孫健淇張若琛張穎利解俊杰石妍

（1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，內(nèi)蒙古 包頭014030； 2.包頭市第九中學(xué)，內(nèi)蒙古包頭014000； 3.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)整形外科，內(nèi)蒙古 包頭014030； 4.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院黨政辦公室，內(nèi)蒙古 包頭014030； 5.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古 包頭014010）

潰瘍性結(jié)腸炎是一種病因尚不確切的非特異性腸道疾病，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、里急后重及黏液膿血便等，常呈連續(xù)慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，發(fā)作與緩解交替，遷延不愈，根治困難，給患者的生理和精神造成極大困擾。臨床治療常采用氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等藥物，然而常規(guī)治療難以有效緩解病情和防止復(fù)發(fā)，還可能引起多種不良反應(yīng)。因此，探究潰瘍性結(jié)腸炎的有效治療方法已成為臨床研究的熱點(diǎn)［1］。

附子理中丸由附子、干姜、白術(shù)、黨參、甘草組成，原方出自《閻氏小兒方論》，后收錄于《國家基本藥物目錄》，具有溫陽祛寒、益氣健脾之功，多用于脾胃虛寒所致脘腹冷痛、呃逆、腸易激綜合征［2］，對潰瘍性結(jié)腸炎的療效顯著［3-4］，作用機(jī)制與炎癥密切相關(guān)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合了計(jì)算機(jī)技術(shù)、系統(tǒng)生物學(xué)、高通量篩選等技術(shù)，研究“藥物-靶點(diǎn)-疾病”之間復(fù)雜關(guān)系的交叉學(xué)科，通過對中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路、多功能以及中藥配伍進(jìn)行梳理，適合于中藥方劑作用機(jī)制的研究［5］，已有較多學(xué)者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測到中藥的治療靶點(diǎn)［6-7］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)全面解析附子理中丸治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制，以期為潰瘍性結(jié)腸炎治療研究提供新的方法與思路。

1 材料與方法

1.1 動物實(shí)驗(yàn)

1.1.1 動物及分組 SD 大鼠，清潔級，雄性，體質(zhì)量220～280 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于明暗交替的清潔級動物飼養(yǎng)室中，環(huán)境溫度24～26 ℃，相對濕度50%。動物實(shí)驗(yàn)遵循包頭醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會規(guī)定。將60 只雄性大鼠編號，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組和附子理中丸組，每組20 只。

1.1.2 造模及給藥 參考文獻(xiàn)［8］報道方法，DSS 自由飲用法造模。適應(yīng)性飼喂養(yǎng)7 d 后將大鼠納入實(shí)驗(yàn)，對照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組和附子理中丸組大鼠自由飲用5.0% DSS 水溶液，連續(xù)7 d，大鼠出現(xiàn)腹瀉、膿血便等癥狀，表明大鼠造模成功。附子理中丸（批號Z15021454）購自包頭中藥有限責(zé)任公司，研磨后制成0.75 g／mL 混懸液，造模成功后，附子理中丸組給予附子理中丸水溶液灌胃；對照組和模型組給予等量生理鹽水，給藥量為15 g／kg，每天1次，連續(xù)2 周。

1.1.3 一般行為及DAI 評分 造模開始后，在1、3、7、14、21 d 對各組大鼠進(jìn)行DAI 評分，計(jì)算公式為DAI ＝（體質(zhì)量下降率分?jǐn)?shù)＋大便性狀分?jǐn)?shù)＋便血情況分?jǐn)?shù)）／3，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 DAI 評分標(biāo)準(zhǔn)

1.1.4 標(biāo)本采集 各組大鼠于末次藥物干預(yù)后，禁食不禁水24 h，稱定體質(zhì)量，10%水合氯酸（3.5 mL／kg）腹腔注射麻醉，剖開腹腔，自肛門向上截取長度約8 cm 結(jié)腸，縱向剪開后用生理鹽水沖洗清潔，剪碎后置于無酶凍存管于液氮中保存待測。取材完畢后處死大鼠。

