張霖璋， 張定棋， 徐 瑩,2b， 楊海琳， 戚勝蘭， 張聰聰， 陳佳美, 劉 平, 劉 偉

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院， 肝病研究所， 肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué) a.交叉科學(xué)研究院， b.教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 上海 201203

肝纖維化是慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病與自身免疫性肝病等多種慢性肝病后期共有的病理變化[1]。肝纖維化是一種可逆的創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)，其特征是肝臟受到損傷后活化的肝星狀細(xì)胞(HSC)分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)[2]，但臨床上尚缺乏有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化的生物或化學(xué)藥物[3]。近年來有學(xué)者[4-7]研究發(fā)現(xiàn)中藥及復(fù)方在肝纖維化治療方面顯示了良好的臨床效果，如扶正化瘀膠囊/片、復(fù)方鱉甲軟肝片、安絡(luò)化纖丸以及下瘀血湯等。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究[8]表明蟲草菌絲具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗癌、保護(hù)肝腎等廣泛的藥理活性。課題組前期研究[9]發(fā)現(xiàn)蟲草菌絲對(duì)肝纖維化小鼠具有顯著改善作用，主要表現(xiàn)在能夠抑制HSC的活化、逆轉(zhuǎn)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞去分化等方面。Toll樣受體4(TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號(hào)主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，近年成為探究肝臟炎癥反應(yīng)機(jī)制的研究熱點(diǎn)[10-11]。已知血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)參與了人體多種的病理生理過程，如脂代謝、糖代謝、腫瘤發(fā)生及血管生成等[12]。課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蟲草菌絲顯著下調(diào)肝纖維化小鼠肝組織中ANGPTL4的表達(dá)，但是否調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路尚不清楚。因此，本研究擬通過探究蟲草菌絲對(duì)CCl4肝纖維化小鼠模型肝組織ANGPTL4表達(dá)及TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響，探討蟲草菌絲抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57/BL6J小鼠60只，SPF級(jí)，購(gòu)自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量(20±2)g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(滬)2012—0014，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK(滬)2021—0005。小鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境溫度(22±2)℃，日照時(shí)長(zhǎng)和黑暗時(shí)長(zhǎng)各12 h，所有小鼠均自由飲水進(jìn)食。

1.1.2 藥物與試劑 蟲草菌絲(江西國(guó)藥中藥飲片有限公司，批號(hào)17040268)；扶正化瘀方(上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司，批號(hào)190608)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、羥脯氨酸(HYP)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20200716、A030-1)；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、ANGPTL4抗體(Abcam公司，貨號(hào)ab32575、ab196746)；TLR4、CD163(Proteintech公司，貨號(hào)19811-1-AP、16646-1-AP)；NF-κB、P-NF-κB(Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)8242、3033)；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.1.3 主要儀器 CR21G型冷凍高速離心機(jī)(日本日立公司)，Eclipse TS100-F型熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，JK-6型生物組織攤烤片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)，Step One PlusTM型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo公司)，1-15K型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)，Odyssey掃描儀及雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-COR公司)。

1.2 動(dòng)物分組造模與藥物干預(yù) 60只C57/BL6J雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組10只和模型組50只。模型組小鼠按2 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射15% CCl4-橄欖油，每周一、三、五造模，造模6周；正常組小鼠按2 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射空白橄欖油。在第4周首日，將模型組小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組，蟲草菌絲低、中、高劑量組，扶正化瘀方組；每組10只。造模第4周首日開始給藥，蟲草菌絲低、中、高劑量組分別口服給予400、800、1600 mg/kg蟲草菌絲溶液，扶正化瘀方組口服給予2000 mg/kg扶正化瘀方溶液，以上藥物均以0.3%羧甲基纖維素鈉配制；正常組和模型組小鼠灌胃給予等體積0.3%羧甲基纖維素鈉。各組藥物干預(yù)均為1次/d，灌胃體積為10 mL/kg，連續(xù)3周。取材前禁食不禁水12 h，小鼠麻醉后取血和肝臟，處理后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清轉(zhuǎn)氨酶和TBil檢測(cè) 將血清樣本各取150 μL送至上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科處協(xié)助檢測(cè)，檢測(cè)ALT、AST活性和TBil水平。

