尹 林 申峻丞 楊立群

（中山大學化學學院，聚合物復合材料及功能材料教育部重點實驗室，廣東省高性能樹脂基復合材料重點實驗室，廣州 510275）

每一種蛋白質都有自己特殊的空間結構，被稱為三維結構或空間構象。蛋白質作為一種重要的生物大分子，參與進行大多數(shù)生命活動（如酶催化代謝、免疫調節(jié)、細胞信息傳遞、載體運輸以及能量供應等），所以，研究蛋白質的三維結構對揭示其生物功能至關重要。這些理論有助于更深層次認識蛋白質在健康生理活動和疾病產生過程中發(fā)揮的作用和機制，也將促進相關疾病的臨床診治和藥物設計。

盡管X射線衍射法已被廣泛用于解析蛋白質三維結構，然而，該方法仍然存在一些缺陷，例如X射線衍射法只能用于研究蛋白質晶體的靜態(tài)結構，并且一些蛋白質因結構的無序性而難以形成晶體（或形成的晶體存在缺陷而不足以X 射線衍射法研究）。相比之下，核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜法更適合用于研究溶液狀態(tài)下蛋白質的三維結構，能夠更加準確地揭示蛋白質結構與生物功能之間的自然規(guī)律［1］。

2D NMR 技術已廣泛用于解析較小分子質量（≤10 ku）蛋白質的三維結構［2］。雖然3D 和4D NMR 技術逐漸被用于解析分子質量較高的蛋白質的三維結構，但是，NMR 測試技術仍然面臨兩大難題而限制其在蛋白質三維結構研究中的應用：第一，隨著蛋白質的氨基酸數(shù)目和分子質量的增加，造成NMR 共振信號峰嚴重重疊；第二，橫向弛豫速率（R2）的加快，致使NMR 信號峰增寬和分辨率變差。因此，本文主要概述NMR 解析蛋白質三維結構的理論和技術方法，以及NMR 結合其他生物物理手段，并輔以分子建模計算法研究蛋白質三維結構的研究進展和最新方法，為精準解析蛋白質的三維結構提供思路及策略。

1 核磁共振波譜法解析蛋白質三維結構的理論概述

自旋量子數(shù)不為零的原子核（主要為1H、13C、15N、19F 和13P 等），它們在外加靜磁場中自旋運動時存在著不同的能級，相鄰兩能級間的能量差（ΔE）為：

式中，γ為磁旋比，?=h/2π（h為普朗克常數(shù)），H0為靜磁場強度。

在外加靜磁場中，原子核繞其自旋軸旋轉，自旋軸與靜磁場保持某一夾角而圍繞靜磁場方向進動的頻率（ω0）為：

當用頻率為ω0的射頻照射靜磁場中自旋運動的原子核時，原子核才能有效地吸收射頻輻射的能量，從低能級躍遷至高能級，實現(xiàn)核磁共振。所以，核磁共振波譜來源于原子核能級間的躍遷，即用一定射頻的電磁波對樣品進行照射，使特定結構環(huán)境中的原子核發(fā)生共振躍遷，記錄發(fā)生核磁共振時的信號峰位置和強度，得到核磁共振波譜，其共振信號反映了官能團和構象等分子結構信息。通常將1H、13C和15N原子核的磁共振技術應用于蛋白質的結構解析，例如通過NMR 實驗獲得化學位移、弛豫時間、耦合常數(shù)、核奧弗豪澤效應（nuclear Overhauser effect，NOE）等參數(shù)，用于研究蛋白質的三維結構及其分子動力學等［3-7］。

NMR解析蛋白質三維結構的流程圖如圖1a所示。為了避免蛋白質共振信號峰的重疊，提高其分辨率，一般需要制備15N、13C 或2H 標記的蛋白質，采用15N/13C/1H三共振多維核磁技術采集實驗數(shù)據(jù)，對共振信號進行分析、篩選及歸屬，主要相關的NMR 技術包括HNCA、HN（CO）CA、HNCO、HN（CA）CO、 HNCACB、 HN（CO）CACB、HNCACO、HNCOCA、HNCOi-1CAi等［8-20］。根據(jù)NMR 軟 件 結 合NMR 技 術 所 獲 得 的1HN、15N、13CO、13Cα和13Cβ化學位移、耦合常數(shù)和質子間距離，推算蛋白質主鏈中氨基酸的序列及其二面角結構參數(shù)，得出蛋白質的二級結構。通過測定NOE、順 磁 弛 豫 增 強 （paramagnetic relaxation enhancement，PRE）以及殘余偶極耦合（residual dipolar coupling，RDC）等NMR 參數(shù)獲得蛋白質的三維結構約束參數(shù)（包括原子間空間距離、化學鍵空間取向等），進一步結合NMR 計算軟件解析蛋白質的三維結構。

以常用的3D15N/13C/1H 三共振HNCA 和HN（CO）CA NMR為例，蛋白質分子中的氨基酸通過磁化矢量傳遞（圖1b①），HNCA可測定同一個氨基酸內的1HN和15N原子與13Cα原子的關聯(lián)（以第i個氨基酸為例），以及第i個氨基酸的1HN和15N 原子與第i-1 個氨基酸13Cα原子的關聯(lián)；HN（CO）CA通常只提供同一個氨基酸內的1HN和15N 原子與鄰近氨基酸13Cα原子之間的關聯(lián)信息。在蛋白質樣品3D NMR 譜圖中（圖1b②），通過上述關聯(lián)信息解析蛋白質主鏈中氨基酸的序列結構（圖1b③），根據(jù)質子間距離和二面角結構參數(shù)（圖1b④），并采用化學位移預測法解析二級結構。結合結構約束參數(shù)，通過NMR 計算軟件進行計算可獲得蛋白質的三維結構。

Fig.1 Process and schemes of investigating protein three-dimensional structure圖1 解析蛋白質三維結構的流程及示意圖

2 研究蛋白質三維結構的核磁共振波譜法

2.1 蛋白質的同位素標記

蛋白質的同位素標記包括以下過程：構建含有目標蛋白基因序列的質粒，將其導入宿主生物體，在含有同位素標記物的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，通過宿主生物表達得到同位素標記蛋白質，采用生化技術進行分離純化，獲得高純度的同位素標記蛋白質。

