段松冷韋元元顧紅燕劉俊麗田佳懿劉敏孫路路*

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院藥學(xué)部，北京100038； 2.臨床合理用藥生物特征譜學(xué)評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100038； 3.臨床合理用藥生物特征譜學(xué)評(píng)價(jià)國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京100038）

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院自制中藥制劑祛白片（原名白癜風(fēng)片）是由蒺藜（炒）、制何首烏、黑芝麻（炒）、補(bǔ)骨脂、女貞子、北沙參、決明子、香櫞、赤芍、丹參、桃仁（炒）、紅花、獨(dú)活、蒼術(shù)（炒）、白芷組成的復(fù)方制劑，具有滋補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)的功效，可用于治療肝郁腎虧、血虛瘀阻、皮失所養(yǎng)之白癜風(fēng)，其臨床療效穩(wěn)定可靠，受到患者廣泛好評(píng)［1-2］。為實(shí)現(xiàn)祛白片制劑成果轉(zhuǎn)化，本研究從其特征圖譜入手建立了祛白片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并考察了全方藥效學(xué)。顧紅燕等［3-4］研究祛白片對(duì)實(shí)驗(yàn)性白癜風(fēng)模型的作用機(jī)制，證實(shí)了祛白片的抗白癜風(fēng)作用，并確定藥效與促進(jìn)黑色素形成相關(guān)。因祛白片制備工藝為水煎煮，提取過(guò)程中全方藥材揮發(fā)油幾乎完全流失。因此，為最大限度地保留處方飲片所有可能的有效成分，進(jìn)一步提高療效，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取祛白片揮發(fā)油，GC-MS 聯(lián)用技術(shù)分離鑒定其成分，并用CCK-8 法檢測(cè)祛白片揮發(fā)油對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16 的細(xì)胞生長(zhǎng)、促細(xì)胞活力、黑色素合成、酪氨酸酶活性的影響［4］，以期為優(yōu)化祛白片工藝規(guī)程，進(jìn)一步提高療效提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Trace 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo Finnigan公司）；MCO-15AC 型CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司）；COIC XDS-1B 型顯微鏡（重慶重光實(shí)業(yè)有限公司）；RTTDL-40B 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；YT-CJ-1ND 型無(wú)菌操作臺(tái)（北京亞泰科隆儀器科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 蒺藜（炒）、制何首烏、黑芝麻（炒）、補(bǔ)骨脂、女貞子、北沙參、決明子、香櫞、赤芍、丹參、桃仁（炒）、紅花、獨(dú)活、蒼術(shù)（炒）、白芷飲片均購(gòu)自北京金崇光藥業(yè)有限公司，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院孫路路主任藥師鑒定為正品。8-甲氧補(bǔ)骨脂素（8-MOP，批號(hào)M3501-1，純度98%）、過(guò)氧化氫（H2O2，批號(hào)H1009-100 mL）均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.3 細(xì)胞 小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16（編號(hào)3111C0001CCC000324），購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 GC-MS 分析

2.1.1 揮發(fā)油制備 按1 劑祛白片處方量的10%稱(chēng)取所需飲片，按2020 年版《中國(guó)藥典》 四部2204 揮發(fā)油測(cè)定法［5-6］，加熱處方并保持微沸5 h 至揮發(fā)油提取器中油量不再增加，即得（性狀為黃色油狀物）。

2.1.2 分 析條件 B-5MS 色譜柱（0.25 mm× 30 m，0.25 μm）；程序升溫（初始溫度50 ℃，保持3 min；5 ℃／min升至250 ℃，保持10 min）；載氣高純氦氣；體積流量1.0 mL／min ；進(jìn)樣量0.5 μL；氣化溫度270 ℃；分流進(jìn)樣，分流比20∶ 1。EI 離子源70 eV；離子源溫度200 ℃；全掃描采集模式，質(zhì)量范圍m／z35～450。

2.1.3 結(jié)果分析 采用NIST 譜庫(kù)檢索，結(jié)合保留時(shí)間確認(rèn)化學(xué)成分，按峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算［7-8］。如圖1、表1 所示，揮發(fā)油水蒸氣蒸餾法提取率為0.169 0%，從祛白片揮發(fā)油中分離出的66 個(gè)峰，確定了53 個(gè)化合物，占揮發(fā)油的64.30%。

