高 榮， 羅大娟， 蘇麗霞， 蘇永歡， 張 梅，劉冰倩*

(貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州省合成藥物工程實驗室，貴州貴陽 550025)

抗壞血酸(AA)是一種己糖醛基酸，其作為抗氧化劑和自由基清除劑，能夠緩和多種疾病的氧化應(yīng)激[1,2]，如保護細胞、延長壽命、防治動脈硬化、有促進傷口的愈合、提高人體的免疫力，同時具有抗癌作用等，是一種與生命活動密切相關(guān)的化合物。當(dāng)血液中AA的濃度低于10 mmol/L時，可引起壞血病，造成機體血管系統(tǒng)紊亂、皮下及肌肉組織出血、皮膚淤點、甚至引起各種心血管疾病等[3]。因此，研究開發(fā)對AA快速準(zhǔn)確的分析方法是很有必要的。

目前，檢測AA的方法很多，如：高效液相色譜法(HPLC)[4]和紫外-可見(UV-Vis)分光光度法[5]，而熒光分析法和電化學(xué)生物傳感器[6]是基于多學(xué)科相互滲透發(fā)展起來的高新技術(shù)，能在復(fù)雜體系中進行連續(xù)監(jiān)測。雖然這些方法能夠滿AA檢測的要求，但通常受儀器昂貴和涉及高度復(fù)雜程序的限制，難以普及；碘量法和比色分析法操作簡單，但滴定終點需通過肉眼辨別，且某些樣品本身存在顏色干擾，有一定的局限性[7]。近年來，便攜式傳感器被大量開發(fā)，如Zhu等人[8]開發(fā)了以氣壓信號為輸出終端的便攜式傳感器，使用辣根過氧化氫物酶(HRP)對檢測抗體功能化與靶抗原形成夾心式復(fù)合物，然后催化底物H2O2分解，導(dǎo)致反應(yīng)室內(nèi)的氣壓顯著增加進而實現(xiàn)對目標(biāo)物檢測。便攜式傳感器通常將目標(biāo)物信號轉(zhuǎn)化為壓力、溫度、pH和重量等易被捕獲的信號為檢測終端，可以實現(xiàn)對目標(biāo)物的快速、實時、低成本地檢測。

信號輸出模式多種多樣，單信號檢測是基于某個單一信號輸出實現(xiàn)對目標(biāo)物檢測，如Liu等人[9]提出了以溫度計為檢測手段對納米金晶體生長的光熱免疫分析。同樣Fu等人[10]首次發(fā)現(xiàn)了納米氧化鐵介導(dǎo)的TMB-H2O2比色體系，通過近紅外激光驅(qū)動的光熱效應(yīng)將免疫分析轉(zhuǎn)化為熱信號，使利用溫度計進行簡單的光熱免疫分析成為可能，在生物醫(yī)學(xué)方面具有巨大的應(yīng)用潛力。單信號檢測大多存在著信號單一、準(zhǔn)確度不夠等方面的局限性，而Chen等人[11]創(chuàng)新性地建立了由光熱觸發(fā)的多信號檢測系統(tǒng)(MSR)，在近紅外激光的激發(fā)下，利用光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)使多信號傳感元件的熱能急劇增加，結(jié)果引起局部溫度升高、視覺顏色變化以及體重下降等信號。值得一提的是，其中多種信號相互佐證、相互補充有望產(chǎn)生更可靠的結(jié)果且極大地降低成本、實現(xiàn)高靈敏度的即時檢測(POCT)。本研究利用AA的還原性質(zhì)，以CoOOH納米片對H2O2分解為平臺，基于氣壓、溫度和質(zhì)量為一體的多信號傳感平臺實現(xiàn)對AA定量檢測，并應(yīng)用于實際樣品分析。實驗原理圖見圖1。與其它對AA的傳感平臺相比較，本方案采用便攜式氣壓計、筆試溫度計和電子天平作為信號獲取工具，具有易于富集、低廉、便捷等特點，有望實現(xiàn)AA篩選的普及化檢測儀，利于進行藥品、食品大量樣本的初步篩選。

圖1 實驗原理圖Fig.1 Schematic diagram showing the detection principle

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HT-930專業(yè)差壓測量儀(廣州宏誠集業(yè)電子科技有限公司)；T-105探針式電子溫度計(西安溫美測實業(yè)有限公司)；BSA224S電子天平(上海賽利多斯科學(xué)儀器有限公司)。

