楊廣越， 陶 樂(lè)， 張 瑋， 劉旭凌， 馬文婷， 吳 柳， 孫田甜， 姜 浩， 劉 成,

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院 a.肝病實(shí)驗(yàn)室， b.感染科， c.實(shí)驗(yàn)中心， 上海 200062

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發(fā)病過(guò)程中由單純性脂肪肝發(fā)展至肝纖維化的重要中間階段。NASH患者易發(fā)生肝纖維化、肝癌。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)中醫(yī)藥[1]及其有效成分[2]干預(yù)NASH進(jìn)行大量研究，但缺乏臨床有效治療NASH藥物，因此開(kāi)展NASH研究具有重要的意義。

下瘀血湯出自東漢張仲景的《金匱要略》，由大黃、桃仁和土鱉蟲(chóng)三味中藥組成，是抗肝纖維化經(jīng)典方劑，前期本研究組發(fā)現(xiàn)下瘀血湯可顯著抑制四氯化碳[3]、膽管結(jié)扎導(dǎo)致的肝纖維化[4]，對(duì)膽堿蛋氨酸缺乏[5]和高脂[6]誘導(dǎo)的小鼠NASH具有顯著抑制作用。已有研究表明中藥大黃[7]、桃仁或組分配伍抑制纖維生成[8]作用明確、成分清晰。而土鱉蟲(chóng)對(duì)膽堿缺乏(choline deficient amino acid-defined,CDAA)誘導(dǎo)的NASH中有何作用，尚未研究。

黏結(jié)合蛋白聚糖3(syndecan 3，SDC3)是一種細(xì)胞表面乙酰硫酸肝素鹽蛋白聚糖，與細(xì)胞間黏附、生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)能量平衡有關(guān)[9]。研究[10]表明SDC3在飲食誘導(dǎo)的肥胖中具有重要調(diào)節(jié)作用。但SDC3在CDAA的模型中致纖維生成作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立CDAA誘導(dǎo)的小鼠NASH模型，探討土鱉蟲(chóng)對(duì)CDAA所致的NASH干預(yù)作用，進(jìn)一步以SDC3為切入點(diǎn)，研究探討土鱉蟲(chóng)抑制NASH作用機(jī)制，以期為土鱉蟲(chóng)治療NASH提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量20 g左右；購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(滬)2019-0006。所有小鼠均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：SYXK(滬)2019-0020。飼養(yǎng)室溫度(22±1)℃ ，相對(duì)濕度30%～60%，12 h光照/12 h黑暗，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2 藥物與試劑 土鱉蟲(chóng)參照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，采用道地藥材，生藥學(xué)專家鑒定。制備流程：土鱉蟲(chóng)2.4 g，粗粉末；加20%乙醇8倍量，浸泡1 h，回流提取2次，第1次加20%乙醇回流提取30 min，濾過(guò)取汁；藥渣再加6倍量的20%乙醇回流提取1 h，濾過(guò)取汁，合并2次提取液，減壓回收溶劑至干獲得土鱉蟲(chóng)浸膏粉。土鱉蟲(chóng)2.4 kg，干燥后重量為0.525 kg，每克提取物浸膏粉相當(dāng)于生藥4.57 g。統(tǒng)一由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑中心一次制備后冷凍干燥保存。

主要試劑：ALT(C009-2-1)、AST(C010-2-1)、TG(P001)、TC(P002)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司； Trizol(9109)、High-Capacity cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A)及SYBR 熒光染料(RR420)均購(gòu)自TaKaRa公司；天狼星紅染液由上海中醫(yī)藥大學(xué)劉平教授課題組饋贈(zèng)，油紅購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(20161128)。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司(23227)。DAB購(gòu)自北京中杉金橋(批號(hào)：ZLI-9018)；引物[轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFβ1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、Ⅰ型膠原(Col1α1)、SDC3]購(gòu)自上海生工(表1)。免疫組化SDC3(ab191308)抗體、α-SMA(ab5694)抗體購(gòu)自Abcam公司，免疫印跡用SDC3抗體(10886-1-AP)購(gòu)自Proteintech公司，β-Actin抗體(ab8226)購(gòu)自Abcam公司。SABC免疫組化試劑盒(PK-6100)購(gòu)自Vector公司；EZ-ECL pico化學(xué)發(fā)光液(AP34L025-A)購(gòu)自上海李記生物科技有限公司；CDAA飼料(TP3014)和對(duì)照膽堿充足(choline sufficient amino acid-defined, CSAA)飼料(TP3014C)購(gòu)自南通特洛菲飼料科技有限公司。Procll(40501ES60)購(gòu)自翊圣生物科技有限公司；D-Hanks(PYG0075)購(gòu)自博士德生物公司；Nycodenz(1002424)購(gòu)自Alere Technologies公司；鏈霉蛋白酶(9036-06-0)購(gòu)自Roche公司；DNA酶(DN25-1G)、膠原酶(V900893-1G)購(gòu)自Sigma公司；MEM(SH30024.01)、1640(SH30809.01)購(gòu)自Cytiva公司。