2.1.1 標記方法

均勻同位素標記法被廣泛用于蛋白質的同位素標記［21］。它主要以15N 標記的NH4Cl 或（NH4）2SO4作為唯一氮源，13C 標記的葡萄糖、甘油、甲醇或丙酮酸作為唯一的碳源，對蛋白質進行均勻的15N/13C 雙標記。為了提高NMR 譜靈敏度和分辨率，通常在含D2O/H2O的培養(yǎng)基中制備全氘代或部分氘代的15N/13C/2H 三標記蛋白質樣品，進行三共振多維核磁測試。

為了克服大量質子被氘取代而干擾NOE 法解析蛋白質結構的問題，發(fā)展了對4 種甲基氨基酸（Ala、Ⅴal、Leu、Ⅰle）選擇性地甲基質子化法［22］。例如，在含有13C/2H標記葡萄糖、15N標記NH4Cl和D2O 的細菌培養(yǎng)基中，加入3-2H,13C-α-酮異戊酸（α-ketoisovalerate）制備含有13CH3-標記Ⅴal 和Leu殘基的15N/13C/2H蛋白質［23］，加入3,3-2H,13C-α-酮丁酸（α-ketobutyrate）制備含有13CH3-標記Ⅰle 殘基的15N/13C/2H蛋白質［24］。

片段同位素標記法有助于降低NMR 信號峰的重疊程度，用于無序蛋白質（disordered protein）結構的測定、高分子質量蛋白質的結構解析以及蛋白質構象變化的研究等［25-28］。該方法通過對兩個或以上的蛋白質片段進行分別表達，對不同的組分采用不同的同位素標記（15N/13C/2H），再將這些蛋白質片段連接起來，組成具有同位素標記片段的完整目標蛋白，主要有表達蛋白連接法（expressed protein ligation，EPL）、蛋白反式剪接法（protein trans-splicing，PTS）和天然化學連接法（native chemical ligation，NCL）等［29-31］。

2.1.2 表達系統(tǒng)

通常采用的表達系統(tǒng)為原核生物表達系統(tǒng)、真核生物表達系統(tǒng)以及無細胞表達系統(tǒng)。大腸桿菌（E.coli）是原核生物表達系統(tǒng)中代表性的表達宿主，它能在各種同位素標記環(huán)境中表達蛋白質，成本較低。所以，在NMR 研究中大腸桿菌表達系統(tǒng)最為常用，主要以pET 為表達載體，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（ⅠPTG）為誘導劑。目前研究工作主要集中在通過改造該系統(tǒng)中的質粒來提高蛋白質的溶解性及產量［32］。

由于大腸桿菌表達系統(tǒng)對于一些含有特殊結構的蛋白質（如含二硫鍵的蛋白質等）普適性較差，所以發(fā)展起來了真核生物表達系統(tǒng)（包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)）［33］。盡管畢赤酵母（Pichia pastoris）常用于表達15N/13C/2H標記的蛋白質，但是，仍然存在一些缺陷，例如在氘代介質中表達時間較長以及選擇性地甲基質子化效率較低等［34-35］。昆蟲細胞和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)需要使用含同位素標記氨基酸的培養(yǎng)基，導致制備同位素標記蛋白質的成本較為昂貴［36-37］。一些對宿主細胞具有毒性的蛋白質，可采用無細胞表達系統(tǒng)，其特點是具有較高的蛋白質表達效率［38-39］。

2.1.3 純化技術

采用同位素標記法及在各種表達系統(tǒng)中得到的菌體，需要利用生化技術進一步分離提純才能獲得高純度的同位素標記蛋白樣品，主要包括菌體內含蛋白的釋放、總蛋白的富集、層析色譜法分離提純、蛋白質的濃縮以及純度鑒定等過程。其中層析色譜分離是最重要的一步，它直接決定同位素標記蛋白樣品的純度和產率。根據(jù)同位素標記蛋白不同的物理性質（如等電點、溶解度、電荷性質等），可采用多種層析色譜分離技術，例如親和層析色譜法（如Ni-NTA 和Glutathione Sepharose 色譜法）、離子交換色譜法（如DEAE 色譜法）、體積排阻色譜 法（如Superdex、 Sephacryl、 Sepharose 和Sephadex色譜法）。

2.2 核磁共振實驗數(shù)據(jù)的采集及其解析的軟件

2.2.1 核磁共振實驗數(shù)據(jù)采集

近年來針對核磁共振技術采集時間長和信噪比較低等問題，發(fā)展了一些新的NMR 實驗數(shù)據(jù)采集技術，如非均勻采樣（non-uniform sampling）［40］、SOFAST （band-selective optimized-flip-angle shorttransient）［41-42］、 ADAPT-NMR （assignmentdirected data collection algorithm utilizing a probabilistic toolkit in NMR）［43］、 BEST （bandselective excitation short-transient）［44-45］、GFT （Gmatrix Fourier transform）［46］、 投 影 重 建（projection reconstruction）［47］等。這些技術能實現(xiàn)快速采樣，信噪比較高，更有利于研究溶液狀態(tài)下不穩(wěn)定的蛋白質三維結構。

非均勻采樣技術不僅保持了較高的信噪比，而且將實驗數(shù)據(jù)采集時間縮短為原來的1/2～1/6，已得到了廣泛應用［48-49］。它主要是在間接維度（indirect dimension）中對NMR 數(shù)據(jù)進行隨機選擇性采樣，結合特定采樣限制因素（例如在每個間接維度下每個采集時間應至少測量1 次等），將得到的低分辨率數(shù)據(jù)經過重建算法（reconstruction algorithm）處理，在一定程度上得到與均勻采樣技術相當?shù)腘MR數(shù)據(jù)［50］。數(shù)據(jù)重建算法包括多維分解法（multidimensional decomposition）［48］、最大熵重構法（maximum entropy reconstruction）［49］、非等間距數(shù)據(jù)的傅立葉變換算法（Fourier transform algorithms for non-equispaced data）［51］、機器學習法（machine learning）［52］、稀疏多維迭代線形增強法（sparse multidimensional iterative lineshapeenhanced，SMⅠLE）［53］等。

