吳明火， 李尚春， 王麗梅， 韓知峽， 王艷芳， 張青碧

(西南醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，四川瀘州 646000)

鄰苯二甲酸酯(Phthalate Esters，PAEs)作為常見(jiàn)的一類(lèi)增塑劑，廣泛應(yīng)用于塑料和聚氯乙烯等工業(yè)產(chǎn)品，以增強(qiáng)其可塑性和多功能性[1]，其中鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(Dicyclohexyl phthalate，DCHP)的使用量也逐漸增加[2]。由于PAEs通過(guò)非共價(jià)鍵與母體材料結(jié)合，因此很容易從產(chǎn)品中遷出，并轉(zhuǎn)化為有害化合物釋放到環(huán)境中。研究表明PAEs廣泛存在于水、土壤以及空氣中[3]。人類(lèi)可能通過(guò)攝入、吸入和皮膚吸收等多種方式接觸到PAEs[4]，長(zhǎng)期接觸PAEs后會(huì)對(duì)人類(lèi)的神經(jīng)和生殖系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)面影響[5]。Sheikh等研究表明，PAEs可導(dǎo)致男性活動(dòng)精子數(shù)量減少和DNA損傷[6]。Li等研究表明，DCHP可影響胎兒Leydig細(xì)胞類(lèi)固醇生成，并導(dǎo)致多核生殖細(xì)胞和Leydig細(xì)胞聚集的發(fā)生，影響睪丸的發(fā)育[7]。目前PAEs的研究主要集中在鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP)等鄰苯二甲酸酯類(lèi)物質(zhì)，而DCHP在體內(nèi)運(yùn)輸以及代謝的研究相對(duì)較少。

牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)作為血液當(dāng)中重要的一種成分，可以結(jié)合與運(yùn)輸內(nèi)源性和外源性物質(zhì)，確保血液滲透壓的穩(wěn)定，具有載體以及調(diào)節(jié)酸堿度的作用[8]。因BSA的氨基酸序列與人血清白蛋白極為相似，并且價(jià)格便宜、易獲取，因此BSA被用于外源小分子與生物大分子間相互作用的研究中[9]。顧佳麗等以BSA為模型蛋白，研究甲苯達(dá)唑與BSA的相互作用[10]。本研究將BSA作為模型蛋白，采用光譜學(xué)以及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)DCHP和BSA之間的相互作用機(jī)制進(jìn)行研究。本研究結(jié)果有助于深入了解DCHP在生物體內(nèi)運(yùn)輸機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Cary Eclipse熒光光譜儀(美國(guó)，Agilent公司)；F-4500熒光光度計(jì)(日本，日立公司)；UV-5500PC紫外-可見(jiàn)分光光度儀(上海元析公司)；JASCO J-815圓二色譜儀(日本，JASCO公司)；FE20/EL20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器(上海)公司)。

牛血清白蛋白(BSA，西亞試劑)：配制成1.67×10-3mol/L儲(chǔ)備溶液，使用時(shí)根據(jù)需要稀釋。鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP，純度為99%，百靈威科技有限公司，北京)配制成1.67×10-2mol/L儲(chǔ)備溶液。布洛芬(Ibuprofen，純度為98%，上海源葉生物科技有限公司)、華法林(Warfarin，純度為98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，均配制為1.67×10-3mol/L儲(chǔ)備溶液，使用時(shí)根據(jù)需要稀釋。pH=7.4的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl緩沖溶液，濃度為0.05 mol/L(0.15 mol/L NaCl)。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光光譜于比色皿中準(zhǔn)確加入3 mL Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)，固定BSA濃度為1.67×10-6mol/L，然后加入不同濃度DCHP(0、3.30×10-7、6.70×10-7、10.00×10-7、13.30×10-7、16.70×10-7mol/L)。以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，在發(fā)射波長(zhǎng)為300～450 nm的范圍內(nèi)測(cè)定BSA的熒光強(qiáng)度。參照文獻(xiàn)公式[11]對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，從而排除內(nèi)濾效應(yīng)。設(shè)定Δλ=15 nm及Δλ=60 nm，240～400 nm范圍掃描得同步熒光光譜。

1.2.2 位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)選用華法林和布洛芬兩種位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)劑。比色皿中準(zhǔn)確加入3 mL Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)，固定BSA濃度為1.67×10-6mol/L，華法林和布洛芬的濃度均為2.51×10-7mol/L,石英比色皿中加入不同濃度DCHP(0、3.30×10-7、6.70×10-7、10.00×10-7、13.30×10-7、16.70×10-7mol/L)。固定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，在溫度298 K的條件下分別測(cè)定不同探針下的熒光光譜。