表1 RT-PCR引物序列

1.1.3 細(xì)胞 人原代肝星狀細(xì)胞(HSC，5300)、原代肝細(xì)胞(Hepato，5200)、肝臟Kupffer細(xì)胞(5340)和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC，5000)均購(gòu)自美國(guó)ScienCell Research Laboratories；LX2細(xì)胞 (SCC640) 購(gòu)自德國(guó)Merck公司；小鼠肝細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室分離[11]。

1.2 研究方法

1.2.1 分組、造模和給藥 將18只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為CSAA飼料喂養(yǎng)(CSAA組，n=6)、CDAA飼料喂養(yǎng)(CDAA組，n=6)和CDAA飼料+土鱉蟲(chóng)喂養(yǎng)(CDAA+T組，n=6)3組。造模第12周開(kāi)始，CDAA+T組小鼠給予0.108 g/kg土鱉蟲(chóng)灌胃，每日1次。CSAA、CDAA組以相應(yīng)劑量的生理鹽水灌胃。

1.2.2 小鼠取材 造模結(jié)束后以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，下腔靜脈取血，摘取肝組織，切取一葉冰凍，一葉用10%中性福爾馬林固定后用于組織學(xué)觀察，其余液氮凍存后-80 ℃保存?zhèn)溆?，提取總RNA及蛋白。

1.2.3 血清學(xué)及肝組織指標(biāo)檢測(cè) 血液樣本于室溫靜置1 h，3000 r/min離心10 min，取血清。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)小鼠血清ALT、AST、TC、TG及肝組織TC、TG水平。

1.2.4 肝組織病理學(xué)觀察 組織處理方法、天狼星紅染色、油紅染色及免疫組化方法詳見(jiàn)本課題組前期已發(fā)表文章[5,12-13]。HE染色觀察組織學(xué)損傷。由本院兩位病理科醫(yī)師盲法閱片計(jì)算NAS評(píng)分以評(píng)判造模是否成功[14]。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR) Trizol法提取肝臟RNA，測(cè)RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄：按Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 15 min。擴(kuò)增：取cDNA 3 μL 加SYBR Green 5 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ddH2O 1.2 μL，制成10 μL體系，反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 min預(yù)變性，95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 30 s退火，40個(gè)循環(huán)，60 ℃ 1 min延伸。PCR結(jié)束采用2-ΔΔct法分析計(jì)算目的基因表達(dá)。

1.2.6 免疫印跡 Western Blot檢測(cè)SDC3蛋白表達(dá)。將肝組織加入預(yù)冷的RIPA(含蛋白酶抑制劑)勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min。蛋白定量后10%SDS-PAGE電泳，100 V轉(zhuǎn)移1 h至PVDF膜，封閉1 h；一抗SDC3 4 ℃過(guò)夜，二抗室溫孵育60 min，ECL顯影，采用Image J分析灰度值。

1.2.7 小鼠原代細(xì)胞分離 HSC分離方法：小鼠麻醉仰臥位固定，解剖暴露門(mén)靜脈及下腔靜脈，24G留置針插入門(mén)靜脈固定，前灌流液(約30 mL)充分灌注后；更換為鏈霉蛋白酶(約30 mL)灌注約5 min，再更換為Ⅳ型膠原酶溶液灌注約5 min；灌流完畢后取肝臟(呈膿包狀)至培養(yǎng)皿，眼科鑷剔除肝包膜，移入分散液，37 ℃消化15 min，用70 μm孔徑的濾網(wǎng)過(guò)濾肝組織懸液，加入1%FBS 2 mL終止消化。細(xì)胞懸液在37 ℃、1700 r/min離心5 min，取沉淀；加入30 mL無(wú)血清GBSS/B懸混勻后再次離心，加入10 mL MEM培養(yǎng)基、1.5 mL DNA酶Ⅰ、8.5 mL 28.7%密度梯度分散液(Nycodenz)混勻成細(xì)胞懸液，緩慢鋪10 mL GBSS/A，24 ℃ 2951 r/min離心22 min，取中間白膜層，加入MEM，1700 r/min離心5min重復(fù)2次，PBS洗細(xì)胞，細(xì)胞重懸加入20%FBS的DMEM培養(yǎng)。

