李秋芳 王文愷龔曼 傅金英代麗萍王舒珣劉雅琳*

［1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州45004； 2.河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院），河南 鄭州450002； 3.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京210024； 4.河南省道地藥材綜合開發(fā)與利用工程中心，河南鄭州450046］

隨著現(xiàn)代社會生活的改變，糖尿病的患病率在逐年上升，已成為全球威脅人類健康的三大慢性非傳染性疾病之一［1］。在糖尿病患者中，動脈粥樣硬化是最為常見的并發(fā)癥［2］，并最終導(dǎo)致冠心病、腦血管意外和下肢壞疽等［3］。炎癥反應(yīng)是動脈粥樣硬化形成的重要環(huán)節(jié)，大量臨床及試驗研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病動脈粥樣硬化的發(fā)病與NLRP3／ASC／caspase-1 信號通路密切相關(guān)［4-6］。

當(dāng)歸補血湯出自李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》，由黃芪、當(dāng)歸按5∶1 比例組成，具有補氣生血的功效。糖尿病早期病因為燥熱傷陰，隨著疾病發(fā)展，陰傷及氣，導(dǎo)致氣陰兩虛，而“氣為血之帥”，故氣虛則運血生血無力，出現(xiàn)血虛燥熱及瘀血阻滯。由此可見，糖尿病治療的關(guān)鍵在于補氣生血滋陰，而當(dāng)歸補血湯的功效正契合其病因病機。課題組前期研究了當(dāng)歸補血湯的療效及其機理，發(fā)現(xiàn)該方可降低動脈粥樣硬化模型大鼠C-反應(yīng)蛋白和TNF-α 水平，具有抗炎抗氧化作用，還能能調(diào)節(jié)血脂、抑制主動脈MCP-1、ICAM-1 和CD36 的基因表達［7-8］。本課題組前期實驗也研究了芒柄花素、毛蕊異黃酮、阿魏酸、黃芪甲苷為當(dāng)歸補血湯吸收入血活性成分（absorbed bioactive compounds，ABCs）的藥代動力學(xué)規(guī)律［9］。此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種基于系統(tǒng)生物學(xué)闡述疾病發(fā)生發(fā)展及藥物作用的新興學(xué)科，對發(fā)現(xiàn)藥物潛在藥理機制有巨大幫助。

本研究采用動物實驗，首次揭示了當(dāng)歸補血湯及ABCs通過NLRP3／ASC／caspase-1 信號通路干預(yù)糖尿病動脈粥樣硬化的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，此外結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討其他可能的作用機制，為全面解析當(dāng)歸補血湯及ABCs的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物 40 只雄性SPF 級SD 大鼠，體質(zhì)量（270±10）g，購自山東省實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）2014-0007。動物于河南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心標準化飼養(yǎng)，恒溫（23±1）℃，相對濕度（50±5）%，自由飲水飲食。高脂高糖飼料由基礎(chǔ)飼料加入脂肪15%、蔗糖20%、雞蛋5%、膽固醇1%、食鹽0.1%，由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 試劑與藥物 黃芪（批號180621）、當(dāng)歸（批號180801）購自亳州市張仲景中藥飲片有限公司。芒柄花素（批號RQ1833）、阿魏酸（批號RQ18R920）、黃芪甲苷（批號RQ1214）對照品購自上海瑞生生物科技有限公司，純度98%；毛蕊異黃酮（批號Wkq19011810）購自四川省維克奇生物科技有限公司，純度98%；鏈脲佐菌素（批號RK18S1206）、NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；RIPA 裂解液（貨號G2002）、β-actin 多克隆一抗（貨號GB12001）、caspase-1 多克隆一抗（貨號GB11383）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；NLRP3 多克隆一抗（貨號ab214185）購自英國Abcam 公司；IL-18 多克隆一抗（貨號10663-1-ap）購自美國CST公司。

1.3 儀器 電子天平［型號PL-203，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；離心機（型號D1008E）、勻漿儀（型號KZ-II，武漢賽維爾生物科技有限公司）；酶標檢測儀（型號Rt2100c，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；凝膠成像儀（型號V300，日本EPSON 公司）；石蠟切片機（型號RM2235，德國Leica公司）；雙垂直電泳儀（型 號DYCZ-24DN）、轉(zhuǎn)印電泳儀（型號DYCZ-40D）購自北京六一生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 當(dāng)歸補血湯灌胃湯劑的制備 根據(jù)處方依次稱取黃芪500 g、當(dāng)歸100 g，置于圓底燒瓶中，加10 倍量蒸餾水，室溫浸泡60 min后，電熱套加熱至沸騰開始計時，煎煮30 min，紗布過濾，濾渣再加6 倍量蒸餾水，攪拌均勻后繼續(xù)煎煮30 min，過濾，合并2 次濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 500 mL，即得當(dāng)歸補血湯質(zhì)量濃度為0.4 g／mL，低溫保存，備用。