2.2.2 解析核磁共振信號的軟件

由NMR 實驗數(shù)據(jù)得到的譜圖，需要對共振信號進行歸屬，經過結構計算和評估才能獲得較為準確的蛋白質三維結構。然而，對于一些分子質量較高的蛋白質，由于其信號峰的數(shù)量顯著增多，導致NMR 譜圖解析較為困難。目前已出現(xiàn)了多種化學位移自動歸屬軟件，用于分析蛋白質主鏈和側鏈的結 構 以 及NOESY 信 號，包 括CYANAY［54-56］、PⅠNE-SPARKY.2［57］、APSY［58-60］、PONDEROSA［61］、NMRNet［62］、ADAPT-NMR［43］等?；瘜W位移自動歸屬的在線服務器主要為Ⅰ-PⅠNE web server（http://i-pine.nmrfam.wisc.edu/）［63］。Pritisanac 等［64］改進了CYANAY中的FLYA算法，能自動歸屬超大分子質量蛋白質甲基的NOSEY 信號。為了獲得蛋白質的三維結構，需要根據(jù)1H、13C、15N 化學位移及NOE 等結構約束參數(shù)、采用計算軟件計算蛋白質的二級結構和三維結構（表1）。

Table 1 Calculation software of protein secondary structure unit and three-dimensional structure表1 蛋白質二級結構單元和三維結構的計算軟件

2.3 核磁共振波譜法解析蛋白質的氨基酸序列和二級結構單元

獲得15N、13C或2H同位素標記的高純度蛋白質樣品后，在解析三維結構之前需要進行NMR 實驗的可行性論證，包括選取適合的緩沖溶液體系和測試溫度以保證在測試過程中蛋白質結構和性質的穩(wěn)定性，通過考察NMR 線寬的濃度依賴性來判斷蛋白質是否發(fā)生聚集等。如果NMR 譜線太寬（或NMR 峰重疊嚴重），則需要改變實驗條件進行改善。在蛋白質1H NMR譜圖中，甲基及脂肪族氨基酸側鏈質子信號主要分布在0～4 ppm，主鏈及側鏈的酰胺質子主要分布在7～10 ppm，芳香環(huán)上的質子信號主要分布在6～8 ppm。

2.3.1 氨基酸殘基自旋系統(tǒng)的辨識及蛋白質的氨基酸序列解析

常見的20 種氨基酸殘基中有15 種殘基即為一個自旋系統(tǒng)，其余5種氨基酸殘基則含有多個自旋系統(tǒng)。根據(jù)蛋白質分子質量的大小，通常采用以下兩種方法進行氨基酸殘基自旋系統(tǒng)的辨識以及氨基酸序列結構的解析。

分子質量低于14 ku 的蛋白質一般不需要進行同位素標記，其氨基酸自旋系統(tǒng)可用2D1H NMR技 術（如COSY、 DQF-COSY、 RCT-COSY 和TOCSY）進行識別，這些技術與NOESY聯(lián)用可識別氨基酸的序列結構。其中COSY類技術提供同一氨基酸的酰胺質子與Hα質子（NHi-αHi）的關聯(lián)信息，NOESY 提供氨基酸內酰胺質子與鄰近氨基酸Hα質子（NHi+1-αHi）的關聯(lián)信息。由于NOESY 和COSY譜圖都具有對角對稱性，因此，將這兩種譜圖的各一半沿著對角線疊合組成一張NOESYCOSY 譜［70］，在COSY 譜中從NHi-αHi信號峰的氨基酸殘基自旋系統(tǒng)出發(fā)，分別作水平線和垂直線，得到NHi和αHi化學位移，以αHi原子的化學位移作為起點做水平線，從NOESY譜中找到NHi+1的氨基酸殘基自旋系統(tǒng)，得出各氨基酸殘基自旋系統(tǒng)的順序。

對于較高分子質量的蛋白質，因為自旋系統(tǒng)信號峰數(shù)目增加而容易產生信號峰的重疊，所以，需要制備15N/13C 或15N/13C/2H 標記的蛋白質樣品，采用15N/13C/1H異核多維NMR進行氨基酸自旋系統(tǒng)的識別，進一步解析氨基酸的序列。自Bax 等［8］將15N/13C/1H 三共振實驗應用于解析鈣調蛋白（16.7 ku）的結構以來，出現(xiàn)了更多的三共振脈沖技術：a.分子質量約為10～30 ku的單鏈蛋白質，常用的三共振實驗技術主要有HNCA、HN(CO)CA、HNCO、HN(CA)CO、CBCA(CO)NH、CBCANH、HNCACB 和HN(CO)CACB 等；b. 分 子 質 量 高 于30 ku的蛋白質，則需在上述基礎上聯(lián)用TROSY以及4D、5D和6D NMR［71-75］。

在實際應用中，可將15N/13C/1H 三共振實驗按照關聯(lián)類型以兩個為一組的形式分成4 組三共振NMR 譜圖：a. HNCA（殘基內譜圖）和HN(CO)CA（殘基間譜圖）；b. HNCO（殘基間譜圖）和HN(CA)CO（殘基內譜圖）；c.CBCANH（殘基內譜圖） 和CBCA(CO)NH （殘基間譜圖）；d.HNCACB（殘基內譜圖）和HN(CO)CACB（殘基間譜圖）。

2.3.2 蛋白質的二級結構單元解析

通過以下NMR 技術可測定蛋白質的二級結構單元（α螺旋、β轉角、β折疊和無規(guī)線團）以及結構特征參數(shù)（質子間距離、二面角和氫鍵相互作用）：a.NOESY用于識別具有質子間距離≤5 ?結構特征的二級結構單元；b. DQF-COSY 用于測定Cα-N-H三鍵的耦合常數(shù)（3JHNαH），進一步確定二級結構單元的二面角。例如，右手α 螺旋3JHNαH=3.9 Hz （?=-57°），310螺 旋3JHNαH= 4.2 Hz （?=-60°），反平行β 折疊3JHNαH= 8.9 Hz（?=-139°），平行β折疊3JHNαH=9.7 Hz（?=-119°）［76］；c.具有慢交換速率的質子易形成氫鍵，通過NOESY測定蛋白質樣品在H2O和D2O中的質子交換速率來研究氫鍵相互作用［77］。

