陳敏 鄧萌萌伍蕊嗣周波韋袆潘曉鵑*

（1.西南醫(yī)科大學藥學院，四川 瀘州646000； 2.四川省中醫(yī)藥科學院，四川 成都610041； 3.重慶市中藥研究所，重慶404100）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動脈血管發(fā)生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病，常被稱為冠心?。?］。世界衛(wèi)生組織將冠心病分為無癥狀心肌缺血（隱匿性冠心?。⑿慕g痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭和猝死5 種臨床類型［2］。冠心病的患病率在世界范圍內不斷增加，也呈現(xiàn)出逐漸年輕化的狀態(tài)，其發(fā)病機制是體內脂質代謝異常，血管中脂質沉淀在動脈內膜上，出現(xiàn)類似于粥樣的脂類物質，聚集成白色斑塊，堵塞動脈血管，血液流動速度隨之降低，導致心臟缺血，最終演變成冠狀動脈粥樣硬化性心臟病。病變過程是內皮細胞的改變，由線狀形逐漸變?yōu)閳A石塊形狀，使得單核細胞和巨噬細胞易于通過內皮到達皮下間隙，驅動動脈粥樣硬化的發(fā)生［3］，同時脂蛋白水平增高，刺激低密度脂蛋白LDL 和其他脂蛋白聚集于病灶區(qū)，形成脂紋斑塊。血管內膜增厚中膜變薄、血管外膜大量纖維化，逐漸形成纖維帽，繼而演變?yōu)槔w維斑塊［4-5］。

中醫(yī)認為冠心病分為本虛和標實2 種情況，通過辯證將這種疾病分為血瘀氣滯型、陰寒內結型、痰濁閉阻型、痰瘀氣足型、心腎陰虛型、心脾兩虛型等［6］，按照類型的不同進行相關的治療。治療標實者可以單獨治其標，補腎精者可重在標本兼治，本虛者可以根據(jù)氣血陰陽虧虛不同采取相應的治療方法［7-8］。鑒于中藥復方成分復雜、靶點眾多等原因，本研究利用網(wǎng)絡藥理學方法探討中藥復方的生物活性成分及作用靶點，并應用分子對接技術對關鍵藥效成分和靶點進行驗證，為進一步闡明精制冠心片活性成分、作用機制以及發(fā)揮臨床療效提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 精制冠心片活性成分與潛在靶點篩選 綜合文獻報道以及利用中藥系統(tǒng)網(wǎng)絡藥理學分析平臺（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／ tcmsp.php）分別輸入“丹參”“赤芍”“紅花”“降香”“川穹”5 味中藥藥名，查找活性成分，設定口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，收集符合條件的有效成分。綜合考慮該化學成分的含量及生物學效應等多方面因素，最終確定為活性成分，通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫預測其靶點蛋白。在Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.uniprot.org／）中將靶點蛋白名轉換為靶點基因名。

1.2 確定疾病靶點 通過OMIM 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.omim.org／）以 及 GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.genecards.org／）搜集與冠心病相關的疾病靶點，將數(shù)據(jù)庫中的疾病基因導入excel 表格中合并數(shù)據(jù)，剔除重合基因條目，最終獲得冠心病相關基因。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網(wǎng)絡的構建 將精制冠心片和冠心病共同作用靶點以gene symbol 形式上傳至STRING［9］（https：／ ／string-db.org／）數(shù)據(jù)庫中，構建蛋白質相互作用網(wǎng)絡，將物種設定為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設置為“highest confidence”（＞0.9），隱藏游離蛋白，其他參數(shù)保持默認設置進行操作，將文件保存為TSV 格式。

1.4 中藥-成分-靶點網(wǎng)絡構建 通過數(shù)據(jù)篩選獲得精制冠心片活性成分潛在作用靶點及冠心病疾病靶點，通過韋恩圖取交集得到2 者共同靶點112個，利用Cytoscape 3.8.0軟件構建“中藥-成分-基因靶點”相互作用網(wǎng)絡圖，藥物活性成分和作用靶點以“節(jié)點”表示，節(jié)點之間的相互作用以“邊”表示。

1.5 基因本體（GO）富集分析和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／david.ncifcrf.gov／）對精制冠心片和冠心病共同作用靶點蛋白進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，篩選P＜0.05 的前20個條目，借助 omicshare網(wǎng)站（https：／ ／www.omicshare.com／）進行數(shù)據(jù)可視化處理，以闡釋精制冠心片治療冠心病的生物功能及相關信號通路，結果以柱形圖和氣泡圖形式呈現(xiàn)。