Kupffer細(xì)胞分離方法：溶液配制、肝臟灌流、消化、振蕩分散、過(guò)濾、洗滌離心等過(guò)程均同HSC分離方法。梯度離心：洗滌后的細(xì)胞懸液分成2管，分別加入1/1體積和1/2體積的33%Nycodenz，使Nycodenz終濃度分別為16.5%和11%，然后按16.5%Nycodenz、11%Nycodenz和MEM順序緩慢鋪加于離心管中，10 ℃ 2900 r/min 離心20 min。取白色的細(xì)胞層，以含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，接種細(xì)胞，孵育30 min，洗除未貼壁的細(xì)胞，貼壁為Kupffer細(xì)胞。

LSEC分離方法：從門(mén)靜脈灌注37 °C預(yù)溫的D-Hanks(不含Ca2+)，灌流至肝臟顏色為棕白色。灌流預(yù)溫的膠原酶A，消化結(jié)締組織成分。20～25 min灌流結(jié)束取肝臟。PBS洗2次，去除肝包膜和血管。置于膠原酶B，水浴振蕩器消化、過(guò)濾。細(xì)胞懸液以775 r/min，5 min離心去除肝細(xì)胞。取上清，1450 r/min離心10 min，棄上清，重復(fù)2次后PBS重懸細(xì)胞，吸取3 mL細(xì)胞懸液緩慢加入到Percoll離心液中，2325 r/min離心20 min。收集含LSEC的中間層，用PBS重懸細(xì)胞，2325 r/min離心10 min。細(xì)胞團(tuán)塊用含20%FBS的1640培養(yǎng)基重懸。24 h后更換培養(yǎng)基。

肝細(xì)胞分離方法：前灌流液沖洗肝臟，待肝臟變?yōu)樽匕咨螅嗔黝A(yù)溫的Ⅳ型膠原酶溶液，約10 min后停止灌流?？焖僬赂闻K，置于預(yù)冷的 MEM 中，剪碎后的細(xì)胞懸液用細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾至50 mL離心管中，500 r/min離心1 min 。重復(fù)3次后，第3次將2管并入1管，500 r/min離心3 min，棄上清，用含20%FBS的培養(yǎng)液重懸，接種于培養(yǎng)皿中。

1.2.8 細(xì)胞培養(yǎng) 土鱉蟲(chóng)處理細(xì)胞參照本課題組既往發(fā)表文獻(xiàn)[3]。轉(zhuǎn)染siRNA：細(xì)胞饑餓處理6 h，配制Opti-MEM+LTX+si-RNA質(zhì)粒(終濃度100 pmol)混合液。靜置20 min后將混合液加到培養(yǎng)皿中，處理6 h后換成DMEM-10%胎牛血清+1%雙抗培養(yǎng)液，培養(yǎng)細(xì)胞48 h后處理。TGFβ使用終濃度為5 ng/mL。

2 結(jié)果

2.1 土鱉蟲(chóng)有效治療CDAA誘導(dǎo)的NASH 與CSAA組相比，CDAA組小鼠血清肝功能(ALT、AST)、血脂(TC、TG)及肝組織TC、TG水平均顯著升高(P值均<0.01)；而CDAA+T組與CDAA組相比小鼠血清ALT、AST、TC、TG及肝組織TC、TG均顯著降低(P值均<0.05)(表2)。

HE染色結(jié)果顯示：CSAA組肝細(xì)胞索從中央靜脈呈放射狀排列，CDAA組肝小葉間炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，土鱉蟲(chóng)可顯著抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，CDAA+T組肝臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較CDAA組明顯減少(圖1a)。CDAA組NAS評(píng)分>4，顯著高于CSAA組，CDAA+T組NAS評(píng)分較CDAA組明顯降低(P值均<0.05)(表2)。