2.2 動物分組與給藥 將40 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為正常對照組、模型組、當(dāng)歸補血湯組（4 g／kg）、ABCs 組（劑量濃度相當(dāng)于課題組前期測得母方的量［10］，即芒柄花素2.68 mg／kg，毛蕊異黃酮2.56 mg／kg，阿魏酸1.36 mg／kg，黃芪甲苷0.45 mg／kg），每組10 只大鼠，除正常對照組喂食基礎(chǔ)飼料外，其余各組大鼠給予高脂高糖飼料進行喂養(yǎng)，均自由飲水。造模成功后的大鼠灌胃給藥，灌胃容量為10 mL／kg，ABCs 組灌胃由芒柄花素、毛蕊異黃酮、阿魏酸、黃芪甲苷組成的ABCs 混合溶液，當(dāng)歸補血湯組灌胃當(dāng)歸補血湯，正常對照組與模型組灌胃等體積的生理鹽水，每天1次，持續(xù)4 周。

2.3 糖尿病動脈粥樣硬化模型的建立 大鼠隔夜空腹12 h后右側(cè)腹腔注射進行造模，其中模型組、ABCs 組、當(dāng)歸補血湯組注射1% STZ 60 mg／kg，并在此期間繼續(xù)喂以高糖高脂飼料［11］；正常對照組注射相等劑量的檸檬酸鈉緩沖液并喂以普通飼料。大鼠成模判定標準為注射后第3、7 天檢測血糖，如隨機血糖≥16.9 mmol／L；或出現(xiàn)多飲、多尿、消瘦、乏力、懶動等癥狀，且連續(xù)2 次隨機血糖＞11.1 mmol／L，即視為糖尿病造模成功。

2.4 大鼠一般情況記錄 觀察大鼠一般情況：包括精神狀態(tài)、行為活動、毛發(fā)、毛色、清潔度、排便排尿情況等。每周稱量1 次大鼠體質(zhì)量，檢測1 次隨機血糖，給藥結(jié)束后記錄大鼠24 h 內(nèi)攝食、飲水量，處死前禁食12 h 測空腹血糖。

2.5 血清炎癥因子檢測 末次灌胃2 h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，4 ℃、3 500 r／min離心10 min 得到血清，分裝后于-80 ℃保存。檢測前4 ℃融化樣本，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 水平。

2.6 蛋白免疫印跡 稱取主動脈組織100 mg，加入裂解液，勻漿提取總蛋白，BCA 法進行蛋白定量，確定上樣體積。每組樣品加入1／4 體積的5×Loading buffer 后煮沸5 min，-80 ℃保存?zhèn)溆?。配制分離膠和濃縮膠，將樣品加入電泳孔中，電泳條件為濃縮膠用電壓75 V，分離膠用120 V，200 mA 電流轉(zhuǎn)膜1 h后，將膜放入含5 %脫脂奶粉的TBST 溶液中室溫封閉1 h，按1∶1 000 比例加入一抗稀釋液，4 ℃過夜，次日孵育二抗、洗膜、顯影。條帶經(jīng)Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的灰度值，β-actin 為內(nèi)參，數(shù)據(jù)以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值表示。

2.7 大鼠主動脈病理切片分析 取主動脈根部，用10%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，制片（4 μm），HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察血管部位脂質(zhì)沉積、纖維變性程度、炎癥范圍等。

2.8 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 從TCMSP（http：／ ／ lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫收集當(dāng)歸補血湯成分及其吸收生物活性成分。Swiss Target Prediction（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch／）和 SEA（http：／ ／sea.bkslab.org／）數(shù)據(jù)庫來檢索與化合物相關(guān)的作用靶點；以血管內(nèi)皮炎癥（vascular endothelial inflammation）、動脈粥樣硬化（atherosclerosis）、糖尿?。╠iabetes）為 關(guān)鍵詞，從GeneCards（https：／ ／www.genecards.org／），OMIM（http：／ ／www.omim.org／）兩個數(shù)據(jù)庫中篩選疾病相關(guān)靶點。通 過STRING（https：／ ／string-db.org／，版本11.0）數(shù)據(jù)庫將檢索得到的當(dāng)歸補血湯有效成分與糖尿病、動脈粥樣硬化、血管內(nèi)皮炎癥的關(guān)聯(lián)靶點進行蛋白互作分析。通過KOBAS3.0 對當(dāng)歸補血湯治療疾病的候選靶點進行KEGG 通路富集分析，使用https：／ ／www.omicshare.com／tools／在線工具繪制KEGG 氣泡圖。用Cytoscape 3.6.0 構(gòu)建“成分-核心靶點-通路”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，計量資料據(jù)用（）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。柱狀圖用GraphPad Prism 8.4 軟件繪制。