基于氨基酸15N、13C和1H化學位移數(shù)據(jù)庫的化學位移二級結構預測法也常用于解析蛋白質的二級結構單元。然而，由于蛋白質的化學位移容易受到原子核局部磁環(huán)境影響，導致其化學位移包含多種信息（二級結構單元、側鏈構象、氫鍵、動力學、溶劑化作用等）［78］。為了更加準確地獲得蛋白質二級結構的單一信息，建立了化學位移標志識別法（chemical shift index，CSⅠ），即根據(jù)其數(shù)據(jù)庫建立各種氨基酸自旋系統(tǒng)中15N、13C和1H的化學位移標志參考值，用于解析蛋白質的二級結構單元［79-80］。相關軟件主要有NMRPipe［81］，在線分析服務器主要為TALOS+ Web Server （https://spin.niddk.nih.gov/bax/nmrserver/talos/） 和CSⅠ 2.0 Web Server（http://csi.wishartlab.com/）［65，82］。

2.4 蛋白質的三維結構解析

2.4.1 核磁共振波譜法解析蛋白質三維結構

在蛋白質氨基酸序列和二級結構單元的解析基礎上，通過NMR 實驗進一步測定結構約束參數(shù)（包括原子間空間距離、化學鍵空間取向等），結構計算軟件計算蛋白質三維結構并評估其可靠性和準確性。NOE 和PRE 實驗可獲得原子空間距離約束參數(shù)，化學鍵空間取向則通過RDC 實驗來獲?。▓D2）。

a.NOE

NOE 信號強度與兩個偶極相互作用的質子之間距離（rH-H，1.8～5 ?）的六次方成反比［83］。在蛋白質三維結構研究中，主要根據(jù)NOESY 譜圖的NOE 信號強度獲得短程距離的質子間距離約束參數(shù)（圖2a）。蛋白質三維結構解析的準確性依賴于NOE 信號的獲取數(shù)量和正確歸屬。然而，伴隨著蛋白質分子質量的增加，NOESY 譜易出現(xiàn)信號峰簡并和重疊嚴重的問題。近期出現(xiàn)的異核多維NOESY技術，即根據(jù)與1H鍵合的異核（13C或15N）化學位移來分辨NOE 交叉信號峰，能夠通過增加維度的方式來減小信號峰簡并和重疊的問題。對于分子質量較小的蛋白質（＜30 ku），常用2D1H-1H NOESY、3D15N/13C-edited-NOESY、3D13C(15N)/1H-NOESY-HSQC［84-86］。對于分子質量較大的蛋白質，則采用3D15N-1H-15N HSQC-NOESY-HSQC、3D13C-1H-13C HMQC-NOESY-HMQC、 3D15N-1H TROSY-NOESY、 4D15N/15N HSQC-NOESYHSQC、 4D13C/15N HMQC-NOESY-HSQC 和4D13C/13C HMQC-NOESY-HSQC［87-90］。在全氘代蛋白質的結構研究中，由于未能獲得質子的NOE信號，所以，通常將全氘代蛋白質進行選擇性質子化，例如酰胺基團和甲基的質子化［91-92］。

Fig.2 NMR experimental methods for acquiring protein structural constraint parameters圖2 測定蛋白質結構約束參數(shù)的NMR實驗方法

b.PRE

PRE技術用于測定蛋白質結構中長程空間距離的結構約束參數(shù)，原理如圖2b 所示。未成對單電子的順磁性對其周圍的NMR 自旋原子核產生順磁效應，進一步產生原子間的偶極-偶極相互作用，加快一定空間范圍內（10～35 ?）的原子核弛豫速率（即PRE 速率，RPara 2）［93］。RPara 2 與原子核到順磁中心距離（rH-P）的六次方成反比（公式（3）），主要通過1H,15N-TROSY 或1H,15N-HSQC 等技術進行測定［94］。

式中，rH-P指1H 原子與未配對單電子（順磁中心）P 之間的距離（?），ge是電子的g因子，μB是玻爾磁子，S是總電子自旋量子數(shù)，μ0是真空磁導率，ωH是1H原子的拉摩爾頻率（Hz），τc是分子相關時間（ns），其中τr是蛋白質分子的運動相關時間，τs是電子弛豫時間。

通常采用以下兩種方法制備順磁性的蛋白質測試體系：a.化學修飾法，常用的方法為半胱氨酸巰基衍生化法，即將蛋白質分子鏈中半胱氨酸的巰基與順磁性氮氧化物自由基標簽通過化學鍵合，得到含有順磁性標簽的衍生化蛋白質，順磁性氮氧化物自由基標簽主要有1-氧自由基-2,2,5,5-四甲基-D-吡咯啉-3-甲基-甲硫基磺酸鹽（MTSL）、2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（TEMPO）等［95-96］，順磁性離子螯合劑（乙二胺四乙酸（EDTA）、二乙基三胺五乙酸（DTPA）、1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四羧酸（DOTA）等［96-98］，其中MTSL標簽最為常用；b.融合蛋白表達法，即在蛋白質分子中通過基因表達引入可螯合順磁性金屬離子的肽鏈［99］。然而，這些方法均在蛋白質分子鏈中引入了順磁性物質，需要考慮它們對蛋白質自身結構的影響。

c.RDC

在較高分子質量蛋白質的結構解析中，常常存在結構約束數(shù)據(jù)獲取較少或較難獲得的問題，導致缺乏足夠的約束信息用于精確計算蛋白質的三維結構，因而，需要采用RDC 技術獲取蛋白質分子中化學鍵空間取向的約束參數(shù)，得到蛋白質中不同結構域之間相對取向的約束信息［100］。RDC是指原子核偶極矩間的偶極-偶極相互作用產生偶極-偶極馳豫效應，導致NMR 信號裂分（偶極耦合裂分）的現(xiàn)象。如圖2c 所示，對于蛋白質分子中存在偶極耦合相互作用的原子核P和Q，它們受到順磁性介質的取向作用前的耦合常數(shù)為J，受到順磁性介質作用產生取向后的耦合常數(shù)則為J和殘余偶極耦合常數(shù)（D）之和。D與原子核P 和Q 之間的鍵矢量（θ）以及排列張量坐標軸取向（φ）的關系列于公式（4）［101］，根據(jù)計算軟件進一步計算蛋白質二級結構域的空間取向信息。

