王琪銘， 史艷梅*， 魏 森， 吳明俠， 苗明三， 李秀敏

(1.河南中醫(yī)藥大學，河南鄭州 450001；2.紐約醫(yī)學院，美國紐約 10595)

黃芩苷(Baicalin)是從雙子葉唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根中分離出來的一種黃酮類化合物，具有抗菌[1]、抗病毒[2]、抗腫瘤[3]、保護肝臟[4]和修復腦損傷[5]等藥理作用，在臨床上應用極為廣泛?；谄淞己玫乃幮ё饔?，在眾多含黃芩的中藥制劑中常被作為質(zhì)量控制的重要指標。因此，建立快速靈敏的黃芩苷測定方法具有重要意義?，F(xiàn)已有的黃芩苷測定方法主要有高效液相色譜法[6]、液-質(zhì)聯(lián)用法[7]、毛細管電泳法[8]和電化學法[9]等。其中，電化學法因其靈敏度高，儀器設備簡單，易于自動化等優(yōu)勢，在藥物活性成分檢測中扮演重要角色[10 - 13]。

還原氧化石墨烯(rGO)是一種被廣泛應用于電化學領域的二維蜂窩狀納米材料，具有比表面積大的優(yōu)勢[14]，但其在還原制備過程中易產(chǎn)生結(jié)構(gòu)缺陷，影響了其分散性及導電性，進而限制了其在電化學分析中的應用。四氨基酞菁是一種重要的水溶性有機染料，擁有18π電子共軛體系和螯合金屬離子能力的中心環(huán)[15]，其豐富的π電子結(jié)構(gòu)易于與rGO發(fā)生非共價作用，形成穩(wěn)定的納米復合材料，能夠有效地改善rGO的電化學性能?；诖耍疚脑O計合成了水溶性四氨基酞菁銦功能化石墨烯(rGO-InTAPc)納米復合材料，并將其用于構(gòu)建高靈敏的黃芩苷電化學傳感器，在實際樣品銀黃顆粒中取得了滿意的結(jié)果，為中藥制劑的質(zhì)量監(jiān)控提供了一種快速的檢測手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI660E工作站(上海辰華儀器有限公司)，采用三電極工作系統(tǒng)：玻碳電極(GCE)或修飾后的GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對電極；Waters 2695高效液相色譜儀；ME204電子分析天平(Mettler Toledo)； pHS-3C pH計(上海雷磁)；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風干燥箱(太倉精宏儀器設備有限公司)；Milli-Q超純水機(默克密理博實驗室設備有限公司)。

黃芩苷、蘆丁(98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；石墨粉(99.95%，>325目)、InCl3(無水級)、4-硝基鄰苯二甲腈(>98.0%，GC)、1,8-二氮雜二環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU，99%，阿拉丁化工(上海)有限公司)；Nafion溶液(阿法埃莎化學公司)；K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6](天津光復科技有限公司)；KCl、KH2PO4和Na2HPO4、ZnCl2、MgCl2、NaCl、CaCl2(天津科密歐化學試劑有限公司)；HCl(煙臺市雙雙化工有限公司)。實驗所用試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 rGO -InTAPc納米復合材料的制備

以石墨粉為原料，采用改良的Hummers法[13]制備氧化石墨烯(GO)。取50 mL 4.0 mg/mL GO溶液，超聲15 min，在攪拌下緩慢加入2.4 mL 80%水合肼溶液，100 ℃回流過夜，然后在6 000 r/min下離心30 min，超純水洗滌3次后，重新分散在50 mL超純水中，即為rGO溶液。

InTAPc通過兩步化學反應合成。首先，以硝基苯為溶劑，DBU為催化劑，取1.96 g 4-硝基鄰苯二甲酸和0.61 g InCl3于茄形瓶中，在氮氣保護下180 ℃油浴中攪拌反應24 h，反應液冷卻至室溫并轉(zhuǎn)移至100 mL冷凍的甲醇中，抽濾，用乙醇清洗至濾液為無色，冷凍干燥后即得四硝基酞菁銦(InTNPc)；然后，以DMF為溶劑，加入所得InTNPc與Na2S，調(diào)節(jié)油浴溫度至50 ℃，在氮氣保護下攪拌反應5 h，冷卻至室溫，抽濾，超純水洗滌3次，真空干燥后得到InTAPc粉末。

將10 mg InTAPc用20 μL DMF溶解后，與10 mL 1.0 mg/mL rGO溶液混合，將混合溶液于室溫下避光攪拌反應過夜，超純水洗滌至上清液為無色，然后分散于10 mL超純水中，得到rGO -InTAPc產(chǎn)物。取rGO -InTAPc與0.5%Nafion等比例混合，即得納米復合物電極修飾液。

1.3 修飾電極的制備

GCE分別用0.3，0.05 μm Al2O3拋光粉打磨至鏡面，沖洗后，依次在乙醇和超純水中各超聲清洗1 min，晾干后備用。吸取5 μL 上述電極修飾液滴涂至GCE表面，置于50 ℃烘箱中避光烘干，即可得到rGO -InTAPc/GCE修飾電極。