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸補血湯及吸收生物活性成分對大鼠體質(zhì)量、隨機血糖的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠出現(xiàn)明顯多飲、多尿、乏力、懶動等癥狀，毛發(fā)萎黃，排泄物稀爛臭穢難聞，體質(zhì)量上升不明顯，2 周后體質(zhì)量下降（P＜0.01），隨機血糖始終高于正常對照組（P＜0.01）；與模型組比較，給予當(dāng)歸補血湯和吸收生物活性成分后大鼠糖尿病癥狀改善，體質(zhì)量增加，隨機血糖逐漸降低（P＜0.01），見圖1。

圖1 當(dāng)歸補血湯及吸收生物活性成分對大鼠體質(zhì)量、隨機血糖的影響（， n＝10）

3.2 當(dāng)歸補血湯及吸收生物活性成分對大鼠24 h 攝食、飲水量及空腹血糖的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠24 h 攝食量、飲水量增多（P＜0.05），空腹血糖升高（P＜0.01）；與模型組比較，當(dāng)歸補血湯和吸收生物活性成分能減少大鼠攝食、飲水量（P＜0.05，P＜0.01），降低空腹血糖（P＜0.01），改善糖尿病基礎(chǔ)癥狀，見圖2。

圖2 當(dāng)歸補血湯及吸收生物活性成分對大鼠24 h 攝食、飲水量及空腹血糖的影響（， n＝10）

3.3 當(dāng)歸補血湯及吸收生物活性成分對大鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 水平的影響 如表1 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，給予當(dāng)歸補血湯后，大鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），同時，吸收生物活性成分發(fā)揮了與原方劑相似作用。

表1 當(dāng)歸補血湯及吸收生物活性成分組對大鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 水平的影響（， n＝10）

表1 當(dāng)歸補血湯及吸收生物活性成分組對大鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6、ICAM-1 水平的影響（， n＝10）

注：與正常對照組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 當(dāng)歸補血湯及吸收生物活性成分對大鼠主動脈NLRP3／ASC／caspase-1 信號通路蛋白表達的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠主動脈中caspase-1、IL-18、NLRP3、IL-1β、ASC 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，吸收生物活性成分組和當(dāng)歸補血湯組大鼠主動脈中caspase-1、IL-18、NLRP3、IL-1β、ASC 蛋白表達均降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 當(dāng)歸補血湯及吸收生物活性成分對大鼠主動脈NLRP3／ASC／caspase-1 信號通路蛋白表達的影響（， n＝8）

3.5 當(dāng)歸補血湯及吸收生物活性成分對大鼠主動脈組織病理結(jié)構(gòu)的影響 正常對照組大鼠主動脈組織結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜、中膜、外膜分界清楚，內(nèi)膜光滑完整，內(nèi)皮細胞排列緊密，未見炎性細胞及脂質(zhì)沉積；與正常對照組比較，模型組大鼠主動脈組織結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)膜不光滑不完整，內(nèi)膜增厚，中膜有炎性細胞及脂質(zhì)沉積；與模型組比較，當(dāng)歸補血湯和吸收生物活性成分組可見斑塊面積及病變有不同程度的減輕，內(nèi)皮較完整，中膜未見明顯脂質(zhì)沉積，見圖4。