式中，D是殘余偶極耦合常數(shù)（Hz），B0是磁感應強度（T），kB是玻爾茲曼常數(shù)，T是測試溫度（K），h是普朗克常數(shù)，rP-Q為存在偶極耦合相互作用的原子核P和Q之間的距離（?），γP和γQ分別是發(fā)生偶極耦合相互作用原子核P 和Q 的旋磁比，Δχax和Δχrh分別是磁感應張量的軸向分量和正交分量；θ和φ分別是鍵矢量和排列張量坐標軸的取向。蛋白質分子在溶液中處于各向同性的快速翻滾運動狀態(tài)，這種各向同性運動帶來的平均效應使得其偶極耦合裂分的凈值為零［102］。所以，需要采取一些方法限制蛋白質的快速翻滾運動，促使蛋白質產生一定的各向異性，使得偶極耦合裂分的凈值不為零。目前文獻報道大致有以下兩種方法：a.一些天然蛋白質含有各向異性磁化率的順磁性金屬離子（如Fe3+等），其固有磁化率可以使蛋白質產生弱取向，進而產生RDC信號［103］；b.利用外部取向介質誘導蛋白質分子在溶液中定向排列，出現(xiàn)的各向異性可產生10 倍以上的RDC 信號［104］。常用的取向介質包括順磁性金屬（如Fe3+和鑭系金屬）、烷基-聚乙二醇分子液晶、DNA 納米管液晶、取向聚丙烯酰胺凝膠以及取向膠原蛋白凝膠等［105-110］。如果在蛋白質測試體系中加入兩種以上定取向介質，促使蛋白質分子沿不同方向定向排列，則可獲得多個D值，計算出更加準確的蛋白質三維結構［111］。需要注意的是，由于外部取向介質法的誘導機制歸功于蛋白質與介質的空間和電荷相互作用，因此，必須考慮取向介質對蛋白質自身的結構影響［112］。

2.4.2 其他生物物理技術輔助解析蛋白質三維結構

近期研究表明，一些生物物理技術有助于NMR解析蛋白質的三維結構［113］，例如熒光共振能量 轉 移 法（F?rster/fluorescence resonance energy transfer， FRET）、 化 學 交 聯(lián) 結 合 質 譜 技 術（chemical cross-linking coupled with mass spectrometry，CXMS）、小角X 射線散射技術法（small angel X-ray scattering，SAXS）和冷凍電鏡法（Cryo-electron microscopy，Cryo-EM）。

a.FRET

與PRE 技術獲得距離約束參數(shù)的原理類似，F(xiàn)RET法也是基于偶極-偶極相互作用原理，即如果蛋白質分子內或分子間的兩個熒光生色團相距一定距離（約20～80 ?），并且熒光供體基團的熒光發(fā)射波長與熒光受體基團的吸收波長有一定的重疊，那么，熒光供體基團將把能量轉移給熒光受體基團，使受體基團被激發(fā)，產生紅移的次級熒光［113-114］。上述兩個波長重疊的程度越大，F(xiàn)RET能量轉移的效率越高。因此，根據(jù)FRET能量轉移效率，可計算它們之間的距離（公式（5））［113］。

式中，RDA為供體和受體熒光基團之間的距離（?），E為FRET 能量轉移效率，R0為F?rster 距離（即某一給定供體-受體對的臨界轉移距離）。常用的熒光供體單體有丹磺酰氯、AlexaFluor類熒光分子、Tb3+熒光離子和四甲基羅丹明（TMR），熒光受體單體為異硫氰酸熒光素（FⅠTC）、Cy3 和Cy5熒光分子，丹磺酰-FⅠTC、AlexaFluor488-Cy5 和Tb3+-Cy3 在FRET 能量轉移效率達到50%時，R0分別為38、52和62 ?［113］。

在解析蛋白質三維結構方面，單分子FRET（single-molecule FRET，smFRET）根據(jù)得到的距離約束參數(shù)并結合分子動力學模擬計算法，可用于研究運動時間尺度在毫秒范圍的蛋白質構象動態(tài)變化［113-114］。例如，Ha等［115］將熒光供體（TMR）和和熒光受體（Cy5）分別修飾到葡萄球菌核酸酶（staphylococcal nuclease，SNase） 的兩個特定位點，通過smFRET 測定單個SNase 分子中TMR 和Cy5基團的FRET能量轉移效率和它們之間的距離，發(fā)現(xiàn)SNase 分子之間存在蛋白骨架結構或側鏈在毫秒級時間范圍內的波動。膜蛋白具有豐富的生命功能，與許多疾病有關，已成為主要的藥物靶點，近期研究報道了采用smFRET研究膜蛋白折疊結構動力學，例如研究自插入螺旋膜蛋白和細菌毒素的組裝和折疊動力學以及突變引起的膜蛋白錯誤折疊等，這些工作將有利于更加了解膜蛋白的折疊結構及機制，以便設計更加高效的藥物［116］。

b.CXMS

CXMS 法是一種獲得松散距離約束（sparse distance restraints）的技術。該方法采用特定長度的化學交聯(lián)劑（長度約10～30 ?），將單個蛋白質或不同蛋白質之間的官能團通過共價鍵連接起來，再對交聯(lián)蛋白質樣品進行酶切，采用質譜法分析小分子產物的化學結構，利用專業(yè)的交聯(lián)數(shù)據(jù)處理軟件得出交聯(lián)位點的氨基酸殘基及其距離約束參數(shù)，結合NMR 解析蛋白質的三維結構［113，117］。CXMS技術測試的蛋白質樣品不受分子質量的限制，所以，對于NMR 難以解析的高分子質量蛋白質的三維結構，CXMS 技術顯示出明顯的優(yōu)勢。Gong等［117］最近報道一種改進的CXMS技術可將距離約束參數(shù)的測量值降至約6 ?或更小，能夠更精確地解析蛋白質的結構和動力學。Peng 等［118］采用雙（磺基琥珀酰亞胺）硫酸鹽作為交聯(lián)劑與蛋白質二硫鍵異構酶（protein disulfide-isomerase，PDⅠ）的伯氨或仲氨反應產生穩(wěn)定的酰胺或亞酰胺鍵，經過胰蛋白酶水解以及質譜分析，采用Crosswork 軟件解析得到PDⅠ的二聚體結構。