1.1.5 結(jié)腸組織病理學(xué)檢查 取大鼠結(jié)腸標(biāo)本置于組織固定液中固定，制作蠟塊、脫水、HE 染色，顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.2.1 附子理中丸的活性成分及作用靶點(diǎn) 應(yīng)用TCMSP 2.3 數(shù)據(jù)庫［9］（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）獲得附子理中丸中附子、黨參、炒白術(shù)、甘草、干姜的活性化合物信息，活性化合物篩選條件設(shè)為經(jīng)口服生物利用度（OB）≥30 %，類藥性（DL）≥0.18。預(yù)測活性化合物作用靶點(diǎn)采用Swisstarget prediction 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch），導(dǎo)入活性化合物SMILES ID 進(jìn)行預(yù)測，保存預(yù)測靶點(diǎn)信息。

1.2.2 潰瘍性結(jié)腸炎靶點(diǎn) 應(yīng)用DISGENET 5.0 數(shù)據(jù)庫［10］（http：／ ／www.disgenet.org／），以“Ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞，找到潰瘍性結(jié)腸炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)及靶點(diǎn)-疾病相關(guān)性得分小于0.01 的靶點(diǎn)，與“1.2.1”方法中所獲得的附子理中丸預(yù)測靶點(diǎn)相匹配，得到附子理中丸治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用靶點(diǎn)。

1.2.3 VENNY 圖的制作 使用DrawVennDiagram 網(wǎng)站（http：／ ／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）將5 味單味藥及其潰瘍性結(jié)腸炎相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入，應(yīng)用Venn diagram網(wǎng)站（http：／ ／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）制作VENNY圖，找到多個單味藥共同作用的靶點(diǎn)。

1.2.4 GO 分析及KEGG 分析 應(yīng)用Cytoscape 2.3.5 軟件中Clue GO 插件將附子理中丸治療潰瘍性結(jié)腸炎靶點(diǎn)uniprot ID 導(dǎo)入，設(shè)置物種，選擇“GO 生物過程分析及KEGG 通路分析”，設(shè)置P值＜0.05，提交獲得相關(guān)結(jié)果。GO 生物過程分析結(jié)果應(yīng)用氣泡圖展示，KEGG 通路分析結(jié)果應(yīng)用Cytoscape 進(jìn)行可視化處理。

1.2.5 關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)選擇 應(yīng)用Cytoscape 軟件對KEGG 分析結(jié)果構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，利用cytoHubba 插件對靶點(diǎn)進(jìn)行排序，cytoHubba 應(yīng)用的是Maximal Clique Centrality 方法，其綜合11 個拓?fù)浞治龇椒ê? 個中心性方法，可綜合多種因素選擇關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.6 分子對接驗(yàn)證 選擇關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白及其作用活性化合物，將下載的活性化合物結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入薛定諤Maestro中，優(yōu)化所有小分子結(jié)構(gòu)，預(yù)測其質(zhì)子化狀態(tài)，生成立體異構(gòu)體。在PROTEIN DATA BANK 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／www.rcsb.org）中下載蛋白結(jié)構(gòu)式，將靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入軟件中，對其進(jìn)行加氫原子、去水分子和雜原子集團(tuán)等處理，簡單優(yōu)化蛋白。對蛋白進(jìn)行定義對接區(qū)域，生成格點(diǎn)文件，把處理好的小分子與定義的格點(diǎn)文件進(jìn)行對接。

1.3 靶點(diǎn)驗(yàn)證 Western blot 檢測NF-κB1（p50）、NF-κB3（p65）、TNF-α、IL-6、MAPK1 蛋白表達(dá)。使用RIPA 裂解液從結(jié)腸組織中提取總蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，計(jì)算蛋白上樣量，進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗NF-κB1、TNF-α、IL-6（美國Proteintech 公司）和NF-κB3、MAPK1（英國Abcam 公司）孵育，洗膜，二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）孵育，洗膜，曝光掃描，并利用Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊采用SNK-q檢驗(yàn)，方差不齊采用Game-Howell 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物實(shí)驗(yàn)DAI 評分及大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)觀察如表2 所示，自開始造模為1 d 起算，模型組和附子理中丸組在7 d 評分最高，表示造模成功。用藥2 周后，與模型組比較，附子理中丸組大鼠癥狀好轉(zhuǎn)（P＜0.01）。如圖1所示，對照組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，未見潰瘍形成；模型組大鼠發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)破壞，潰瘍形成，組織大量炎性細(xì)胞浸潤；附子理中丸組發(fā)現(xiàn)潰瘍愈合，炎性細(xì)胞浸潤減少。