圖4 當(dāng)歸補血湯及吸收生物活性成分對大鼠主動脈組織病理結(jié)構(gòu)的影響（HE，×400）

3.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻檢索收集得到當(dāng)歸補血湯（當(dāng)歸、黃芪）中的化合物共22種，其中來自當(dāng)歸的2種，來自黃芪的20種，ABCs 共4 個成分，其中芒柄花素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷來源于黃芪，阿魏酸來源于當(dāng)歸。刪除重復(fù)成分后，得到24 個化合物，見表2。從數(shù)據(jù)庫中篩選當(dāng)歸補血湯成分相關(guān)靶點663個，從疾病數(shù)據(jù)庫中篩選疾病相關(guān)靶點刪除重復(fù)值后得到糖尿?。?4 950 個）、動脈粥樣硬化（4 481 個）、血管內(nèi)皮炎癥（7 677 個）相關(guān)靶點。使用在線繪圖工具對當(dāng)歸補血湯化學(xué)成分的對應(yīng)靶點和疾病靶點進行韋恩圖分析，可以看出當(dāng)歸補血湯與糖尿病、動脈粥樣硬化、血管內(nèi)皮炎癥共有396 個交集靶點，見圖5。采用Cytoscape 3.6.0 構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，可見ABCs 各成分靶點較多，見圖6。對核心靶點進行蛋白互作分析，結(jié)果顯示PIK3CA、PIK3R1、MAPK1、MAPK3、SRC、AKT1、APP、STAT3、FYN、HSP90AA1 為當(dāng)歸補血湯治療糖尿病、動脈粥樣硬化及血管內(nèi)皮炎癥的核心靶點，見圖7；Mol-3（阿魏酸）、Mol-17、Mol-24（黃芪甲苷）、Mol-8、Mol-19、Mol-16、Mol-13、Mol-12、Mol-10、Mol-9 是當(dāng)歸補血湯治療糖尿病、動脈粥樣硬化及血管內(nèi)皮炎癥的核心成分，見圖6。KEGG 分析結(jié)果表明，當(dāng)歸補血湯治療作用可能與PI3K-Akt 信號通路（hsa04151）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路（hsa04933）相關(guān)，見圖8。

圖6 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖8 KEGG 富集分析

表2 當(dāng)歸補血湯候選化合物的網(wǎng)絡(luò)信息圖

圖5 當(dāng)歸補血湯治療疾病潛在靶點

4 討論

中醫(yī)理論認為糖尿病動脈粥樣硬化的病因病機為飲食不節(jié)、喜食肥甘、積熱內(nèi)蘊、耗氣傷陰、氣虛日久、運血無力而致瘀血內(nèi)阻、脈絡(luò)不通、筋失所養(yǎng)、脈管堵塞［12-13］，同時大量的臨床證據(jù)表明，氣陰兩虛、氣血虧虛是糖尿病動脈粥樣硬化的主要證型［14］。糖尿病動脈粥樣硬化患者普遍存在肥胖，血糖異常升高，同時存在紅細胞參數(shù)下降、血小板活化、凝血因子活性改變等病理變化，可引起血液黏稠、血栓形成、動脈血流量下降等改變，與中醫(yī)學(xué)“氣血虧虛型血瘀”的形成機制相吻合［15-17］。當(dāng)歸補血湯方中黃芪補氣，推動體內(nèi)瘀滯的氣血運行，疏通堵塞脈管；當(dāng)歸養(yǎng)血，濡養(yǎng)干枯筋脈，從而實現(xiàn)氣血雙補。故本研究選用補氣生血的代表方當(dāng)歸補血湯為研究對象具有較高的臨床研究價值。

糖尿病動脈粥樣硬化是一種復(fù)雜的臨床疾病，其發(fā)病機制尚不明確，主流觀點有內(nèi)皮細胞功能紊亂、血脂代謝異常、血小板功能及凝血機制異常、全身低度炎癥狀態(tài)、機體氧化應(yīng)激狀態(tài)等［18］，其中NLRP3／ASC／caspase-1 炎癥信號通路得到越來越多的關(guān)注。本實驗研究結(jié)果顯示，ABCs 與當(dāng)歸補血湯均可下調(diào)NLRP3／ASC／caspase-1 信號通路蛋白表達，降低下游炎癥因子水平，具有抗炎作用，同時，ABCs 與當(dāng)歸補血湯組大鼠動脈斑塊面積較模型組明顯減少。因此，本實驗結(jié)果提示ABCs 能夠代表母方當(dāng)歸補血湯發(fā)揮對糖尿病動脈粥樣硬化大鼠的治療作用，但治療作用不及母方，可能與當(dāng)歸補血湯中含有的多糖、氨基酸、微量元素等作用相關(guān)，需要進一步的深入研究。同時，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測表明當(dāng)歸補血湯及ABCs 改善糖尿病、動脈粥樣硬化及血管內(nèi)皮炎癥的核心靶點為PIK3CA、PIK3R1、MAPK1、MAPK3、SRC、AKT1等，ABCs 中阿魏酸、黃芪甲苷為核心活性成分，其作用機制可能還與PI3K-Akt 信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路有關(guān)，PI3KAkt 信號通路處于NLRP3／ASC／caspase-1 信號通路上游，有待進行進一步深入研究。

綜上所述，本文首次報道了ABCs 作為當(dāng)歸補血湯治療糖尿病動脈粥樣硬化的核心成分群，尤其是阿魏酸、黃芪甲苷可能發(fā)揮主要作用。當(dāng)歸補血湯通過NLRP3／ASC／caspase-1 信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)糖尿病動脈粥樣硬化的作用，而本實驗為后期全面揭示其作用機制奠定了物質(zhì)和理論基礎(chǔ)。