1.3.2 肝臟病理染色 選取肝大葉最厚一塊，切取0.5cm×0.5cm×0.5cm肝組織1塊，置于10%中性甲醛緩沖溶液固定72h，常規(guī)脫水、包埋、切片，HE和SR染液染色，將封好的片子使用數(shù)據(jù)掃描切片機(jī)自動(dòng)掃描，并采用Image Analysis對(duì)SR染色陽(yáng)性面積進(jìn)行定量分析處理。

1.3.3 肝組織HYP含量 稱取(50±2)mg肝組織，使用堿水解法作肝組織中的HYP含量檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)操作步驟參照試劑盒說明書操作。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR) 稱取肝組織50 mg，加trizol 1 mL提取總RNA，具體操作步驟按說明書進(jìn)行，應(yīng)用NanoVue濃度檢測(cè)儀，檢測(cè)RNA濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得cDNA。取384 孔PCR板加樣，Real-time PCR法檢測(cè)對(duì)應(yīng)指標(biāo)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各mRNA表達(dá)量。

1.3.5 免疫組化檢測(cè)α-SMA、Col-Ⅰ、ANGPTL4蛋白表達(dá) 免疫組化操作參照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，α-SMA，1∶1000；Col-1，1∶800；ANGPTL4，1∶150，二抗1∶10 000，并采用Image Analysis對(duì)組織染色陽(yáng)性面積進(jìn)行定量分析。

1.3.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot) 稱取肝組織40～60 mg，加1 mL蛋白裂解液，4 ℃、65 Hz高速勻漿180 s，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min，抽取上清液800 μL置1.5 mL離心管，再次離心30 min，抽取上清液600 μL置1.5 mL離心管，按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書操作進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定并加上樣緩沖液。制膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育過夜、二抗室溫孵育1 h，α-SMA(1∶1000)，ANGPTL4(1∶1000)，NF-κB(1∶1000)，P-NF-κB(1∶1000)、TLR4(1∶1000)，CD163(1∶1000)，GAPDH(1∶5000)，二抗(1∶10 000)。掃描目的條帶，并與GAPDH條帶對(duì)比分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)CCl4肝纖維化小鼠血清肝功能的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清ALT、AST、TBil均顯著升高(P值均<0.01)；與模型組比較，蟲草菌絲低劑量組血清AST下降明顯(P<0.05)，中劑量組血清AST和高劑量組血清ALT、AST均下降明顯(P值均<0.01)，高劑量組血清TBil下降明顯(P<0.05)，扶正化瘀方組血清ALT、AST下降明顯(P值均<0.01)(表2)。

表2 各組小鼠血清生化結(jié)果比較

2.2 對(duì)CCl4肝纖維化小鼠肝組織病理學(xué)及HYP含量的影響 肝組織病理染色結(jié)果見圖1。HE染色結(jié)果顯示，正常組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，可見存在大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；各藥物組均有不同程度改善，其中以蟲草菌絲高劑量組改善效果最為顯著。SR染色結(jié)果顯示，正常組小鼠僅在匯管區(qū)可見少量膠原纖維；模型組小鼠肝組織以匯管區(qū)為中心出現(xiàn)大量膠原沉積；與模型組相比，各藥物組膠原沉積均有不同程度地減少，其中以蟲草菌絲高劑量組的效果最為顯著。HYP和SR半定量結(jié)果見表3。與正常組相比，模型組HYP含量顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，蟲草菌絲高劑量組和扶正化瘀方組HYP含量均顯著下降(P值均<0.05)。SR半定量結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠肝組織膠原面積顯著增加(P<0.01)；蟲草菌絲中、高劑量組和扶正化瘀方組膠原面積較模型組均顯著下降(P值均<0.05)。