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)DAI 評分（， n＝20）

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)DAI 評分（， n＝20）

注：與模型組比較，＃＃P＜0.01。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)（HE 染色，×50）

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

2.2.1 靶點(diǎn)預(yù)測 為尋找附子理中丸的成分，應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到相關(guān)活性化合物信息，并下載其分子結(jié)構(gòu)式。在Swisstarget 數(shù)據(jù)庫中基于分子結(jié)構(gòu)預(yù)測附子理中丸的潛在靶點(diǎn)，并將靶點(diǎn)與潰瘍性結(jié)腸炎的靶點(diǎn)進(jìn)行對比，重復(fù)部分為預(yù)測的治療靶點(diǎn)，整理靶點(diǎn)信息，得到潛在靶點(diǎn)76個，見表3。

表3 附子理中丸治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在靶點(diǎn)

續(xù)表3

2.2.2 VENNY圖如圖2 所示，預(yù)測結(jié)果中多數(shù)靶點(diǎn)可與多種藥物作用，其中脂肪酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH）、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）、維生素D 受體（vitamin D receptor，VDR）、過氧化物酶體增殖物激活受體α／β（peroxisome proliferator activated receptorα／β，PPARA）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）等與潰瘍性結(jié)腸炎密切相關(guān)的靶點(diǎn)可與5 味藥共同作用。

圖2 藥物-潛在靶點(diǎn)韋恩圖

2.2.3 靶點(diǎn)分析 GO 富集生物過程分析結(jié)果如圖3 所示，靶點(diǎn)主要參與調(diào)節(jié)白細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、血管生成的正調(diào)控、樹突細(xì)胞趨化性、對銨離子的反應(yīng)、調(diào)控自噬等多種生物過程，氣泡圖中Y 軸代表生物過程名稱，X 軸代表靶點(diǎn)在生物過程中的比例，氣泡顏色代表P值，節(jié)點(diǎn)大小代表參與生物過程的靶點(diǎn)數(shù)；KEGG 通路分析結(jié)果如圖4 所示，靶點(diǎn)涉及Toll 樣受體（toll like receptors，TLR）信號通路、NOD 樣受體（nucleotide binding oligomerization domain like receptors，NLR）信號通路、Janus 激酶／信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（the Janus kinase／signal transducer and activator of tran-ions，JAK／STAT）信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、白介素-17（interleukin -17，IL-17）信號通路、Th1 和Th2 細(xì)胞分化、Th17 細(xì)胞分化、T 細(xì)胞受體信號通路、TNF-α 信號通路等，均與潰瘍性結(jié)腸炎密切相關(guān)，圖中藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)，紅色節(jié)點(diǎn)為通路，共80 個節(jié)點(diǎn)，438條邊。

圖3 附子理中丸靶點(diǎn)參與的生物過程

圖4 靶點(diǎn)-通路圖

2.2.4 關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)選擇及分子對接 基于靶點(diǎn)通路圖，應(yīng)用Cytoscape 軟件的cytoHubba 插件對靶點(diǎn)進(jìn)行分析，確定關(guān)鍵靶點(diǎn)為MAPK1、NF-κB1、TNF-α、IL-6、NF-κB3，其自由度和臨近靶點(diǎn)數(shù)量等參數(shù)均優(yōu)于其他靶點(diǎn)。找到作用于關(guān)鍵靶點(diǎn)的活性化合物成分，應(yīng)用Maestro 進(jìn)行分子對接，對接結(jié)果中“吉布斯自由能絕對值＞5”為有效對接。結(jié)果如圖5 所示，其中5 個關(guān)鍵靶點(diǎn)可與不同成分作用，證明其作為潰瘍性結(jié)腸炎潛在靶點(diǎn)的可行性。

圖5 分子對接結(jié)果圖

2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的驗(yàn)證 如圖6 所示，與模型組比較，附子理中丸能夠降低NF-κB1 p50、TNF-α、IL-6、NF-κB3 p65 的蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），而對MAPK1 蛋白表達(dá)無影響（P＞0.05），表明附子理中丸能夠通過NF-κB1 p50、TNF-α、IL-6 及NF-κB3 p65 靶點(diǎn)發(fā)揮保護(hù)作用。