c.SAXS

SAXS 法通過X 射線散射實驗（X 射線波長為0.05～0.5 nm、散射角為0.1～5°）獲得蛋白質溶液散射強度與角度之間關系［119］，計算出蛋白質的剛性尺寸、分子質量、聚集體狀態(tài)、整體形狀等信息［120-121］。SAXS 能提供蛋白質的全局距離約束條件［122-123］，作為NMR 的補充約束數(shù)據(jù)，所以，SAXS 與NMR 相結合可提高蛋白質三維結構解析的準確性［124-125］，常使用的軟件主要有XPLORNⅠH 和CNS 等［122-124，126］。Grishaev 等［127］將蘋果酸合 酶G （malate synthase G，81.4 ku） 的RDC、NOE 和J耦合常數(shù)等NMR 約束參數(shù)與SAXS 測定的全局距離信息結合，分析得出更加精準的三維結構。Schiavina 等［128］通過NMR 實驗得到了尼帕病毒 磷 蛋 白 N 末 端 結 構 域 （Nipah virus phosphoprotein N-terminal region，NiⅤ-PNT，406個氨基酸） 的初始結構，將集合優(yōu)化方法（ensemble optimization method，EOM）與SAXS 散射數(shù)據(jù)進行匹配分析，優(yōu)化出高分辨率的NiⅤ-PNT三維結構。

d.Cryo-EM

Cryo-EM法通過對蛋白質低溫冷凍成玻璃態(tài)的樣品進行電鏡成像，經過傅里葉變化及重建算法構建出初始蛋白質三維電子密度圖（Cryo-map），得出高分辨的蛋白質三維結構圖［129-130］。與SAXS 相類似，Cryo-EM主要提供全局距離約束條件，但分辨率更高。Cryo-EM技術不受蛋白質分子質量的限制，與NMR 聯(lián)合使用可得到高分辨率的蛋白質三維結構［131-134］。Gauto 等［135］將Cryo-EM 與NMR 聯(lián)用，解析得到較高準確度和精確性（1 ?以下）的十二聚集體TET2 氨肽酶（468 ku）的三維結構。Bardiaux等［136］通過NOE和RDC等NMR結構約束技術計算得到纖維狀菌毛（Pilus）分子的PpdD 亞基結構，結合Cryo-EM 電子密度圖（分辨率為8 ?）構建出纖維狀菌毛的三維結構。

2.5 蛋白質分子激發(fā)態(tài)結構的解析

蛋白質在生命活動中總是處于一種不斷運動的狀態(tài)，通過構象變化執(zhí)行著各種生物功能［137-138］，包括主鏈運動、側鏈芳環(huán)翻轉、結構域相對運動、寡聚體結構域交換等，覆蓋了時間尺度從皮秒到秒的變化［4，104］。這種構象交換過程中，不同構象狀態(tài)之間具有不同的含量和壽命，各狀態(tài)的含量取決于它們的相對自由能，而壽命則很大程度上取決于不同狀態(tài)之間轉化的自由能壘大?。?39］。其中，含量較大的稱為主要狀態(tài)或基態(tài)（major state or ground state），而含量較低（約5%）的瞬時狀態(tài)被稱為次要狀態(tài)或激發(fā)態(tài)（minor state or excited state），由于其含量較低且壽命較短，只能憑借它與基態(tài)之間的化學交換才能被檢測，所以也被稱為不可見狀態(tài)（invisible state）［140-141］?；鶓B(tài)與激發(fā)態(tài)結構之間的構象交換過程可發(fā)生在較寬的時間尺度下（圖3）［104，142］，主要NMR 技術包括PRE、弛豫擴 散［143］、CPMG RD （cPMG 弛 豫 擴 散，Carr-Purcell-Meiboom-Gill relaxation dispersion）、CEST（化學交換飽和轉移，chemical exchange saturation transfer）、DEST（暗態(tài)交換飽和轉移，dark state excitation saturation transfer）［144］、H/D 交換［145］和ZZ 交換［146］等。其中與蛋白質功能聯(lián)系最為密切的構象交換時間尺度是微秒至毫秒，例如配體的結合與釋放、蛋白質折疊、變構效應和酶催化等［104，147］。近 些 年 來 發(fā) 展 起 來 的CPMG RD 和CEST能更好地研究尺度為微秒至毫秒的蛋白質激發(fā)態(tài)結構（圖3a，b）。

2.5.1 CPMG RD

Fig.3 Timescales of protein motion and main NMR techniques in the study of excited state structure ［1，4，113］圖3 蛋白質的運動時間尺度以及激發(fā)態(tài)結構研究中的主要NMR技術［1，4，113］

CPMG RD 基于自旋回波（spin-echo）原理，以不同CPMG頻率施加π脈沖，根據(jù)發(fā)生的化學交換測定不同氨基酸殘基的弛豫速率和化學位移，分析0.3～10 ms 時間尺度下的蛋白質激發(fā)態(tài)結構（含量 大 于0.5%）［147-149］。例 如 采 用1H-15N HSQC、Methyl-HSQC 或TROSY 等測試技術，CPMG RD可測定出蛋白質主鏈1HN、15N、13Cα和13CO 以及側鏈13Cβ和甲基的橫向弛豫速率（R2）隨CPMG 頻率（νCPMG）變化的關系曲線（圖3a）。交換速率Rex（R2max與R2min之差）不僅能夠提供各氨基酸殘基發(fā)生化學交換的情況及它們在激發(fā)態(tài)的相對含量，而且可以獲得激發(fā)態(tài)氨基酸殘基中不同類型原子核的化學位移，用于計算較高準確性的激發(fā)態(tài)蛋白質三維結構［104，139，148-152］。

