黃偉華， 胡 筱， 廖世琪， 趙一煒， 許惠鳳*， 朱 希

(1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室，福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350122；3.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建福州 350002)

隨著現(xiàn)代化工業(yè)進程的加快，鉛已成為生態(tài)環(huán)境中的主要重金屬污染物之一，經(jīng)土壤種植收獲的植物類藥材也因此常受其擾[1]。鉛污染會對人類的造血功能、神經(jīng)系統(tǒng)和腎臟造成慢性損害，嚴重者還會出現(xiàn)鉛中毒腦病[2]。因此，對藥材中Pb2+含量的測定具有十分重要的意義。迄今為止，研究人員已經(jīng)開發(fā)了許多Pb2+的檢測方法，如原子吸收光譜法[3]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[4]、原子熒光光譜法[5]等。這些方法相對成熟可靠，但受儀器條件限制，不能滿足現(xiàn)場快速檢測的實際需求。近年來，利用功能型核酸探針構(gòu)建簡便型生物傳感器，在Pb2+檢測方法受到人們的廣泛關(guān)注。其中，最具代表性的是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)篩選得到的寡核酸片段DNA核酶(DNAzyme)，該酶以Pb2+作為輔因子來催化切割斷裂特定的底物鏈[6]。不少研究者利用這一特性實現(xiàn)了對Pb2+的靈敏檢測[7,8]。然而，底物鏈通常包含切割位點核糖腺苷(rA)，該結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，極易水解，對檢測溶液環(huán)境要求較為苛刻，在一定程度上限制了其應(yīng)用。另一種代表性功能核酸是富含鳥嘌呤的核苷酸片段，俗稱富G序列。它位于真核細胞染色體的末端，同時也在一些重要的原癌基因的啟動子區(qū)和未翻譯的mRNA中分布廣泛[9,10]。在這類核苷酸片段中，四個G堿基通過氫鍵形成環(huán)狀平面，兩個以上的這些環(huán)狀平面通過π-π作用堆積形成G -四鏈體(G4)。一些金屬離子(如K+、Pb2+、Tb3+)[11-14]和小分子化合物(如Hemin)[15]可以促進G4的形成。Hemin不僅可以穩(wěn)定G4結(jié)構(gòu)，還能幫助G4增強類過氧化物酶的催化性質(zhì)[16,17]。Pb2+可以縮短Pb-O鍵和O-O鍵，使得到的G4的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。然而以Pb2+為中心的這種G4結(jié)構(gòu)則會抑制其原先的催化活性[18]。這種催化活性的改變，使得G4聯(lián)合Hemin的傳感策略可以用于Pb2+的檢測[6]。不過由于Hemin本身對H2O2具有催化作用，采用這種方法除了對Hemin的用量要求比較嚴格，而且背景信號也相對偏高。

硫黃素T(Thioflavin T,ThT)分子由一個芐胺環(huán)和一個苯硫醚環(huán)組成，這兩個環(huán)可以圍繞C-C鍵自由旋轉(zhuǎn)，導致ThT在自然狀態(tài)下熒光信號很弱。而當這種旋轉(zhuǎn)受到某些特殊結(jié)構(gòu)的限制時，ThT的熒光就會被增強。近年來，研究發(fā)現(xiàn)ThT能夠特異性結(jié)合G4，結(jié)合后其熒光強度得到極大增強[19 - 21]。本工作利用Pb2+與ThT之間對G4中心的競爭關(guān)系，構(gòu)建了一種基于G4-ThT的熒光傳感器用于Pb2+的檢測。當Pb2+存在時，其可幫助G4形成更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，故而通過競爭作用將ThT從G4中心釋放出來，引起體系熒光強度的下降，可以實現(xiàn)對Pb2+的超痕量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

熒光光譜儀(F-4500，日本日立公司)；pH計(pHS -3C，上海越平科學儀器有限公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司)；干式恒溫器(Bionoon-101G，上海般諾生物科技有限公司)。所有光學測量均在室內(nèi)環(huán)境條溫度件下操作；所有熒光測量均在統(tǒng)一的石英比色皿中操作。

寡核苷酸序列購自上海生物工程有限公司，序列為：5′-AGG GTT AGG GTT AGG GTT AGG G -3′，使用時未經(jīng)特別純化；硫黃素T(ThT)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、Pb(NO3)2等試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純；金屬離子溶液均以它們的硝酸鹽按常規(guī)法配制。實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 實驗方法