油紅染色結(jié)果顯示：與CSAA組相比，CDAA組可見(jiàn)大量紅色脂滴填充，排列緊密，脂肪沉積明顯；CDAA+T組脂滴明顯減少，脂肪沉積顯著減少(圖1b)。與CSAA組相比，CDAA組油紅染色陽(yáng)性面積顯著增加，CDAA+T組較CDAA組顯著減少(P值均<0.05)(表2)。

天狼星紅染色結(jié)果顯示：CSAA組小鼠肝組織僅在匯管區(qū)和中央靜脈壁可見(jiàn)少量膠原纖維，CDAA組小鼠肝組織可見(jiàn)大量增生的膠原纖維；CDAA+T組小鼠肝組織纖維顯著減少(圖1c)。與CSAA組相比，CDAA組天狼星紅面積顯著增加，CDAA+T組較CDAA組顯著減少(P值均<0.05)(表2)。

表2 各組肝功能、血脂、肝臟脂肪表達(dá)及病理學(xué)改變

RT-PCR結(jié)果顯示：與CSAA組相比，CDAA組TGFβ、Col1α1的mRNA表達(dá)顯著升高；與CDAA組相比，CDAA+T組TGFβ、Col1α1的mRNA表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)(表3)。

免疫組化結(jié)果顯示：CSAA組α-SMA僅在匯管區(qū)有少量分布，CDAA組在膠原纖維增生處可見(jiàn)α-SMA大量表達(dá)，比CSAA組顯著增多，顏色呈棕褐色；與CDAA組相比，CDAA+T組α-SMA表達(dá)則顯著減少(P值均<0.05)(圖2，表3)。

表3 纖維化指標(biāo)和SDC3在CDAA模型中表達(dá)

2.2 SDC3 mRNA表達(dá)情況 為明確SDC3是否在肝纖維化中發(fā)揮作用，本研究檢測(cè)了肝臟各類細(xì)胞中(HSC、Hepato、LSEC和Kupffer細(xì)胞)SDC3的表達(dá)，結(jié)果表明，SDC3在HSC中的表達(dá)最高(表4)。

注：a，HE染色(×200)；b，油紅染色(×400)；c，天狼星紅染色(×100)。

注：紅色箭頭表示α-SMA陽(yáng)性(×400)。

表4 SDC3在肝臟各類細(xì)胞中表達(dá)

2.3 土鱉蟲(chóng)調(diào)控CDAA模型中SDC3抗肝纖維化 與CSAA組相比，CDAA組α-SMA、SDC3 mRNA水平顯著升高(P值均<0.001)，且SDC3與α-SMA兩者的表達(dá)呈顯著性正相關(guān)(P<0.001)；經(jīng)土鱉蟲(chóng)干預(yù)后的CDAA中(CDAA+T組)SDC3 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.001)(圖3)。進(jìn)一步免疫組化發(fā)現(xiàn)，CDAA組SDC3主要分布于炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)和肝竇區(qū)；與CDAA組相比，CDAA+T組SDC3的表達(dá)顯著減少(圖4，表3)。免疫印跡結(jié)果顯示，與CSAA組相比，CDAA組SDC3蛋白表達(dá)明顯增多，土鱉蟲(chóng)干預(yù)后SDC3表達(dá)顯著減少(圖5，表3)。

圖3 α-SMA 與SDC3 mRNA表達(dá)及其相關(guān)性

注：a，×200；b, 上圖方框內(nèi)的放大(×400)，紅色箭頭表示SDC3陽(yáng)性。

圖5 SDC3在CDAA模型中的蛋白表達(dá)

2.4 土鱉蟲(chóng)調(diào)控HSC中SDC3表達(dá)發(fā)揮抗肝纖維化作用 為驗(yàn)證SDC3在肝纖維化中的作用及土鱉蟲(chóng)的干預(yù)效應(yīng)，采用培養(yǎng)LX2細(xì)胞，基因沉默SDC3后，土鱉蟲(chóng)(60 ng/mL)提前1 h干預(yù)，后用TGFβ(5 ng/mL)處理48 h。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Si-NC-PBS-TGFβ組相比，土鱉蟲(chóng)干預(yù)后，α-SMA、Col1α1 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P值均<0.001)；基因沉默SDC3后，與Si-NC-PBS-TGFβ組相比，Si-SDC3-PBS-TGFβ組的α-SMA、Col1α1 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P值均<0.001)；與Si-NC-PBS-TGFβ組相比，Si-SDC3-T-TGFβ組α-SMA、Col1α1 mRNA表達(dá)水平未見(jiàn)顯著降低(P值均>0.05)(表5)。