表1 揮發(fā)油成分GC-MS 分析結(jié)果

圖1 揮發(fā)油GC-MS圖

2.2 藥效學(xué)研究

2.2.1 模型建立 參考文獻(xiàn)［9］報(bào)道制備B16 細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，培養(yǎng)液（10%FBS、DMEM、1%P／S）稀釋細(xì)胞，24、96 孔板鋪板，每孔均10 000 個(gè)細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后更換含0.1 mmol／L H2O2的培養(yǎng)液，與細(xì)胞共同孵育4 h 后吸棄培養(yǎng)基，即得脫黑色素細(xì)胞，DMEM 清洗1次，更換含不同藥物的培養(yǎng)液。

2.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察 將細(xì)胞分為模型組、溶劑組、8-MOP 組（10、25、50、100、500 μmol／L）、祛白片揮發(fā)油組（0、1∶30 000、1∶20 000、1∶16 000、1∶10 000、1∶8 000），模型組細(xì)胞造模后同步加入相同體積的培養(yǎng)基，后續(xù)與實(shí)驗(yàn)組平行；由于揮發(fā)油及8-MOP 均是以DMSO 配制所得，故設(shè)溶劑組，原液稀釋1 000倍，其余操作與實(shí)驗(yàn)組平行；8-MOP 組、祛白片揮發(fā)油組分別加入相應(yīng)藥物，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h，在倒置顯微鏡下觀察脫黑色素細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，并在光鏡下拍照，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，與模型組比較，祛白片揮發(fā)油組作用24 h 后細(xì)胞數(shù)增加，而48 h 后減少；8-MOP 組作用24、48 h 后細(xì)胞數(shù)均增加，并呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性。

圖2 各組脫黑色素細(xì)胞生長(zhǎng)（×100）

2.2.3 CCK-8 法檢測(cè)揮發(fā)油對(duì)黑色素細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期B16 細(xì)胞，胰酶消化，制成密度為1×104／孔的單細(xì)胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按“2.2.1”項(xiàng)下方法建立模型，按“2.2.2”項(xiàng)下分組，另設(shè)對(duì)照組（不含細(xì)胞），每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，加入相應(yīng)藥物處理24、48 h，吸去上清，更換為含CCK-8 的溶液（CCK-8∶DMEM ＝1∶10），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，采用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖率［10］，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，與模型組比較，祛白片揮發(fā)油組細(xì)胞增殖率升高（P＜0.01）；與溶劑組比較，8-MOP 組細(xì)胞增殖率升高（P＜0.01），提示脫黑色素細(xì)胞增殖率與藥物濃度呈正相關(guān)，8-MOP 組細(xì)胞增殖率與作用時(shí)間呈正相關(guān)，祛白片揮發(fā)油組細(xì)胞增殖率與作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。

圖3 揮發(fā)油對(duì)脫黑色素細(xì)胞增殖的影響（， n＝3）

2.2.4 NaOH 裂解法檢測(cè)揮發(fā)油對(duì)黑色素形成的影響 按“2.2.3”項(xiàng)下方法分組、培養(yǎng)及給藥，加入相應(yīng)藥物培養(yǎng)48 h 后棄上清液，PBS（pH 7.4）洗滌2次，加入200 μL含10%DMSO 的1 mol／L NaOH 溶液，80 ℃恒溫水浴保溫2 h，充分裂解細(xì)胞和溶解黑素顆粒，采用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，計(jì)算促黑色素生成率［11］，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，與模型組比較，作用24 h 后祛白片揮發(fā)油組細(xì)胞促黑色素生成率升高（P＜0.01），48 h 后除祛白片揮發(fā)油1∶30 000 組外繼續(xù)升高（P＜0.05，P＜0.01）；與溶劑組比較，8-MOP 組細(xì)胞促黑色素生成率升高（P＜0.01），提示細(xì)胞促黑色素生成率與藥物濃度呈正相關(guān)，8-MOP 組細(xì)胞的促黑色素生成率與作用時(shí)間呈正相關(guān)，祛白片揮發(fā)油組細(xì)胞促黑色素生成率與作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。

