29a表達(dá)進(jìn)行半定量分析。內(nèi)參設(shè)置為U6，計(jì)算方法為2-△△Ct法。引物序列〔8〕為miR-29a上游：TAGCACCATTTGAAATCAGTTT，下游:TGCGTGTCGTGGAGTC；U6上游:CTCGCTTCGGCAGCACATA，下游：GTGCAGGGTCCGAGGT。

1.5Western印跡檢測(cè)β-catenin、c-Myc、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Bcl-2蛋白表達(dá) 取大鼠海馬神經(jīng)組織，按照每50 mg組織中添加100 μl的裂解液提取總蛋白。參照二喹啉甲酸(BCA)方法檢測(cè)蛋白濃度，配制10%分離膠、5%濃縮膠，每個(gè)樣品孔內(nèi)添加30 μg蛋白，先以80 V電壓電泳0.5 h，然后以100 V電壓電泳2 h。100 V電壓轉(zhuǎn)膜80 min。聚偏氯乙烯(PVDF)膜置于5%脫脂奶粉內(nèi)，室溫、搖床孵育2 h。將PVDF膜放在稀釋后的一抗、二抗內(nèi)，在室溫中結(jié)合2 h。β-catenin、Bax、Bcl-2一抗以1∶1 000稀釋?zhuān)琧-Myc一抗以1∶800稀釋。二抗以1∶2 000稀釋。電化學(xué)發(fā)光(ECL)方法顯色。以Image J分析條帶的灰度值。GAPDH為參照，分析目的蛋白表達(dá)變化。

1.6水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力 用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。圓形水池分成4個(gè)象限，分別為W、E、N、S，在每個(gè)象限選取一個(gè)固定的入水點(diǎn)。將白色平臺(tái)固定于N象限中部位置，在水池中注水，水溫為22℃，添加二氧化鈦，充分?jǐn)嚢?，此時(shí)水池不透明。大鼠每天訓(xùn)練2次，訓(xùn)練4 d，大鼠頭部面向池壁放入水中，當(dāng)大鼠游到平臺(tái)時(shí)，保持大鼠在平臺(tái)上逗留30 s，如果120 s大鼠仍然沒(méi)有找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將大鼠引導(dǎo)平臺(tái)。第5天時(shí)，記錄大鼠從入水到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。第6天時(shí)進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將平臺(tái)撤掉，記錄大鼠在120 s內(nèi)穿過(guò)平臺(tái)位置的次數(shù)，記錄大鼠在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間。

1.7TUENL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取大鼠海馬神經(jīng)組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用濃度梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋、切片，切片厚度為4 μm，在45℃的烘箱中烤干。二甲苯脫蠟，濃度梯度酒精水合，用0.1% Triton X-100通透，3%過(guò)氧化氫封閉，滴加TdT反應(yīng)液，添加Streptavidin-HRP溶液，加上蓋玻片，避光反應(yīng)30 min。DAPI染色，封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=(凋亡數(shù)目÷細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.8SOD、MDA、GSH-Px檢測(cè) 取大鼠海馬神經(jīng)組織，以SOD檢測(cè)試劑盒(可見(jiàn)分光光度法)、MDA檢測(cè)試劑盒(可見(jiàn)分光光度法)、GSH-Px檢測(cè)試劑盒(比色法)測(cè)定SOD、MDA、GSH-Px含量，步驟完全根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組β-catenin、c-Myc、miR-29a表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組海馬神經(jīng)組織β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)量升高，miR-29a表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-29a組β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)量降低，miR-29a表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與miR-29a組比較，miR-29a+SB216763組β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。 見(jiàn)圖1，表1。

1～5:對(duì)照組、模型組、miR-NC組、miR-29a組、miR-29a+SB216763組；下圖同圖1 Western印跡方法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)組織中Wnt/β-catenin信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 各組大鼠海馬神經(jīng)組織中β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)量和miR-29a表達(dá)量比較