抗壞血酸(AA,純度≥99.7%，上海試四赫維化工有限公司)；H2O2、NaCl(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)；CoCl2·6H2O、HCl、NaOH(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸、檸檬酸鈉(天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司)；谷氨酸、組氨酸(上海源葉生物科技有限公司)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純，實驗用水為去離子水。

維C銀翹片(貴州百靈集團制藥股份有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 CoOOH納米片的合成CoOOH納米片是根據(jù)之前的報道方法[12]制備，只做了少量的修改。其合成過程如下：將0.1903 g CoCl2·6H2O溶解在80 mL去離子水中，在劇烈攪拌下加入20 mL NaOH溶液(1.0 mol/L)，超聲溶解1 min后，與4 mL NaClO(0.9 mol/L)溶液混合并超聲20 min，用去離子水洗滌3次并離心10 min(8 000 r/min)，最后將褐黑色的CoOOH納米片重新分散于9 mL去離子水中(5.44 mg/mL)，并在4 ℃下保存，備用。

1.2.2 多信號傳感平臺檢測AA取100 μL已制備的CoOOH納米片于密閉反應(yīng)瓶中，分別加入100 μL不同濃度的AA溶液，室溫孵育5 min后，加入50 μL Tris-HCl緩沖液(pH=10)和100 μL 6%H2O2溶液，迅速將反應(yīng)體系用膠塞密封，利用氣壓計檢測反應(yīng)瓶中每1 min的氣壓變化，并用溫度計檢測每20 s反應(yīng)瓶中溫度的變化。氣壓的增加迫使一定量的水從排水瓶溢出到預(yù)先裝有NaOH溶液的集水瓶中，通過電子天平準(zhǔn)確稱量溢出水的重量變化，由于NaOH良好的溶解放熱效應(yīng)，再次利用溫度計檢測每10 s集水瓶中溫度的變化。

1.2.3 實際樣品的檢測本實驗對維C銀翹片實際樣品中AA進行了考察[13]。取本品兩片，精密稱定，充分研磨至細，精密稱取0.567 g(每片含有維生素C為49.5 mg)，充分振搖使其溶解，然后在冷凍離心機中離心10 min(1 200 r/min)，使用0.45 μm孔徑濾膜對過濾，上清液用去離子水分別稀釋為50、100、200、400 μg/mL，進行加標(biāo)回收率考察。

2 結(jié)果與討論

2.1 CoOOH納米片表征

CoOOH納米片成功合成直接影響實驗結(jié)果，因此我們首先利用紫外-可見吸收光譜對CoOOH納米片進行表征。如圖2A中可見，CoCl2在波長521 nm有明顯的特征吸收峰，而形成CoOOH納米片后，分別在234 nm和380 nm處出現(xiàn)兩處新的吸收峰，與已報道[14]的結(jié)果一致。如圖2B所示，通過X射線衍射顯示出兩個典型的結(jié)晶峰，分別對應(yīng)的2θ為20.0°和39.2°處的(003)和(012)。通過與標(biāo)準(zhǔn)JCPDS卡(編號07-0169)的比較，進一步證明了結(jié)晶CoOOH納米片的制備是成功的。最后用掃描電子顯微鏡對制備的CoOOH納米片進行了形貌表征，由圖2C和2D中可以明顯的看到CoOOH納米片是一種正六邊形薄片，平均厚度為7.5 nm，平均尺寸為120 nm，且具有良好的單分散性[15]。這些結(jié)果證實了CoOOH納米片的合成成功。

圖2 (A)CoCl和CoOOH納米片的紫外-可見吸收光譜圖；(B)CoOOH納米片的X射線衍射圖譜；(C、D)CoOOH納米片的掃描電鏡圖像Fig.2 (A) UV-Vis absorption spectra of CoCl and CoOOH nanoflakes;(B) X-ray diffraction patterns of CoOOH nanoflakes;(C) and (D) are scanning electron microscopic images of CoOOH nanoflakes respectively