1.2.1 G4-ThT混合溶液的配制將裝有G4寡核苷酸序列凍干粉的EP管以10 000 min離心5 min,輕輕加超純水配成濃度為1 μmol/L的母液并混合均勻，隨后在干式恒溫器中于95 ℃下加熱5 min進行解鏈。待其冷卻至室溫，取一支EP管，加入178 μL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.0，含0.1 mol/L KCl)，2 μL的ThT溶液，最后加入20 μL G4溶液混合，使G4最終濃度為100 nmol/L。

1.2.2 Pb2+的熒光檢測往上述G4-ThT溶液(分別含有100 nmol/L G4和20 μmol/L ThT)中加入2 μL 不同濃度的Pb2+標準溶液，充分振蕩3 min后進行熒光檢測。熒光測試條件：激發(fā)波長為425 nm，發(fā)射波長掃描范圍450～600 nm，激發(fā)/發(fā)射狹縫寬度均為5 nm。

1.2.3 樣品前處理中藥材獨活經(jīng)粉碎研磨后，精密稱取0.5 g，置于四氟乙烯消解罐中，加5 mL HNO3，混勻，浸泡過夜后，置于微波消解爐內(nèi)進行消解。待消解完全，加熱消解罐至紅棕色氣體揮盡且溶液體積約為2 mL。將冷卻后的溶液用超純水轉(zhuǎn)至25 mL容量瓶中定容。加標試樣的制備是先將定量的Pb2+標準溶液與樣品粉末一并加入消解罐中，隨后同法進行樣品處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

利用Pb2+與ThT之間對G4的競爭作用，構(gòu)建檢測Pb2+的熒光傳感器的檢測原理如圖1所示。在Tris-HCl緩沖溶液中，富G堿基的寡核苷酸片段自發(fā)折疊成非常穩(wěn)定的反平行G4的空間構(gòu)型。與此同時，溶液中的ThT也隨之嵌入到該G4結(jié)構(gòu)中。由于嵌入后ThT結(jié)構(gòu)中連接芐胺環(huán)和苯硫醚環(huán)的C-C鍵旋轉(zhuǎn)自由度受到G4結(jié)構(gòu)的束縛，剛性結(jié)構(gòu)得到增強，從而增強了其熒光信號值。而該反平行結(jié)構(gòu)的G4結(jié)構(gòu)也能夠結(jié)合Pb2+，所以當溶液中存在Pb2+時，Pb2+會將ThT從該G4結(jié)構(gòu)中競爭出來，從而導致體系熒光下降，因此，通過體系熒光強度的改變可以實現(xiàn)對Pb2+的檢測。

圖1 利用G4-ThT檢測Pb2+的原理圖Fig.1 Schematic diagram for the detection of Pb2+ with G4-ThT

2.2 可行性分析

實驗首先對傳感器的可行性進行了研究。在圖2中，曲線a是G4-ThT在Tris-HCl緩沖溶液中的熒光光譜，此時體系的熒光非常強，這是由于ThT中的芐胺環(huán)和苯硫醚環(huán)轉(zhuǎn)動受到了G4的束縛。而往該溶液體系中加入500 nmol/L的Pb2+后，可以發(fā)現(xiàn)熒光強度明顯降低(圖2曲線b)。其主要原因是Pb2+將ThT從G4結(jié)構(gòu)中競爭出來，使得ThT中的芐胺環(huán)和苯硫醚環(huán)又能夠自由地圍繞C-C鍵自由旋轉(zhuǎn)，從而使分子熒光受到抑制。該體系熒光降低程度與Pb2+濃度相關(guān)，因此可用于Pb2+的檢測。

圖2 加入Pb2+前(a)后(b)G4-ThT體系的熒光光譜圖Fig.2 The fluorescence spectra of G4-ThT before(a) and after(b) addition of Pb2+

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1 ThT與G4反應(yīng)時間及ThT濃度實驗首先考察了ThT與G4的作用時間及ThT的濃度對體系熒光強度的影響，結(jié)果如圖3所示。從圖3(A)可以看出，在開始的10 min內(nèi)，體系的熒光信號強度隨著反應(yīng)時間的延長而逐漸增大，在10 min后熒光信號達到穩(wěn)定值，且不再隨著時間的延長而發(fā)生明顯變化。實驗進一步在固定反應(yīng)時間為10 min的條件下，考察ThT濃度的影響。從圖3(B)可見，隨著ThT濃度增大，體系的熒光強度逐漸增強，當ThT濃度為20 μmol/L時，熒光達到最大值。因此，在隨后的實驗中ThT濃度均采用20 μmol/L。