圖6 附子理中丸對潛在靶點(diǎn)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

附子理中丸具有溫陽祛寒、益氣健脾之功，多用于脾胃虛寒所致脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、手足不溫等癥，臨床使用廣泛。胡利群等［11］應(yīng)用附子理中丸聯(lián)合五維他口服溶液治療潰瘍性結(jié)腸炎，可改善疾病癥狀。附子理中丸療效確切，作用迅速，但對其治療潰瘍性結(jié)腸炎的基礎(chǔ)研究尚不多見。

采用DSS 制備大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)給予附子理中丸能夠緩解癥狀，促進(jìn)潰瘍愈合，減少組織炎性細(xì)胞浸潤。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，附子理中丸主要通過參與上皮細(xì)胞凋亡過程、調(diào)控自噬、平滑肌收縮的積極調(diào)節(jié)、急性炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等生物過程來干預(yù)疾病的發(fā)生發(fā)展，反映出復(fù)方多途徑的特點(diǎn)；參與調(diào)控的通路有NF-κB 信號通路、TNF-α 信號通路、T 細(xì)胞受體信號通路、Toll 樣受體信號通路、Th1 和Th2 細(xì)胞分化、Th17 細(xì)胞分化等，且均與炎癥密切相關(guān)，由此推測附子理中丸可能主要通過調(diào)控各種信號因子發(fā)揮抗炎作用。結(jié)合多種分析結(jié)果，最終篩選到附子理中丸治療潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)為MAPK1、NF-κB1、TNF-α、IL-6、NF-κB3。

小腸上皮細(xì)胞中IL-8 的產(chǎn)生依賴ERK1／2 通路［12］，而IL-8 在結(jié)腸免疫系統(tǒng)中發(fā)揮潛在作用［13］，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，附子理中丸不能對該靶點(diǎn)蛋白表達(dá)發(fā)揮作用，表明MAPK1 可能不是其治療靶點(diǎn)。關(guān)鍵靶點(diǎn)中TNF-α、IL-6 作為重要的炎癥介質(zhì)，其表達(dá)升高會導(dǎo)致細(xì)胞因子失衡，參與疾病的發(fā)生發(fā)展。在柳氮磺吡啶聯(lián)合雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究中發(fā)現(xiàn)，藥物可通過降低炎癥因子的表達(dá)恢復(fù)機(jī)體自身免疫，從而糾正潰瘍性結(jié)腸炎病理過程中出現(xiàn)的細(xì)胞因子紊亂［14］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎中存在TNF-α、IL-6 的高表達(dá)，表明其作為治療靶點(diǎn)的可行性。

NF-κB 是一種重要的調(diào)節(jié)因子包括NF-κB1 p50、NFκB2 p52、RE-LA p65、RELB 和c-REL 等5 個成員，它們以同型和異型二聚體的各種組合形式存在［15］。在大多數(shù)細(xì)胞中，NF-κB 存在的主要形式是由RE-LA 和NF-κB1 組成的異二聚體［16］，其中，NF-κB1 負(fù)責(zé)與DNA 結(jié)合，RE-LA 參與調(diào)控下游多種靶基因的轉(zhuǎn)錄活性［17］。Hegazy等［18］研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎患者的腸黏膜TNF-α 和RE-LA ／p65 高表達(dá)，通過降低IL-6、TNF-α 和p65 表達(dá)，可以減輕炎癥反應(yīng)，改善黏膜狀態(tài)。國外學(xué)者通過抑制NF-κB 亞基（p65 ／p50）的激活和轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制了潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜的炎性改變，起到保護(hù)腸黏膜的作用［19］，這提示附子理中丸可通過該途徑起到保護(hù)和修復(fù)黏膜的作用。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，附子理中丸可降低NF-κB1、TNF-α、IL-6、NF-κB3 蛋白表達(dá)，對潰瘍性結(jié)腸炎起到保護(hù)作用。

綜上所述，附子理中丸可通過多途徑、多靶點(diǎn)來治療潰瘍性結(jié)腸炎，在靶點(diǎn)間同樣存在協(xié)同作用。本研究全面分析了附子理中丸治療潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制，為臨床指導(dǎo)用藥提供了新的理論依據(jù)，也為今后繼續(xù)探索中藥附子理中丸的作用機(jī)制提供了新線索。