1.2.3 圓二色譜溶液中BSA濃度為1.67×10-5mol/L，DCHP的濃度為1.67×10-5mol/L。參數(shù)設(shè)置：掃描范圍為190～250 nm，石英樣品池的光徑為1 mm，掃描速度為500 nm/min，掃描間隔為0.1 nm，測(cè)量時(shí)BSA與DCHP的濃度比為1∶0和1∶1，以1%磷酸鹽緩沖溶液(PBS)為參比。所有數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)3次掃描后取平均值。

1.2.4 分子對(duì)接DCHP的結(jié)構(gòu)通過(guò)ChemBio3D Ultra14.0生成，并通過(guò)MMFF94對(duì)分子力場(chǎng)做優(yōu)化設(shè)計(jì)，BSA的蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)源于RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)(編號(hào)：1H9Z)[12]。使用Autodock 4.2程序完成分子對(duì)接。對(duì)接算法采取Lamarckian遺傳算法，將參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)設(shè)置。篩選出結(jié)合自由能最小的構(gòu)象，應(yīng)用LigPlus+軟件分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 猝滅方式

熒光猝滅可分為靜態(tài)猝滅與動(dòng)態(tài)猝滅，靜態(tài)猝滅常數(shù)隨著溫度增高而不斷降低，而動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)與溫度之間呈現(xiàn)正相關(guān)[13]。依照Stern-Volmer方程能夠計(jì)算出DCHP對(duì)BSA的熒光猝滅常數(shù)KSV，從而判斷猝滅類(lèi)別[14]。其結(jié)果如圖1A以及表1所示。隨著研究體系中DCHP濃度的升高，BSA的熒光強(qiáng)度逐漸降低，說(shuō)明DCHP對(duì)BSA的內(nèi)源熒光產(chǎn)生猝滅作用，表明DCHP與BSA發(fā)生了作用并使BSA的構(gòu)象發(fā)生了改變。通過(guò)表1能夠了解到，由于體系溫度不斷增高，KSV數(shù)值在不斷降低，在體系溫度T=298 K時(shí)，兩種物質(zhì)的雙分子猝滅速率常數(shù)可達(dá)到1.24×1013L/(mol·s)，和最大擴(kuò)散常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)相比，高出3個(gè)數(shù)量級(jí)，表明DCHP誘導(dǎo)BSA的熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅。

2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)

按照雙對(duì)數(shù)方程[16](公式1)，將不同體系溫度下的熒光強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算結(jié)果如圖1B與表1所示，隨著溫度提升，DCHP與BSA的結(jié)合常數(shù)(Ka)逐漸降低，表明DCHP對(duì)BSA的猝滅程度隨著溫度的升高而逐漸降低，進(jìn)一步證實(shí)DCHP對(duì)BSA有靜態(tài)猝滅效應(yīng)[17]。T=298 K時(shí)，結(jié)合常數(shù)(Ka)為2.45×105L/mol，說(shuō)明DCHP與BSA之間存在較強(qiáng)的作用力；由擬合直線的斜率可知，不同溫度條件下BSA-DCHP體系的斜率(n)均接近于1(表1)，說(shuō)明BSA與DCHP之間有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[18]。

lg[(F0-F)/F]=lgKa+nlg[Q]

(1)

式(1)中，F(xiàn)0和F分別為未加入和已加入DCHP時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度；Ka為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；[Q]為DCHP的濃度[18]。

圖1 不同濃度DCHP條件下BSA的熒光光譜(A)和不同溫度條件下的雙對(duì)數(shù)曲線(B)Fig.1 Fluorescence spectra of BSA at different concentrations of DCHP(A) and double logarithm curves at different temperatures(B)1 - 6,cDCHP(×10-7 mol/L):0，3.30，6.70，10.00，13.30，16.70；cBSA=1.67×10-6 mol/L;T=298 K.