Bouvignies 等［153］采用CPMG RD 技術分別獲得了溶酶體激發(fā)態(tài)結構中主鏈1H、13C和15N以及側鏈甲基的化學位移，結合CS-Rosetta分子模型構建技術獲得了原子分辨率下溶菌酶突變體的激發(fā)態(tài)結構，闡明了不同突變體位點對基態(tài)與激發(fā)態(tài)溶菌酶結構的影響。Neudecker 等［154］通過CPMG RD 技術測定了Fyn SH3 結構域在激發(fā)態(tài)的1HN、15N、13CO、13Cα和1Hα化 學 位 移 值，根 據(jù)RDC 獲 得的1HN-15N 化學鍵取向信息等結構約束參數(shù)，結合Xplor-NⅠH 等軟件進行計算，發(fā)現(xiàn)激發(fā)態(tài)Fyn SH3結構域的C端為無序狀態(tài)，暴露出易聚集的末端β折疊鏈，這可能是導致淀粉樣原纖維形成的原因，以至于誘發(fā)神經退行性疾病。

2.5.2 CEST

CEST用于研究構象交換發(fā)生在時間尺度為2～100 ms、壽命為5～50 ms 的蛋白質激發(fā)態(tài)結構［104，145］。為了檢測蛋白質在激發(fā)態(tài)的構象，CEST將低豐度的激發(fā)態(tài)構象信息通過化學交換飽和轉移的方式傳遞給高豐度的基態(tài)構象并加以放大。如圖3b 所示，如果蛋白質存在激發(fā)態(tài)和基態(tài)兩個相互交換的構象狀態(tài)，那么，在CEST分析結果中將出現(xiàn)一對向下的信號峰（綠色曲線），較大的信號峰對應于基態(tài)，較小的信號峰則對應于激發(fā)態(tài)［1］。應用ChemEx 軟件包（https://github.com/gbouvignies/chemex）對信號峰強度進行擬合計算，可以獲得化學交換速率常數(shù)、激發(fā)態(tài)相對含量以及激發(fā)態(tài)與基態(tài)化學位移的差值等信息［155-156］。通過1H-15N HSQC或TROSY實驗，CEST可檢測到的激發(fā)態(tài)蛋白質主鏈1H、15N和13C以及側鏈甲基的化學位移信息［157-161］。

CEST 與CPMG RD 不同之處主要在于：a.CEST 更適合研究構象交換時間較慢的蛋白質激發(fā)態(tài)結構；b.CEST中基態(tài)與激發(fā)態(tài)的化學位移差異更顯著且更準確［155，162］。將CEST 與RDC、PRE以及分子對接技術等相結合，可獲得原子分辨率下的 激 發(fā) 態(tài) 三 維 結 構［162］。例 如Sekhar 等［163］將CEST 與CPMG RD、分子對接技術相結合，研究發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶的雙聚體界面和靜電環(huán)區(qū)域是導致其聚集的關鍵區(qū)域，有望成為治療肌萎縮性脊髓側索硬化（amyotrophic lateral sclerosis）的藥物靶點。

3 核磁共振波譜法解析高分子質量單鏈蛋白及超大蛋白質復合體的三維結構

3.1 高分子質量單鏈蛋白的三維結構解析

當分子質量高于10 ku 時，蛋白質在溶液中的運動速度隨著分子質量升高而減緩，導致其NMR峰的譜線加寬且共振信號簡并和重疊，增加了三維結構解析的難度。對于分子質量約為30～80 ku 的單鏈蛋白質，常采用TROSY 聯(lián)用的3D（或4D）三共振技術研究蛋白質的三維結構［164］。例如Tugarinov 等報道［91］，TROSY 聯(lián)用4D-HNCACO、HNCOCA 和HNCOi-1CAi三 共 振NMR， 以 及TROSY 聯(lián)用3D-HNCO、HN（CA）CO、HNCACB和HN（CO）CACB 三共振NMR，結合3D-HN（CO）CACB 和3D-HNCACB、2D-15N-1H-TROSY-HSQC和4D-15N,15N-NOESY，可以指認蘋果酸合酶G 95%以上的共振信號（主鏈1HN、15N、13Cα、13CO和側鏈13Cβ），得出了主鏈的氨基酸序列結構。Bertelsen 等［165］報道采用類似的NMR 技術，解析了DnaK 蛋白（bacterial heat-shock protein 70，70 ku）主鏈的氨基酸序列結構，結合RDC 研究了DnaK蛋白各結構域之間的相對運動和結構取向。

3.2 超大蛋白質復合體的三維結構解析

生命體中存在以聚集體方式形成的超大蛋白質復合體，它們發(fā)揮著重要的生物功能，所以，NMR 研究超大蛋白質復合體的三維結構對解釋其生物功能具有重要意義。然而，超大蛋白質復合體過高的分子質量導致嚴重的NMR 信號重疊和簡并。為了突破分子質量的限制，目前在NMR 技術和同位素標記方面已有突破性的進展。在NMR 技術 方 面，最 為 突 出 的 是Fiaux 等［166］將1H-15N CRⅠPT-TROSY 應用于研究超大蛋白質復合體（900 ku），通過比較十四聚體細菌分子伴侶GroEL（bacterial chaperonin 60，800 ku）與七聚體輔分子伴侶GroES（bacterial cochaperonin 60，72 ku）復合前后NMR 譜圖的差異，分析了復合體的結構及其形成機理。

含有甲基和芳香基團的氨基酸殘基占蛋白質氨基酸殘基總數(shù)的45%～55%，通常位于蛋白質分子的疏水結構域及與配體相互作用的界面中［167］。這使得選擇性甲基質子化標記法被成功應用到超大動態(tài)蛋白質復合體的結構研究中。該方法首先對蛋白質進行全氘代標記，然后選擇性地對脂肪族氨基酸殘基（Ala、Ⅰle、Leu、Met、Thr 和Ⅴal）的側鏈甲基進行質子化。為了獲得更多的分子間NOE 距離約束參數(shù)用于解析超大蛋白質復合體的三維結構，也會對芳香族氨基酸殘基（Phe、Tyr 和Trp）進行選擇性質子化。

氨基酸殘基側鏈甲基的動力學信息可提供毫秒尺度下的蛋白質構象變化信息，有助于更全面地認識蛋白質結構與功能的關系［168］。Huang 等［169］對SecB 分子伴侶（70 ku）的脂肪族氨基酸殘基的甲基以及芳香族氨基酸殘基進行了選擇性質子化標記，以麥芽糖結合蛋白（MBP，396個氨基酸）和堿性磷酸酶（PhoA，471 個氨基酸）為SecB 分子伴侶的結合底物，通過三共振NMR 和3D13C/15Nedited NOESY 對上述質子化標記基團的共振信號進行歸屬，分析了SecB/MBP 與SecB/PhoA 復合物中分子間NOE信號等參數(shù)，發(fā)現(xiàn)在SecB分子伴侶長而連續(xù)的疏水空腔中存在5 個與PhoA 結合的位點和7 個與MBP 結合的位點，揭示了SecB 分子伴侶識別MBP和PhoA底物的機理及其抗折疊的生物活性功能。