1.6 分子對接驗證 從PDB 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.rcsb.org／）中下載核心靶點蛋白質結構，利用PyMol 2.3.4 軟件對核心蛋白進行去水、分離原配體等操作，保存后導入Autodock 4.2.6 軟件加氫、設置原子類型，保存為“pdbqt”格式。在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中下載小分子結構，保存為“mol2”結構，利用Autodock 進行核心成分的分子對接。結合能代表受體與配體之間的作用力，結合能越低，氫鍵數(shù)目越多，構象越穩(wěn)定，其能量越低，相互作用的可能性就越大［10］。通常認為，結合能絕對值大于4.25 kJ／mol 代表配體與受體之間有一定的結合力；大于5.0 kJ／mol 表示有較好的結合活性；大于7 kJ／mol 表明結合活性強烈。

2 結果

2.1 精制冠心片活性成分篩選 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以OB≥30%，DL≥0.18 進行篩選，剔除無對應靶點成分，得到丹參、赤芍、紅花、降香、川穹的有效化合物160個，其中丹參65個，赤芍29個，紅花22個，降香37個，川芎7個，有效化合物信息如表1 所示。

表1 精制冠心片候選化合物

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 冠心病疾病靶點篩選 在疾病靶點數(shù)據(jù)庫（OMIM 和GeneCards）查找檢索冠心病的疾病作用靶點，挖掘并刪除重復靶點，共收集到潛在疾病靶點1 368個，將得到的靶點信息進行基因名和Uniprot ID 的標準化。利用韋恩圖獲得精制冠心片和冠心病兩者的共同作用靶點112 個。由圖1 可知，精制冠心片可以通過多種成分作用于冠心病疾病的多個相關靶點來發(fā)揮抗冠心病的作用。

圖1 “藥物-疾病”交集靶基因韋恩圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡構建及分析 應用STRING 數(shù)據(jù)庫，構建精制冠心片治療冠心病潛在靶點PPI 網(wǎng)絡，將結果見圖2，共有節(jié)點60個，邊數(shù)233條，平均節(jié)點數(shù)為7.77，平均局部聚類系數(shù)為0.557。

圖2 精制冠心片治療冠心病的蛋白相互作用網(wǎng)絡

2.4 中藥—成分—靶點網(wǎng)絡的構建及分析結果 將精制冠心片活性成分和作用靶點信息導入Cytoscape 3.8.0 軟件，構建“中藥-成分-靶點”網(wǎng)絡圖，共包含360 個節(jié)點，2 006條邊（圖3）。在網(wǎng)絡中，一個節(jié)點的度（degree）表示網(wǎng)絡中和節(jié)點相連路線的條數(shù)，度值越大則表明該化合物發(fā)揮作用的可能性越大，各節(jié)點根據(jù)degree 值呈現(xiàn)為不同大小。菱形代表基因靶點，圓形代表各中藥成分，正六邊形代表各中藥所共有的靶點。通過網(wǎng)絡拓撲分析可以得出，該網(wǎng)絡中，度值大于等于50（中位數(shù)）的化合物有13個，包括6-羥基山柰酚（degree ＝69）、川芎哚（degree ＝102）、柳杉酚（degree＝56）、黃檀素（degree ＝65）、楊梅酮（degree ＝78）、丹參酮ⅡA（degree ＝109）、芍藥苷（degree＝77）、隱丹參酮（degree ＝89）、丹參酮Ⅰ（degree ＝91）、山柰素（degree ＝53）等，因此可以推測上述成分可能是精制冠心片治療冠心病的重要成分。

圖3 中藥-成分-靶點網(wǎng)絡圖

2.5 GO 功能富集分析 在DAVID 數(shù)據(jù)庫，對精制冠心片和冠心病的共同靶點進行GO 功能富集分析，得到20 個生物過程、88 個細胞組分、167 個分子功能。富集結果表明，精制冠心片治療冠心病的生物過程主要與細胞內信號的正向轉導、細胞群的增殖、細胞的積極代謝、細胞對化學、壓力、藥物刺激、含氧化合物等的反應有關（圖4A）；細胞組分主要涉及膜筏、小窩、內膜系統(tǒng)、囊泡、質膜、核染色質、肌膜炎、空泡、溶酶體、Z 盤等（圖4B）；分子功能主要集中于蛋白質二聚活性、細胞因子活性、脂質結合、轉錄因子結合、信號受體活性、過氧化物酶活性、G蛋白偶聯(lián)的胺受體活性、花生四烯酸結合、NFAT 蛋白結合、胰島素樣生長因子Ⅱ結合（圖4C）。分析結果顯示，冠心病涉及體內多個生物學過程，精制冠心片可能通過調節(jié)這些生物過程起到治療冠心病的作用。