圖3 (A)ThT與G4不同作用時間下的熒光強度；(B)不同ThT濃度存在時的熒光強度Fig.3 (A) The fluorescence intensity under different reaction time between ThT and G4；(B) The fluorescence intensity under different ThT concentrations

2.3.2 Pb2+與G4-ThT體系的反應(yīng)時間實驗進一步考察了Pb2+與G4-ThT體系反應(yīng)時間與熒光強度的關(guān)系，結(jié)果如圖4所示。隨著反應(yīng)時間的增加，熒光強度逐漸減弱，表明體系中ThT Pb2+所取代，逐漸從體系中釋放出來。當反應(yīng)時間為5 min，熒光強度降低了86.3%，而時間繼續(xù)延長，熒光強度幾乎未出現(xiàn)明顯的改變，表明此時的競爭反應(yīng)達到平衡。因此，Pb2+與體系的反應(yīng)時間選定為5 min。

圖4 不同反應(yīng)時間下的熒光強度Fig.4 The fluorescence intensity under different reaction time

2.4 線性范圍及檢測限考察

在上述實驗得出的最優(yōu)條件(即反應(yīng)時間為5 min，ThT的濃度為20 μmol/L)下，研究了不同濃度的Pb2+對體系熒光強度的影響。從圖5(A)中可以看出，隨著Pb2+濃度的增加，熒光強度逐漸降低。Pb2+的濃度在5～1 000 nmol/L范圍時，其濃度的對數(shù)與熒光強度呈現(xiàn)良好的線性(圖5(B))，線性方程為：F=41 891-8 935lgc(R2值為0.9910)。當信噪比為3時，該方法對Pb2+的檢測限達到1.6 nmol/L。

圖5 (A)不同濃度的Pb2+存在時的熒光光譜圖；(B)線性曲線Fig.5 (A)The fluorescence spectra under different concentrations of Pb2+ ;(B)The linear relationship

該方法與已報道的方法對比如表1所示。從表中可以看出，與已報道的一些方法相比，本方法具有比較高的檢測靈敏度和寬的線性檢測范圍。

表1 本方法與已報道方法對比情況表

2.5 選擇性

以幾種常見金屬離子為干擾離子，如Mn2+、Ca2+、Ba2+、Na+、Mg2+、Zn2+，考察體系對于這些干擾離子的響應(yīng)情況，這些金屬離子濃度均為20 μmol/L，而Pb2+的濃度為1 μmol/L。結(jié)果如圖6所示(縱坐標ΔF代表體系的熒光變化值，ΔF=F0-F，其中F0和F分別為加入金屬離子前后體系的熒光值)。從圖中可以看出，當高濃度的干擾離子存在時，體系的熒光強度變化幾乎不明顯，然而Pb2+存在時，卻引起熒光強度的急劇變化。這表明該體系對Pb2+有較好的選擇性。

圖6 不同離子存在下的熒光強度變化值ΔFFig.6 The change of fluorescence intensity ΔF in the presence of different ions

2.6 實際樣品檢測

實驗考察了該熒光傳感器用于中藥材獨活提取液中Pb2+的檢測(樣品前處理見“1.2.3”，并按“1.2.2”的步驟對其進行檢測)。由于樣品中的Pb2+含量實際未檢出，故進行了加標回收實驗，檢測結(jié)果如表2所示。從表中可以看出，利用該熒光傳感器檢測提取液中的Pb2+，其回收率在86.5%～107.4%范圍，表明該方法可以用于實際樣中Pb2+的測定。

表2 加標回收實驗

3 結(jié)論

本文利用G -四鏈體為載體，以ThT作為嵌入劑，構(gòu)建了一種基于競爭原理的熒光生物傳感器用于Pb2+的檢測，并用于中藥材獨活實際樣品中Pb2+含量的測定。該方法操作相對簡便快速，且具有比較高的靈敏度和選擇性，有望用于實際樣品中Pb2+含量的快速檢測。