圖4 揮發(fā)油對(duì)黑色素形成的影響（， n＝3）

2.2.5 酶標(biāo)法檢測(cè)揮發(fā)油對(duì)酪氨酸酶活性的影響 脫黑色素細(xì)胞接種于96 孔板，按“2.2.2”項(xiàng)下分組，加入相應(yīng)藥物處理24、48 h 后棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌2次，每孔加入1%TritonX-100 溶液90 μL，迅速放入-80 ℃冰箱中孵育30 min，隨后室溫融化使細(xì)胞完全破裂，在37 ℃下預(yù)溫后加入10 g／L L-DOPA 溶液（100 μL／孔），在37 ℃下孵育30 min，采用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)OD值［12］，計(jì)算酪氨酸酶活性促進(jìn)率，結(jié)果見(jiàn)圖5。由此可知，與模型組比較，祛白片揮發(fā)油組脫黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶活性升高（P＜0.01）；與溶劑組比較，8-MOP 組脫黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶活性升高（P＜0.01），提示脫黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶活性與藥物濃度呈正相關(guān)，8-MOP 組脫黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶活性與作用時(shí)間呈正相關(guān)，而祛白片揮發(fā)油組脫黑色素細(xì)胞中酪氨酸酶活性與作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。

圖5 揮發(fā)油對(duì)酪氨酸酶活性的影響（， n＝3）

3 討論

3.1 祛白片揮發(fā)油成分分析 由提取中藥揮發(fā)油制成的中成藥在現(xiàn)代疾病治療、預(yù)防保健中已被廣泛應(yīng)用［13］。本研究采用GC-MS 技術(shù)［14］對(duì)祛白片揮發(fā)油的化學(xué)成分及含量進(jìn)行考察，結(jié)果顯示，揮發(fā)油成分中1-甲基-2，4-二（prop-1-en-2-基）-1-乙烯基環(huán)己烷最高，（2E，4E）-癸二烯醛（8.03%）次之，4a-甲基-1-亞甲基-7-（prop-1-en-2-基）十氫萘含量排名第3。分析結(jié)果表明，祛白片揮發(fā)油成分中含量最高的為脂肪烴類(lèi)，其次為環(huán)烴。將祛白片揮發(fā)油成分，與方中君藥蒺藜的揮發(fā)油［15］比較可知，蒺藜中含量最高的（2E，4E）-癸二烯醛（9.16%）在祛白片揮發(fā)油中次高，祛白片揮發(fā)油中含量最高的1-甲基-2，4-二（prop-1-en-2-基）-1-乙烯基環(huán)己烷在蒺藜的揮發(fā)油中沒(méi)有檢測(cè)到，方中臣藥補(bǔ)骨脂揮發(fā)油中含量最多的石竹烯（36.24%）［16］在祛白片中也沒(méi)有的檢測(cè)到，可能是在提取祛白片揮發(fā)油的過(guò)程中，發(fā)生了多種復(fù)雜的化學(xué)變化，使得揮發(fā)油在成分和含量上都與單味藥成分存在較大差異。

3.2 陽(yáng)性藥物的選擇 8-MOP 加長(zhǎng)波紫外線或日光照射是治療白癜風(fēng)應(yīng)用最多的一種方法，其臨床上應(yīng)用的口服片劑、膠囊、針劑、酊劑等對(duì)白癜風(fēng)均有一定的治療作用［17］。由于8-MOP 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易與DNA 發(fā)生作用，生物活性較易發(fā)揮作用，故選擇其為陽(yáng)性對(duì)照藥物，考察祛白片揮發(fā)油的抗白癜風(fēng)作用。

3.3 祛白片揮發(fā)油對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16 脫黑色素模型的影響 與模型組比較，祛白片揮發(fā)油作用24 h 后各劑量揮發(fā)油均可使細(xì)胞數(shù)增加，但作用48 h 后細(xì)胞數(shù)較之前有所減少。8-MOP 組給藥24、48 h 后對(duì)脫黑色素細(xì)胞的增殖作用呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。祛白片揮發(fā)油對(duì)脫黑色素細(xì)胞增殖活性及黑色素水平的研究結(jié)果與以上情況類(lèi)似。祛白片揮發(fā)油給藥48 h 后結(jié)果不佳，可能是因?yàn)閾]發(fā)油理化性質(zhì)較為特殊［18］，在室溫下極易揮發(fā)，48 h后，揮發(fā)油含量已下降，藥效也隨之降低。祛白片揮發(fā)油對(duì)B16 細(xì)胞脫黑色素模型具有一定的促進(jìn)生長(zhǎng)繁殖和升高黑色素水平的作用。本研究可作為祛白片制備工藝改進(jìn)的依據(jù)，建議在祛白片飲片水提之前進(jìn)行揮發(fā)油的收集以及環(huán)糊精包合［19-21］，以提高揮發(fā)油的穩(wěn)定性，增強(qiáng)祛白片的療效，更好的滿(mǎn)足患者的臨床需求。