2.2 CoOOH納米片對AA響應(yīng)表征

從圖3A中可知，CoOOH納米片被AA還原之后，可以明顯的觀察到CoOOH納米片在234 nm和380 nm兩處的吸收峰明顯減弱。同樣通過循環(huán)伏安法(圖3B)，當(dāng)CoOOH納米片被400 μg/mL AA還原后，觀察到峰電流明顯下降，表明CoOOH與AA的相互作用后明顯阻滯了電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)，這與典型的電化學(xué)阻抗譜的結(jié)果有很好的一致性。在交流阻抗譜圖中，較高頻率的半圓形部分通常對應(yīng)于電荷轉(zhuǎn)移受限過程，隨著界面電荷轉(zhuǎn)移電阻的增大，半圓形的直徑明顯增大[16,17]。如圖3C所示，CoOOH納米片被400 μg/mL AA反應(yīng)之后，電極的阻抗譜半圓形區(qū)域顯著增加(Rct=49 Ω)，說明電極表面的電荷轉(zhuǎn)移封閉作用明顯增強。以上結(jié)果進一步證實了CoOOH納米片與AA之間產(chǎn)生了相互作用。

圖3 (A)AA、CoOOH納米片以及孵育之后的紫外-可見吸收光譜圖；(B)不同材料修飾電極的循環(huán)伏安圖；(C)CoOOH與0.4 mg /mL AA孵育前后的交流阻抗譜Fig.3 (A) UV-Vis absorption spectra of AA,CoOOH nanoflakes and after the reaction between them;(B) Cyclic voltammograms of different modified electrodes;(C) Electrochemical impedance spectroscopy characterization of CoOOH before and after incubation with 0.4 mg/mL AA

2.3 實驗可行性分析

如圖4A、4B所示，隨著AA濃度的增加，在10 min內(nèi)密閉反應(yīng)瓶中的氣壓和溫度變化都顯著降低，當(dāng)AA為400 μg/mL時，氣壓的變化量(ΔP)僅增加3.66 kPa，溫度變化(ΔT1)為0.5 ℃。同樣的，這種氣壓的降低導(dǎo)致在集水瓶中收集到水的量也進一步減少，如圖4C，排水瓶中溢出水的重量與AA的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，當(dāng)AA由50 μg/mL增加400 μg/mL時，水增重幅度(ΔW)從1.60 g減少到0.68 g。在圖4D中，在集水瓶中預(yù)裝的NaOH吸水溶解并放出熱量，當(dāng)AA由50 μg/mL增加到400 μg/mL時，升溫幅度(ΔT2)從8.1 ℃減小到5.8 ℃。這些結(jié)果表明，我們開發(fā)的綜合了壓力、溫度和質(zhì)量信號的傳感系統(tǒng)可成功的用于AA檢測。

圖4 (A)ΔP和(B)ΔT1信號對AA的響應(yīng)變化；(C)ΔW和(D)ΔT2信號對AA的響應(yīng)變化Fig.4 (A) ΔP and (B) ΔT1 variations in response to AA;(C) ΔW and(D) ΔT2 variations in response to AA

2.4 實驗條件優(yōu)化

2.4.1 CoOOH納米片和AA孵育時間圖5A為AA與CoOOH納米片孵育不同時間所對應(yīng)ΔP，在孵育時間5 min之內(nèi)，氣壓呈明顯的減小趨勢，在5 min之后，氣壓變化并不明顯，趨于平穩(wěn)。因此在整個實驗過程中選擇孵育時間為5 min。

圖5 AA與CoOOH納米片的反應(yīng)時間(A)、不同種類緩沖溶液(B)及緩沖溶液的不同pH值(C)對ΔP的影響Fig.5 Effect of reaction time between AA and COOOH nanosheets (A),of different buffer solutions (B) and of different pH values of buffer solution (C) on ΔP

2.4.2 緩沖溶液的選擇如圖5B所示，考察不同緩沖溶液中所對應(yīng)的氣壓響應(yīng)信號。選擇Na2HPO4-檸檬酸、KH2PO4-NaOH、Na2HPO-NaH2PO4緩沖體系時，ΔP變化并不明顯(ΔP<2 kPa)；而緩沖溶液為KCl、檸檬酸-NaOH、Tris-HCl時,ΔP變化較為明顯(ΔP>7 kPa)。其中，在Tris-HCl緩沖溶液中ΔP變化最為明顯，因此選擇Tris-HCl緩沖溶液。

2.4.3 緩沖溶液pH值緩沖溶液的pH值也是影響CoOOH納米片催化H2O2分解的關(guān)鍵因素之一。在圖5C中可以看到，Tris-HCl緩沖溶液的pH<10時，ΔP呈增大趨勢，當(dāng)Tris-HCl緩沖溶液的pH>10時，ΔP呈減小趨勢。因此選擇Tris-HCl緩沖溶液的pH為10。