表3 HYP含量和SR陽(yáng)染面積

2.3 對(duì)CCl4肝纖維化小鼠α-SMA和Col-Ⅰ表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果見圖2。正常組于匯管區(qū)少量表達(dá)α-SMA；半定量結(jié)果顯示，模型組較正常組α-SMA表達(dá)明顯增多(P<0.01)(表4)；蟲草菌絲高劑量組改善效果最佳(P<0.05)(表4)，可見纖維間隔帶明顯變窄。正常組小鼠肝組織內(nèi)Col-Ⅰ少量表達(dá)于小靜脈壁，半定量結(jié)果示模型組較正常組Col-Ⅰ表達(dá)明顯增多(P<0.01)(表4)，可見大量膠原纖維表達(dá)于肝竇壁和纖維間隔，與模型組相比，蟲草菌絲不同劑量組肝組織內(nèi)膠原表達(dá)顯著減輕，半定量結(jié)果顯示蟲草菌絲高劑量組效果最佳(P<0.05)(表4)，肝組織膠原沉積明顯減少。

Real-time PCR結(jié)果見表5，與正常組相比，模型組小鼠肝組織α-SMA、Col-Ⅰ mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P值均<0.01)；蟲草菌絲中、高劑量組下降效果最為顯著(P值均<0.05)。

表5 α-SMA和Col-Ⅰ mRNA表達(dá)

Western Blot結(jié)果見圖3，與正常組相比，模型組小鼠肝組織α-SMA蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，蟲草菌絲高劑量組和扶正化瘀方組改善效果最為顯著(P值均<0.05)(表6)。

表6 α-SMA蛋白表達(dá)

2.4 對(duì)CCl4肝纖維化小鼠ANGPTL4及TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 免疫組化結(jié)果見圖4。正常組小鼠肝組織內(nèi)ANGPTL4少量表達(dá)于肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞周圍。半定量結(jié)果顯示，模型組較正常組ANGPTL4表達(dá)明顯增多(P<0.05)，主要表達(dá)在匯管區(qū)和膽管細(xì)胞周圍；蟲草菌絲高劑量組改善效果最佳(P<0.05)(表7)。

表7 ANGPTL4免疫組化陽(yáng)染面積

注：N，正常組；M，模型組；CS(400 mg/kg)，蟲草菌絲低劑量組；CS(800 mg/kg)，蟲草菌絲中劑量組；CS(1600 mg/kg)，蟲草菌絲高劑量組；FZGY(2000 mg/kg)，扶正化瘀方組。箭頭所示為ANGPTL4蛋白的表達(dá)。

注：CS，蟲草菌絲；FZHY，扶正化瘀方。

Western Blot結(jié)果見圖5。與正常組相比，模型組小鼠肝組織ANGPTL4、TLR4蛋白均顯著升高(P值均<0.05)，P-NF-κB/NF-κB、CD163蛋白均明顯升高(P值均<0.01)；與模型組相比，高劑量組ANGPTL4、TLR4、P-NF-κB/NF-κB和CD163改善效果最為顯著(P值均<0.05)，扶正化瘀方組ANGPTL4改善效果明顯(P<0.05)(表8)。

表8 ANGPTL4、TLR4、P-NF-κB、NF-κB、CD163蛋白表達(dá)

3 討論

肝纖維化是以活化的HSC分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)、膠原表達(dá)增多及過度沉積為特征，被認(rèn)為是肝硬化和肝癌進(jìn)展的關(guān)鍵因素[13]。盡管在過去的幾十年里，肝纖維化的發(fā)病機(jī)制得到了廣泛的研究，但目前還沒有有效的化學(xué)與生物藥物。本研究結(jié)果表明，蟲草菌絲能夠顯著改善CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝組織的纖維化程度、血清肝功能異常，顯著減少α-SMA和Col-Ⅰ等纖維化指標(biāo)的mRNA和蛋白的表達(dá)，顯著減少ANGPTL4、TLR4、P-NF-κB/NF-κB和CD163蛋白的表達(dá)。