2.2各組逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)家限停留時(shí)間比較 與對(duì)照組比較，模型組逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，平臺(tái)象限停留時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-29a組逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增多，平臺(tái)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與miR-29a組比較，miR-29a+SB216763組逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，平臺(tái)象限停留時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見(jiàn)表2。

表2 各組逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限停留時(shí)間比較

2.3各組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 與對(duì)照組〔(10.12±1.25)%〕比較，模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)〔(24.78±2.69)%〕顯著升高(P<0.05)；與miR-NC組〔(23.84±2.95)%〕比較，miR-29a組〔(15.02±1.64)%〕顯著降低(P<0.05)；與miR-29a組比較，miR-29a+SB216763組〔(20.17±1.53)%〕顯著升高(P<0.05)。

2.4各組神經(jīng)組織中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組海馬神經(jīng)組織中Bax蛋白量升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-29a組海馬神經(jīng)組織中Bax蛋白量降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與miR-29a組比較，miR-29a+SB216763組海馬神經(jīng)組織中Bax蛋白量升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量降低(P<0.05)。 見(jiàn)圖2，表3。

圖2 Western印跡方法檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)組織中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠海馬神經(jīng)組織中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)量比較

2.5各組海馬神經(jīng)組織中SOD、MDA、GSH-Px含量比較 與對(duì)照組比較，模型組海馬神經(jīng)組織中MDA含量升高，SOD、GSH-Px含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-29a組海馬神經(jīng)組織MDA含量降低，SOD、GSH-Px含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與miR-29a組比較，miR-29a+SB216763組海馬神經(jīng)組織MDA含量升高，SOD、GSH-Px含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見(jiàn)表4。

表4 各組海馬神經(jīng)組織中SOD、MDA、GSH-Px含量比較

3 討 論

癲癇作為常見(jiàn)疾病，其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，包括神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等〔9〕。很多癲癇患者表現(xiàn)為認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力下降，與神經(jīng)損傷密切相關(guān)〔10〕。癲癇病理?xiàng)l件下，神經(jīng)組織中產(chǎn)生大量的氧自由基，這些氧自由基的積累與抗氧化酶SOD、GSH-Px活性降低有關(guān)，過(guò)量的氧自由基不僅可以誘導(dǎo)脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化，造成細(xì)胞損傷，還可以激活細(xì)胞凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔11,12〕。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化后的產(chǎn)物，其含量升高標(biāo)志細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增加〔13〕。Bax和Bcl-2均為Bcl-2蛋白家族成員，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)和抑制作用〔14〕。miRNA是近些年來(lái)分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域，其在細(xì)胞分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮作用，且還與很多疾病的發(fā)生有關(guān)〔15〕。miR-29a在神經(jīng)損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，miR-29a對(duì)缺氧誘導(dǎo)的新生鼠神經(jīng)損傷有改善作用〔16〕，miR-29a還可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化、延長(zhǎng)軸突〔4〕。本研究結(jié)果說(shuō)明miR-29a可促進(jìn)癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)，減少細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，miR-29a在癲癇中發(fā)揮抑制功效。

本文還進(jìn)一步研究了miR-29a的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-29a能夠降低癲癇大鼠海馬神經(jīng)組織中β-catenin、c-Myc蛋白表達(dá)量，miR-29a作用機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號(hào)有關(guān)。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)增多后可誘導(dǎo)下游靶基因c-Myc的表達(dá)〔17〕。Wnt/β-catenin信號(hào)是經(jīng)典的Wnt信號(hào)，其有多種生物學(xué)作用，與疾病的進(jìn)展有關(guān)〔18〕。Wnt/β-catenin信號(hào)在癲癇中發(fā)揮促進(jìn)作用，過(guò)度激活Wnt/β-catenin可增加癲癇發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)〔19～21〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)激活劑可部分逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-29a對(duì)癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激的作用，提示miR-29a能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)影響癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

綜上，miR-29a在癲癇中發(fā)揮抑制功效，其可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)改善癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，減少細(xì)胞凋亡，這為闡明癲癇分子發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。