1.4 電化學分析

在含有黃芩苷的250 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.0)中，采用三電極工作體系，以GCE、rGO/GCE或rGO -InTAPc/GCE為工作電極，在攪拌作用下富集3 min，然后在-0.2～0.6 V電位范圍內(nèi)進行掃描，利用循環(huán)伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)進行分析測定。

1.5 實際樣品處理

取銀黃顆粒適量，研細，精密稱定200 mg銀黃顆粒粉末于50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇40 mL，超聲處理30 min，冷卻至室溫，加50%甲醇定容至刻度，搖勻過濾，收集濾液，即得2 mg/mL的銀黃顆粒儲備溶液。

1.6 高效液相色譜法檢測

采用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.1%H3PO4溶液-甲醇(53∶47，V/V)為流動相，在流速為1 mL/min，檢測波長為300 nm的條件下，對銀黃顆粒中黃芩苷的含量進行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 rGO-InTAPc復合材料的表征

用掃描電鏡對rGO -InTAPc納米復合物材料進行表征。如圖1所示，rGO -InTAPc納米復合材料表面呈薄薄的類絲綢狀褶皺的形態(tài)，沒有明顯聚集，該結(jié)構(gòu)可顯著提高電極的比表面積，進而增強其電化學響應。

圖1 rGO-InTAPc復合材料的掃描電鏡圖Fig.1 SEM image of rGO-InTAPc nano-composite material

2.2 rGO-InTAPc/GCE的電化學表征

采用CV法評價探針K3[Fe(CN)6]在不同修飾電極上的電化學性能，結(jié)果見圖2。在GCE、rGO/GCE和rGO -InTAPc/GCE上均有一對可逆的氧化還原峰出現(xiàn)，但與GCE、rGO/GCE相比，K3[Fe(CN)6]在rGO -InTAPc/GCE上的響應信號顯著增強，同時背景電流也相應增加，說明rGO -InTAPc納米材料有效提高了電子傳輸能力，進而增強電化學響應信號。為探究rGO -InTAPc復合材料的電催化性能，利用CV法在0.01～0.5 V/s的掃速范圍內(nèi)于探針溶液中進行掃描，其CV圖及相應的Ipa-v1/2曲線如圖2B和2C所示，通過Randles-Sevcik方程[16]計算修飾電極的活性面積，可得rGO -InTAPc/GCE和GCE的電活性比表面積分別為0.415 cm2和0.088 cm2。由該結(jié)果可知，rGO -InTAPc復合材料可顯著提高電極的活性面積。

圖2 (A)Bare GCE、rGO/GCE和rGO -InTAPc/GCE在0.125 V/s掃速下于K3[Fe(CN)6]溶液中的CV圖；(B)rGO -InTAPc/GCE在K3[Fe(CN)6]溶液中不同掃描速率下的CV圖(a→r：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5 V/s)；(C)Ipa和v1/2之間的關系曲線Fig.2 (A)CVs of bare GCE,rGO/GCE,rGO -InTAPc/GCE in K3[Fe(CN)6] solution at scan rate of 0.125 V/s；(B)CVs of rGO -InTAPc/GCE in K3[Fe(CN)6] solution at different scanning rates(a→r：0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.1,0.15,0.2,0.25,0.3,0.35,0.4,0.45,0.5 V/s);(C)The relationship curve between Ipa and v1/2

2.3 黃芩苷在rGO-InTAPc/GCE上的電化學行為

采用CV法研究了黃芩苷在GCE、rGO /GCE、rGO-InTAPc/GCE上的電化學行為。如圖3A所示，裸GCE上出現(xiàn)一對微弱的氧化還原峰，說明裸電極不利于電子的轉(zhuǎn)移，電化學反應慢；rGO /GCE上出現(xiàn)了一對較強的氧化還原峰，與裸電極相比響應電流明顯增強；而在rGO -InTAPc/GCE上，響應電流進一步增大，說明rGO-InTAPc納米復合材料對黃芩苷具有良好的電催化性能。

圖3 (A)不同修飾電極在黃芩苷溶液中的CV圖；(B)黃芩苷在不同掃描速率下的CV圖(a→l：0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.175、0.2、0.225、0.25、0.275、0.3 V/s)；(C)峰電流和掃描速率之間的關系曲線；(D)EP和lnv之間的關系曲線Fig.3 (A)CVs of different modified electrodes in baicalin solution;(B)CVs of baicalin at different scan rates(a→l:0.025,0.05,0.075,0.1,0.125,0.15,0.175,0.2,0.225,0.25,0.275,0.3 V/s);(C)the relationship curve between oxidized current and scan rate;(D)the relationship curve between EP and lnv