表1 不同溫度條件下DCHP與BSA結(jié)合參數(shù)及Stern-Volmer猝滅常數(shù)

目前研究表明，BSA與小分子物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)有兩個(gè)，分別位于BSA的子域ⅡA(位點(diǎn)Ⅰ)和ⅢA(位點(diǎn)Ⅱ)的疏水空腔中，其中位點(diǎn)Ⅰ含有Trp殘基和Tyr殘基，而位點(diǎn)Ⅱ只含有Tyr殘基[12]。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為280 nm時(shí)可以同時(shí)激發(fā)Trp和Tyr的熒光，但是將激發(fā)波長(zhǎng)調(diào)整為295 nm時(shí)只能激發(fā)Tyr的熒光。因此對(duì)比激發(fā)波長(zhǎng)分別為280 nm和295 nm時(shí)，DCHP對(duì)BSA熒光的猝滅程度，可以判斷DCHP與BSA的結(jié)合位點(diǎn)。如圖2，在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，DCHP對(duì)BSA的熒光猝滅程度顯著高于激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，這就證實(shí)Trp和Tyr兩個(gè)殘基都參加到了猝滅階段，并且DCHP與BSA結(jié)合位置更偏向于Trp殘基。

圖2 不同激發(fā)波長(zhǎng)下DCHP對(duì)BSA的熒光強(qiáng)度影響Fig.2 Effect of DCHP on fluorescence intensity of BSA at different excitation wavelengthscDCHP(×10-6 mol/L):1.67，3.30，5.01，6.68，8.35，16.7，33.0；cBSA=1.67×10-6 mol/L；T=298 K.

為進(jìn)一步探究DCHP與BSA的結(jié)合位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選用熒光探針競(jìng)爭(zhēng)試劑華法林和布洛芬。研究表明華法林作為中性雜環(huán)化合物的熒光型探針，布洛芬作為芳香族化合物的熒光探針，分別可以與BSA位點(diǎn)Ⅰ和位點(diǎn)Ⅱ特異性結(jié)合[19]。加入華法林后結(jié)合常數(shù)下降的幅度更明顯，說(shuō)明華法林與DCHP共存時(shí)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，華法林探針對(duì)DCHP與BSA作用的影響效果更強(qiáng)，表明DCHP與BSA的結(jié)合位點(diǎn)是位點(diǎn)Ⅰ。

2.3 作用力類(lèi)型

各種類(lèi)別的藥物小分子能夠通過(guò)氫鍵和范德華力等[20]與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成復(fù)合物。根據(jù)熱力學(xué)原理，體系的吉布斯自由能ΔG、熱力學(xué)熵變?chǔ)以及焓變?chǔ)的相對(duì)大小，能夠判斷反應(yīng)是不是自發(fā)進(jìn)行和復(fù)合物的作用力種類(lèi)[21]。在溫度改變不大時(shí)，反應(yīng)的焓變?chǔ)能夠當(dāng)做一個(gè)常數(shù)進(jìn)行處理。針對(duì)于DCHP-BSA體系，按照Van’t Hoff公式對(duì)不同溫度情況下的K值進(jìn)行計(jì)算，其結(jié)果如表2所示。ΔG<0證實(shí)反應(yīng)屬于自發(fā)進(jìn)行，ΔH<0、ΔS<0，結(jié)果證實(shí)BSA和DCHP間的作用力是氫鍵與范德華力。

表2 不同溫度條件下DCHP-BSA體系熱力學(xué)參數(shù)

2.4 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

為進(jìn)一步研究DCHP與BSA之間的相互作用，利用Autodock 4.2軟件對(duì)DCHP與BSA形成的1∶1非共價(jià)結(jié)合復(fù)合物進(jìn)行了研究。DCHP與BSA對(duì)接結(jié)果的最佳構(gòu)象如圖3(A)，從圖3(B)可以看出它們之間的結(jié)合位點(diǎn)位于位點(diǎn)Ⅰ[22]。通過(guò)LigPlus+軟件分析DCHP與BSA之間最優(yōu)構(gòu)象的氫鍵及疏水作用(圖3(C))，可以發(fā)現(xiàn)DCHP與16種氨基酸殘基具有疏水作用，其中大多數(shù)是疏水氨基酸(Ala212，Ala209，Val481，Val342，Trp213，Leu197，Leu454，Leu480，Leu346)，DCHP與Ser343之間存在氫鍵作用，鍵長(zhǎng)0.332 nm。對(duì)接實(shí)驗(yàn)的結(jié)果同樣表明，BSA與DCHP之間的作用力是疏水作用力，并且結(jié)合位點(diǎn)位于BSA結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ，與熒光光譜實(shí)驗(yàn)一致。

圖3 DCHP與BSA的分子對(duì)接結(jié)果Fig.3 Molecular docking results of DCHP and BSA(A)The best conformation of DCHP and BSA docking results；(B)The docking site of DCHP and BSA；(C)The result of LigPlus+.