2.5 基于多信號傳感平臺對AA的分析性能

在最優(yōu)的條件下，利用多信號傳感檢測平臺檢測AA的氣壓響應(yīng)信號。如圖6A所示，AA質(zhì)量濃度在12.5～400 μg/mL范圍內(nèi)，ΔP信號與AA濃度對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：ΔP=-0.87 IncAA+8.69，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9930。隨后，利用多信號傳感平臺檢測不同濃度AA對CoOOH催化H2O2體系溫度變化的影響，如圖6B所示，ΔT1響應(yīng)信號與目標(biāo)物AA呈現(xiàn)良好的正相關(guān)，線性方程為：ΔT1=-0.66lncAA+4.28，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9800。

圖6 ΔP(A)和ΔT1(B)檢測AA的校準(zhǔn)曲線Fig.6 Calibration curves of ΔP used to detect AA (A) and calibration curves of ΔT1 used to detect AA (B)

在最優(yōu)條件下，利用多信號傳感檢測平臺對AA的質(zhì)量響應(yīng)信號。如圖7A所示，AA在12.5～400 μg/mL范圍內(nèi)，隨著目標(biāo)物AA濃度的增大，溢出水的質(zhì)量逐漸減小，質(zhì)量信號與AA濃度的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：ΔW=-0.11lncAA+1.33，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9940。同時，對基于NaOH溶解放熱的溫度傳感信號進行了研究，如圖7B所示，ΔT2響應(yīng)信號與AA濃度的對數(shù)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：ΔT2=-1.28lncAA+13.46，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9950。

圖7 ΔW(A)和ΔT2(B)檢測AA校準(zhǔn)曲線Fig.7 Calibration curves of ΔW (A) and ΔT2 (B) used to detect AA

2.6 多信號傳感平臺的選擇性和穩(wěn)定性考察

考察了該傳感平臺對與AA的選擇性，干擾物質(zhì)包括金屬離子(Na+、K+、Ca2+)、陰離子(Cl-)、谷氨酸(Glu)、組氨酸(His)、生物小分子物質(zhì)(C6H12O6、NaClO和C6H5Na3O7)。如圖8A所示，只有在AA存在的情況下，可導(dǎo)致ΔP信號明顯下降，在相同條件下，10倍濃度的上述物質(zhì)未引起信號的明顯下降。因此多信號傳感平臺對AA的檢測具有良好的特異性和抗干擾性。

為考察平臺的穩(wěn)定性，在相同的條件下檢測7 d內(nèi)ΔP變化趨勢。在圖8B中明顯的看到在7 d內(nèi)，平臺的氣壓變化值較穩(wěn)定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值為2.42%，進一步說明我們所構(gòu)建的多信號檢測平臺在分析AA具有良好的穩(wěn)定性。

圖8 (A)特異性實驗結(jié)果(AA的濃度為25 ng/mL，其它干擾物質(zhì)的濃度為250 ng/mL)；(B)檢測平臺在7天內(nèi)的穩(wěn)定性測試結(jié)果Fig.8 (A) The specificity test results (the concentration of AA was 25 ng/mL and the concentration of other interfering substances was 250 ng/mL);(B) Stability test results of the test platform within 7 days

2.7 實際樣品測定

利用該傳感平臺對維C銀翹片實際樣品中AA進行檢測，進一步探究該方法的實用性并證明結(jié)果的可靠性，利用氣壓響應(yīng)信號分析，進行加標(biāo)回收實驗，獲得的回收率為85.4%～116.7%(表1)，RSD為0.3%～2.1%，表明本研究建立的基于多信號傳感檢測平臺檢測AA的方法可用于維C銀翹片的定量檢測。

表1 實際樣品中AA的測定

3 結(jié)論

利用AA對CoOOH納米片還原使其失去催化性質(zhì)機理，以CoOOH納米片對H2O2的分解從而引起氣壓、溫度和質(zhì)量多種信號的變化為檢測平臺，建立基于普通的手持式數(shù)字壓力表、智能數(shù)字溫度計和電子天平檢測AA的新方法。本方法操作簡單，便攜性好，經(jīng)濟且快速，可用于維C銀翹片中AA的檢測。本研究不僅綜合了氣壓、溫度和重量為一體檢測AA的新方法，也為便攜式AA檢測儀的開發(fā)提供了新思路。