2.4 實驗條件的優(yōu)化

支持電解質(zhì)的濃度和pH對電化學檢測的靈敏度有重要的影響。在5.0 μmol/L的黃芩苷溶液中，采用CV法對PBS的pH值進行優(yōu)化，結(jié)果如圖4A所示。電化學響應電流隨著pH的增加而增強，當pH=7.0時達到最大值，而后隨pH的增加反而下降，所以選擇pH=7.0的PBS為支持電解質(zhì)。同時，由圖4A發(fā)現(xiàn)隨pH的升高，氧化還原電位發(fā)生負移，且其峰電位值與pH呈良好的線性關系(圖4B)，線性方程分別為:Epa=0.0609pH+0.6349(r=0.9820)和Epc=-0.066pH+0.5714(r=0.9990)。方程斜率分別為0.0609 V/pH和0.066 V/pH，接近理論值0.0592 V/pH，表明質(zhì)子參與了該電化學反應并且該反應為一個等質(zhì)子等電子電化學反應過程。進一步對PBS的濃度進行優(yōu)化，如圖4C所示，電流值隨著PBS濃度的增大而增大，250 mmol/L時達到最大值，而后隨PBS濃度的增大峰電流值幾乎不再變化，所以選取250 mmol/L為PBS最佳濃度。

圖4 (A) PBS的pH對響應電流的影響(a→e:5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)；(B)EP -pH的線性關系；(C)PBS的濃度對響應電流的影響Fig.4 (A)Effect of PBS pH on response current(a→e:5.0,6.0,7.0,8.0,9.0);(B)Linear relationship of EP-pH;(C)Effect of PBS concentration on response current

2.5 標準曲線及檢出限

在最優(yōu)條件下，采用差分脈沖伏安法(DPV)考察了黃芩苷的響應峰電流與其濃度的關系。如圖5所示，在0.005～10 μmol/L范圍內(nèi)峰電流與其濃度成良好線性關系，線性方程分別為：Ipa=-474.71c-27.686(0.005～0.1 μmol/L)，r=0.9930；Ipa=-14.649c-78.844(0.1～10.0 μmol/L)，r=0.9960。檢出限(S/N=3)為0.5 nmol/L，說明rGO -InTAPc納米復合材料對黃芩苷的測定具有較高的靈敏度。

圖5 不同濃度黃芩苷(a→j:0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μmol/L)在PBS(pH=7.0)中的DPV圖(插圖是黃芩苷濃度與電流之間的關系曲線)Fig.5 DPVs of different concentration of baicalin(a→j:0.005,0.01,0.02,0.05,0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 μmol/L) in PBS(pH=7.0)(The insert was the calibration plot between current and baicalin concentration)

2.6 重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和干擾實驗

重現(xiàn)性和穩(wěn)定性是檢測電化學傳感器性能的關鍵，為了考察rGO -InTAPc/GCE修飾電極的重現(xiàn)性，在上述最優(yōu)實驗條件下，平行修飾6根電極，依次放入0.5 μmol/L黃芩苷溶液中進行測定，其測定結(jié)果的相對標準偏差(RSD)為1.10%，說明該傳感器有良好的重現(xiàn)性。將測定過的修飾電極室溫避光保存15 d后再次測定，黃芩苷的響應信號為初始信號的95.29%，說明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

為了考察rGO -InTAPc傳感器對黃芩苷的選擇性，對可能共存的干擾物進行了考察。結(jié)果表明，500倍濃度的K+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Na+、Cl-、葡萄糖和甘氨酸對黃芩苷測定沒有干擾。不同濃度的蘆丁對黃芩苷的測定均無顯著影響(圖6)。說明該傳感器對黃芩苷具有良好的選擇性，可應用于實際樣品中黃芩苷的測定。

圖6 蘆丁在rGO -InTAPc/GCE修飾電極上對黃芩苷檢測選擇性的影響(a→f:蘆丁濃度依次為0、10.0、25.0、50.0、75.0、100.0 μmol/L)Fig.6 Effect of rutin on rGO -InTAPc/GCE modified electrode for baicalin determination(Rutin concentration:a→f,0,10.0,25.0,50.0,75.0,100.0 μmol/L)

2.7 實際樣品的測定

為了考察所建立方法的可行性，對中藥制劑銀黃顆粒中黃芩苷含量進行測定。取適量待測溶液，用250 mmol/L PBS(pH=7.0)稀釋后進行電化學測定，測得該溶液黃芩苷含量為0.054 μmol/L，RSD值為5.19%，計算得銀黃顆粒中黃芩苷含量為45.48 mg/g。進一步在該待測液中進行加標回收實驗，黃芩苷回收率在96.00%～104.6%之間，RSD值小于3.14%(表1)。同時用HPLC法測定實際樣品中黃芩苷含量，測得銀黃顆粒中黃芩苷含量為43.50 mg/g。電化學方法與HPLC法測定結(jié)果基本一致，證明所制備的傳感器對實際樣品的測定具有較高的準確性。

表1 實際樣品中黃芩苷測定及加標回收率

3 結(jié)論

本文通過非共價作用合成了一種可溶性的rGO -InTAPc納米復合材料，并將其用于黃芩苷電化學傳感器的構(gòu)建。研究了黃芩苷在rGO -InTAPc/GCE上的電化學行為及電化學動力學性質(zhì)。在最佳實驗條件下，黃芩苷響應信號在0.005～10 μmol/L的濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，檢出限為0.5 nmol/L。該傳感器可用于銀黃顆粒中黃芩苷的快速靈敏測定，為中藥制劑的質(zhì)量控制提供了一種簡便有效地檢測手段。