注：CS，蟲草菌絲；FZHY，扶正化瘀方。

ANGPTL4屬于血管生成素樣蛋白家族的一員，全長(zhǎng)ANGPTL4(fANGPTL4)蛋白含一個(gè)nANGPTL4結(jié)構(gòu)域和一個(gè)cANGPTL4結(jié)構(gòu)域，肝臟能產(chǎn)生nANGPTL4片段[14]。肝臟是人體內(nèi)脂肪代謝的場(chǎng)所，它在維持血糖穩(wěn)定和正常脂質(zhì)代謝中起著關(guān)鍵作用，肝臟功能障礙容易引起血糖和脂質(zhì)代謝紊亂[15-16]。特異性地敲除ANGPTL4基因可以改善小鼠模型中因飲食引起的肥胖、葡萄糖不耐受和肝臟脂肪變性等問題[17]。最新研究[18]發(fā)現(xiàn)ANGPTL4在肝硬化患者和HBV誘導(dǎo)的肝損傷細(xì)胞模型中明顯上調(diào)，向肝硬化模型小鼠的尾靜脈注射sh-ANGPTL4慢病毒載體，發(fā)現(xiàn)干擾ANGPTL4的表達(dá)可以抑制HSC的活化，減少α-SMA、Col-Ⅰ、TLR4、NF-κB和CD163的mRNA和蛋白的表達(dá)，提示ANGPTL4通過TLR4/NF-κB通路調(diào)節(jié)CD163表達(dá)來改善Kupffer細(xì)胞極化誘導(dǎo)的肝硬化。ANGPTL4在本實(shí)驗(yàn)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中顯著升高，這和文獻(xiàn)報(bào)道的在肝硬化模型中升高相一致，并且高劑量組蟲草菌絲能夠顯著降低ANGPTL4的表達(dá)。

在纖維化肝臟中，巨噬細(xì)胞對(duì)肝纖維化的影響主要通過細(xì)胞因子旁分泌影響HSC的活化[19]，進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展[20]。CD163是一種M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，過往研究表明CD163是一種抗炎分子，在促炎因子的刺激下會(huì)受到抑制。但有文獻(xiàn)[21]報(bào)道在缺血損傷后的肝再生組織區(qū)域中會(huì)發(fā)現(xiàn)大量CD163高表達(dá)的巨噬細(xì)胞。同時(shí)既往研究[17]發(fā)現(xiàn)ANGPTL4是巨噬細(xì)胞的一個(gè)重要調(diào)控因子，能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化和造血干細(xì)胞的激活，并促進(jìn)肝硬化的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CCl4肝纖維化模型小鼠中CD163蛋白表達(dá)顯著升高，這也提示CD163蛋白不僅是一種抗炎分子，同樣也會(huì)在促炎因子的刺激下高表達(dá)。

TLR4/NF-κB信號(hào)通路是肝臟疾病反應(yīng)的關(guān)鍵通路，它廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中，是介導(dǎo)炎癥因子和細(xì)胞之間相互作用的重要信號(hào)途徑之一[22-23]。同時(shí)TLR4也可以通過與下游MyD88信號(hào)分子結(jié)合，來快速激活NF-κB炎癥分子，從而上調(diào)包括Col-Ⅰ等在內(nèi)的促纖維化細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而促進(jìn)纖維化的進(jìn)程[24-25]。除能調(diào)節(jié)肝纖維化疾病進(jìn)展外，還有報(bào)道[26]表明TLR4/NF-κB信號(hào)通路在肝臟免疫功能紊亂、HSC的激活和肝癌的進(jìn)展等機(jī)制方面發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)蟲草菌絲能夠顯著減少肝臟膠原沉積，并且能劑量依賴性地降低肝臟α-SMA和Col-Ⅰ的表達(dá)以及TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)的蛋白表達(dá)。因此抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路可能是緩解肝纖維化進(jìn)展的有效途徑之一。

綜上所述，蟲草菌絲對(duì)CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化具有顯著的治療作用，其可能通過降低ANGPTL4的表達(dá)來下調(diào)CD163表達(dá)，進(jìn)而抑制肝纖維化進(jìn)程，這可能主要是通過調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021年1月15日通過上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，倫理編號(hào)PZSHUTCM210115005，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：張霖璋負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；張定棋、徐瑩、楊海琳、戚勝蘭、張聰聰、陳佳美參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；劉平、劉偉負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。