圖4 GO 富集結果柱形圖

2.6 KEGG 通路富集分析 對精制冠心片和冠心病的共同靶點進行KEGG 通路富集分析，結果以P＜0.05 篩選，共有119 條信號通路出現(xiàn)富集，以Count 值降序篩選排名前20的KEGG 通路輸出氣泡圖（圖5）。其中節(jié)點的大小表示富集到的靶點數(shù)量，節(jié)點的顏色由紅色至藍色表明P值由大到小。因此，紅色節(jié)點越大信號通路的顯著性就越高，說明該信號通路的重要性越高，排除廣泛通路后，表2 中列出了排名前20 的信號通路。經(jīng)分析，主要分布于腫瘤壞死因子信號通路、HIF-1 信號通路、Toll 樣受體信號通路、VEGF 信號通路、NOD 樣受體信號通路、T 細胞受體信號通路、MAPK 信號通路等通路中。

表2 KEGG 關系網(wǎng)絡中Degree 值前20 的靶標

圖5 KEGG 通路富集分析結果

2.7 分子對接驗證 如表3 所示，4 個成分的結合力均小于0，說明其與靶點產(chǎn)生自發(fā)性結合。芍藥苷與ADRB2 靶點結合能為-8.0 kJ／mol，氫鍵數(shù)目為3；丹參酮ⅡA與ADRB2 的結合能最大為-9.6 kJ／mol，氫鍵數(shù)目為1。對接結果表明，精制冠心片中關鍵活性成分與核心靶點結合能力低，相互之間結合性好生物活性高，是精制冠心片治療冠心病的關鍵，見圖6。

圖6 蛋白對接構象

表3 核心成分與靶點的結合情況

3 討論

本文使用網(wǎng)絡藥理學的研究方法挖掘精制冠心片的有效入血成分，對冠心病的作用靶點及涉及的通路進行研究。從靶點、信號通路的角度闡釋精制冠心片治療冠心病的作用機制，以及利用分子對接技術驗證了主要活性成分與核心靶點具有較好的結合作用。構建精制冠心片治療冠心病的“中藥-活性成分-靶點”交互網(wǎng)絡圖，篩選出精制冠心片的165 個活性成分及112 個與疾病共同的作用靶點，使用網(wǎng)絡拓撲分析方法篩選出13 個顯著有效化合物。GO 富集和KEGG 富集顯示涉及20 個生物過程，88 個細胞組分、167 個分子功能，119 條信號通路。PPI 網(wǎng)絡分析及分子對接驗證，得到精制冠心片治療冠心病關聯(lián)性最強的核心靶點是PTGS2、NCOA2、ADRB2 等。上述靶點與炎癥調節(jié)、體內凝血系統(tǒng)、脂質代謝系統(tǒng)等密切相關。GO 富集分析顯示，精制冠心片治療冠心病與G 蛋白偶聯(lián)胺受體、腎上腺素受體等有關。KEGG 通路富集分析顯示，精制冠心片對冠心病的治療涉及IL-17 信號通路、PI3K-Akt 信號通路［11-12］、HIF-1 信號通路等。

丹參中的有效化合物丹參酮ⅡA具有抗凝血、抗動脈粥樣硬化、調節(jié)血脂等作用［13-14］。川芎中的川芎嗪可改善冠狀動脈的血液循環(huán)，減輕缺血所引起的心肌細胞損傷，抑制血清肌酸磷酸激酶和乳酸脫氫酶的溢出，減小缺血范圍，促進纖維蛋白降解，對抗體外血漿凝血，從而達到治療冠心病的目的［15-16］。紅花中的主要活性成分山柰素具有抗心肌缺血、抑制血小板聚集、抗氧化，增加冠狀動脈血流量和降低冠狀動脈阻力等作用，還能抑制動脈粥樣硬化血管中內皮細胞的增殖，阻止內皮細胞過度增生，穩(wěn)定血管內膜等作用［17-18］。赤芍的主要化合物具有擴張冠狀動脈、增加冠狀動脈血流量，抑制血小板聚集等作用［19-20］。研究顯示，川芎和赤芍合用或單用均可降低血清中TC、TG、LDL 水平，合用可提高超氧化物歧化酶（SOD）活性和降低丙二醛（MDA）水平，在提高血管內皮細胞抗氧化能力及促進NO 釋放方面產(chǎn)生協(xié)同作用［21］。降香的主要化學成分包含揮發(fā)油類和黃酮類化合物，具有舒張血管、增加冠脈血流、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用［22-23］。

綜上所述，精制冠心片中的丹參酮ⅡA、芍藥苷、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、6-羥基山柰酚、川芎哚、柳杉酚等有效化合物可能通過HIF-1、Toll 樣受體、VEGF、NOD 樣受體、T 細胞受體等信號通路作用于PTGS2、PTGS1、NCOA2、ADRB2 等靶點發(fā)揮抗炎、降脂、抗動脈粥樣硬化等作用。基于網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術預測結果與已有文獻結果較為相近，體現(xiàn)了此方法具有一定的準確性，同時契合中藥整體觀、系統(tǒng)性的理念，為進一步闡述精制冠心片治療冠心病提供參考。