2.5 BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變

2.5.1 同步熒光光譜BSA構(gòu)象中酪氨酸(Tyr)以及色氨酸(Trp)殘基的熒光特點(diǎn)，分別能夠從激發(fā)、發(fā)射波長(zhǎng)差Δλ為15 nm以及60 nm時(shí)表現(xiàn)出來(lái)[23]。與此同時(shí)，最大發(fā)射波長(zhǎng)向短波方向或長(zhǎng)波方向移動(dòng)，即藍(lán)移或紅移，說(shuō)明氨基酸殘基周?chē)h(huán)境疏水性增強(qiáng)或極性增強(qiáng)[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，由于DCHP-BSA研究體系中隨著DCHP濃度的增加，Tyr殘基以及Trp殘基的熒光強(qiáng)度都有所下降，證實(shí)上述兩個(gè)殘基都參與到了結(jié)合過(guò)程，Δλ為60 nm時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度下降幅度更大，說(shuō)明了DCHP與BSA發(fā)生了結(jié)合并且結(jié)合位置較為靠近Trp殘基。最大發(fā)射波長(zhǎng)向短波方向移動(dòng)，表明DCHP-BSA復(fù)合物發(fā)生了藍(lán)移，Trp殘基周?chē)h(huán)境疏水性增強(qiáng)。即BSA的構(gòu)象發(fā)生了改變。

圖4 Δλ=15 nm(A)和Δλ=60 nm(B)時(shí)，不同DCHP濃度下BSA的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of BSA at different DCHP concentrations,Δλ=15 nm(A)and Δλ=60 nm(B)1 - 6,cDCHP(×10-7 mol/L):0，3.30，6.70，10.0，13.30，16.70;cBSA=1.67×10-6 mol/L；T=298 K.

2.5.2 三維熒光光譜三維熒光光譜是研究化學(xué)小分子對(duì)蛋白質(zhì)的構(gòu)象能否產(chǎn)生改變的有效途徑[24]。如圖5所示，BSA有兩個(gè)指紋峰(Peak 1和Peak 2)，位置分別位于228 nm/344 nm(λex/λem)、280 nm/342 nm(λex/λem)。Peak 1主要反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)(多肽骨架結(jié)構(gòu)特征)的變化情況，Peak 2反映Trp殘基和Tyr殘基的光譜特征[25]。加入DCHP后，Peak 1和Peak 2的熒光強(qiáng)度都有所降低，該現(xiàn)象說(shuō)明DCHP和BSA之間存在相互作用。Peak 1的Stokes位移發(fā)生藍(lán)移(116減少到113)，表明DCHP的存在誘導(dǎo)BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。Peak 2的Stokes位移從62減少到60，說(shuō)明DCHP進(jìn)入了BSA的疏水空腔并導(dǎo)致芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變。

圖5 游離態(tài)(A)和結(jié)合態(tài)(B)的BSA的三維熒光光譜圖Fig.5 Three dimensional fluorescence spectra of free(A) and bound(B) BSA

2.5.3 圓二色譜圓二色譜如圖6所示，BSA在208 nm處和224 nm處出現(xiàn)兩個(gè)負(fù)峰，它們是BSA中α-螺旋(α-Helix)結(jié)構(gòu)的特征峰[25]。DCHP對(duì)BSA的圓二色譜峰形基本無(wú)影響，但可導(dǎo)致其強(qiáng)度減弱。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算和分析可知，單純BSA的α-螺旋含量為57.09%，加入DCHP后BSA的α-螺旋含量下降至53.43%。該結(jié)果表明DCHP與BSA發(fā)生了相互作用，并使得BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。該結(jié)果與三維熒光結(jié)果一致。

圖6 BSA和DCHP-BSA復(fù)合物的圓二色譜圖Fig.6 Circular dichroism spectra of BSA and DCHP-BSA complexcBSA=1.67×10-5 mol/L;cDCHP=1.67×10-5 mol/L;T=298 K.

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)利用光譜法與分子對(duì)接技術(shù)對(duì)DCHP和BSA的相互作用情況進(jìn)行探究，其中包含結(jié)合模式、結(jié)合常數(shù)以及結(jié)合位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)，DCHP和BSA結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ相結(jié)合，并出現(xiàn)了比較穩(wěn)定的復(fù)合物。DCHP-BSA復(fù)合物中起到作用的是范德華力與氫鍵兩種結(jié)合力。總體而言，本研究結(jié)果提供了有關(guān)DCHP與BSA之間的相互作用的詳細(xì)信息，有助于我們更好地了解PAEs的毒性。