Saio 等［170］對 全 氘 代 的 觸 發(fā) 因 子（trigger factor，TF）進行甲基選擇性標記及芳香族殘基選擇性質子化，經過NMR 實驗獲得了豐富的化學位移數(shù)據(jù)和分子間NOE 距離信息，解析出TF/PhoA復合物（200 ku）的三維結構。這些選擇性質子化標記法還可用于解析其他超大蛋白質復合體的三維結構，例如DnaJ/PhoA 復合物（111.5 ku）［85］、20S蛋白酶體核心顆粒（20S CP，1 000 ku）［171］和SecA分子伴侶（204 ku）［172］等。

4 核磁共振波譜法結合分子建模計算法研究蛋白質的三維結構

4.1 蛋白質初始結構模型的構建

4.1.1 基于數(shù)據(jù)庫模板的建模法

基于數(shù)據(jù)庫模板的建模法通過對比目標蛋白質和數(shù)據(jù)庫中已知結構蛋白質的氨基酸序列或二級結構（稱為模板），經過計算模擬得到目標蛋白初始三維結構。檢索氨基酸序列的方法主要有HHBlits和LOMETS 等［173-174］，計算模擬法包括Ⅰ-TASSER和SWⅠSS-MODEL 等［175-176］。該建模法主要有同源建模法和折疊識別法。同源建模法將目標蛋白質與模板的氨基酸序列進行比對，篩選出與目標蛋白質在進化上同源的模板，獲得最優(yōu)化模板的三維結構氨基酸的坐標或從模板結構中收集結構約束參數(shù)，結合計算模擬法構建目標蛋白質的初始結構模型，分為模板識別、模板選擇、模型構建和模型質量評估4個步驟。但是，由于來自不同進化起源的蛋白質可能具有相似的結構，在同源建模法應用中可能會產生錯誤的結構信息。針對該問題可采用折疊識別法，即利用穿線法（threading）來識別數(shù)據(jù)庫中與目標蛋白質具有相似氨基酸結構或序列的模板，根據(jù)它們的相似程度進行排序，優(yōu)化出目標蛋白質的初始結構模型［175］。

4.1.2 基于無數(shù)據(jù)庫模板的建模法

當在數(shù)據(jù)庫中找不到與目標蛋白質結構匹配的模板時，一般采用從頭建模法來構建目標蛋白質的初始結構模型，即基于無數(shù)據(jù)庫模板的建模法。該方法將目標蛋白質切割為小片段序列，通過在數(shù)據(jù)庫中搜索相似結構的片段獲取目標蛋白質片段的結構參數(shù)信息，修訂至目標蛋白質的序列結構中，采用計算模擬的方法組合這些片段結構，得到目標蛋白質的初始結構模型，代表性的計算法有Rosetta（CS-Rosetta）［177］。然而，隨著蛋白質分子質量或氨基酸數(shù)目的增加，需要檢索的構象相空間（phase space）數(shù)量也急劇增加，這使得較大蛋白質的從頭計算建模變得極其困難。近些年來隨著從頭建模法不斷的優(yōu)化和發(fā)展，分子質量的限制影響開始變得越來越小，由以前只能建立小于150個氨基酸的蛋白質初始結構模型［178］。到現(xiàn)在最高可構建含有770個氨基酸的蛋白質初始結構模型［179］。

4.2 蛋白質結構優(yōu)化

將建模法建立的蛋白質初始結構與實驗獲得的結構約束參數(shù)相結合，經過分子動力學模擬和能量

最小化處理，可得到目標蛋白質的三維結構。結構約束參數(shù)主要來源于NMR 和小角X 射線散射實驗，包括NOESY 測定的質子間距、PRE 獲得的長程距離、RDC 獲得的空間取向、骨架自旋系統(tǒng)的化學位移提供二面角以及酰胺氫/氘交換速率提供相互作用界面等信息［3，126，180-183］。這些結構約束參數(shù)還可作為初步優(yōu)化的目標蛋白質的結構評估指標，經過多次迭代優(yōu)化，直至得到一個（或一組）與結構約束參數(shù)相一致的目標蛋白質的三維結構［184］。

5 結論與展望

蛋白質的三維結構與其生物功能密切相關，研究蛋白質的三維結構有助于揭示其生物功能機制。NMR 是一種重要的解析蛋白質三維結構的方法，通常采用蛋白質同位素（15N/13C/2H）標記法，以獲得出現(xiàn)較高強度核磁信號峰的高分辨率NMR 譜圖。將15N/13C/1H三共振技術與NMR計算軟件相結合可推算蛋白質主鏈中氨基酸的序列及其二面角結構參數(shù)，得出蛋白質的二級結構。NOE、PRE 及RDC 技術可獲得蛋白質的三維結構約束參數(shù)（原子間空間距離和化學鍵空間取向），經過NMR 軟件進行結構計算以及結構評估，解析得出蛋白質的三維結構。NMR 與其他生物物理手段（如FRET、CXMS、SAXS 和Cryo-EM）相結合，有助于獲得更加精準的蛋白質三維結構。NMR 與分子建模計算法相結合，能更加快速、低成本地解析蛋白質的三維結構。將NMR 用于研究蛋白質分子激發(fā)態(tài)結構以及對超大蛋白質復合體三維結構的解析，對于闡明蛋白質在生命活動中發(fā)揮的生物功能有著重要的研究價值和意義。

盡管目前已發(fā)展了多種NMR 技術解析蛋白質的三維結構，但是，在更加精準解析蛋白質三維結構方面仍然存在需要進一步研究的問題。例如，NMR 在研究高分子質量蛋白質及多聚體蛋白質的三維結構仍然存在核磁信號峰重疊嚴重、譜線較寬、分辨率較低等問題。這些問題的研究將能更加提升NMR 在解析蛋白質三維結構的應用價值，揭示更多蛋白質的生物功能機制。