表5 土鱉蟲(chóng)提取物抑制TGFβ誘導(dǎo)的LX2纖維化

3 討論

NASH是NAFLD的一種嚴(yán)重類型[15]，是除酒精及明確的肝損傷等其他因素引起的以肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和變性、炎癥反應(yīng)、不同程度纖維化為特征的臨床綜合征[16]。近年來(lái)生活習(xí)慣的改變誘發(fā)的NASH發(fā)病率逐年迅速攀升，若控制不佳會(huì)進(jìn)一步引發(fā)肝纖維化、肝硬化及肝細(xì)胞癌等[17]。有研究[18-19]表明，在CDAA誘導(dǎo)的NASH中，由于CDAA導(dǎo)致肝臟磷脂合成減少，TG肝輸出減少，在肝臟累積，引起脂肪變性；膽堿進(jìn)一步缺乏，引起肝細(xì)胞膜及線粒體膜等損傷，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，引起肝組織炎癥和纖維化。NASH的病理原因復(fù)雜，臨床也少有有效的治療NASH藥物，因此進(jìn)一步探究NASH發(fā)病的分子機(jī)制，尋找有效治療NASH藥物是臨床急需解決的關(guān)鍵問(wèn)題[20]。

下瘀血湯由大黃、桃仁和土鱉蟲(chóng)三味中藥組成。方中土鱉蟲(chóng)為鱉蠊科昆蟲(chóng)地鱉或冀地鱉的雌蟲(chóng)干燥體，味咸、性寒，歸肝經(jīng)，具有破血逐瘀之效。研究[21]表明土鱉蟲(chóng)具有抗凝血和調(diào)節(jié)血脂等作用。本研究中土鱉蟲(chóng)改善CDAA誘導(dǎo)的肝功能、血脂和肝臟脂肪，減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞外基質(zhì)形成，減少脂肪沉積，表明土鱉蟲(chóng)可抑制CDAA誘導(dǎo)NASH形成?；蛩缴?，土鱉蟲(chóng)能有效抑制α-SMA、Col1α1、TGFβ mRNA表達(dá)。細(xì)胞水平上，土鱉蟲(chóng)干預(yù)后能顯著降低TGFβ誘導(dǎo)的α-SMA、Col1α1 mRNA表達(dá)，提示土鱉蟲(chóng)能有效改善纖維生成。這為單味中藥土鱉蟲(chóng)改善NASH提供了理論依據(jù)。

SDC是一類在成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞質(zhì)膜的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，家族有4個(gè)成員。SDC3在海馬區(qū)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的功能[9]。本研究表明，在小鼠NASH模型中，PCR顯示CDAA組SDC3 mRNA表達(dá)顯著升高，并與HSC活化指標(biāo)α-SMA呈正相關(guān)，而土鱉蟲(chóng)組則顯著降低，提示土鱉蟲(chóng)抑制纖維生成作用可能通過(guò)SDC3實(shí)現(xiàn)的。進(jìn)一步結(jié)果顯示：在人和小鼠肝臟的各種細(xì)胞中，SDC3在HSC細(xì)胞的表達(dá)最高。TGFβ可誘導(dǎo)HSC的SDC3和纖維化指標(biāo)表達(dá)顯著升高，土鱉蟲(chóng)可顯著抑制TGFβ誘導(dǎo)HSC活化和纖維化的表達(dá)，基因沉默SDC3后土鱉蟲(chóng)不能有效抑制HSC活化，提示土鱉蟲(chóng)抑制HSC活化和纖維生成是通過(guò)調(diào)控SDC3實(shí)現(xiàn)的。總之，土鱉蟲(chóng)可改善CDAA誘導(dǎo)的NASH形成，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控HSC細(xì)胞SDC3表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，土鱉蟲(chóng)抑制NASH形成的具體物質(zhì)基礎(chǔ)和更深層次機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2016年3月8日經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：PTEC-A-2016-4(G)-1。符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：楊廣越負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫(xiě)論文；張瑋、劉旭凌、孫田甜、姜浩參與實(shí)驗(yàn)操作及數(shù)據(jù)分析；陶樂(lè)、馬文婷、吳柳參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；劉成負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。