林小玲柯維強唐文軍閆其星

（1.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院藥學部，海南 海口570311； 2.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，海南?？?70311）

阿爾茨海默癥屬于一種常見的中樞神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)生于老年前期和老年期，以進行性加重性認知功能障礙和行為改變?yōu)榛咎卣?。我?5 歲以上人群阿爾茨海默癥的患病率約為5.9%，其中每年約有30 萬新增病例，中重度病情占比約為67%，且患病率逐年增加［1］。多奈哌齊是阿爾茨海默癥患者常用的治療藥物，屬于可逆性乙酰膽堿脂酶抑制劑，選擇性高，可減輕臨床癥狀，但可能由于作用靶點單一，其綜合效果不甚理想［2］。

大黃酚可抗菌消炎、止咳，還可促使神經(jīng)興奮，與多奈哌齊聯(lián)用可有效防治阿爾茨海默癥，改善行為學［3］。c-JUN 氨基末端激酶（JNK）信號通路激活可參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷，加重認知障礙和行為改變，JNK 底物轉(zhuǎn)錄因子c-JUN 也可參與神經(jīng)系統(tǒng)損害［4］。JNK 信號通路在某種因素刺激下被激活，JNK、c-JUN 表達及其磷酸化水平均升高，激活其下游含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12（caspase12）的表達，可參與大鼠CA1 區(qū)海馬組織神經(jīng)元凋亡，推測是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑實現(xiàn)的，從而可引起認知損害，減弱學習、記憶能力，參與阿爾茨海默癥的發(fā)生［5-6］。本研究建立阿爾茨海默癥大鼠模型，研究大黃酚抑制阿爾茨海默癥大鼠JNK 信號通路激活，減輕海馬CA1 區(qū)組織病理損害作用，旨在為阿爾茨海默癥新藥的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 70 只SD 大鼠，雌雄各半，7～9 周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自凱學生物科技（上海）有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2019-0002，實驗動物使用許可證號SYXK（滬）2019-0032。

1.2 藥品和試劑 Aβ1-42（美 國Sigma 公司，批號190213001A）；多奈哌齊［衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號191205112］；大黃酚（中國藥品生物制品檢定所，批號110796-201948，純度＞99%）。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號G11021805）；原位末端標記法（TUNEL）試劑盒（瑞士Roche 公司，批號TG190415002C）；Trizol 試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號YSN190715112）；蛋白提取試劑盒（德國Qiagen 公司，批號YT190114A）；兔抗鼠JNK、c-JUN、磷酸化-JNK（p-JNK）、磷酸化c-JUN（p-c-JUN）、caspase12 單克隆抗體，山羊抗兔JNK、c-JUN、p-JNK、p-c-JUN、caspase12 多克隆抗體（英 國Abcam 公司，批號a191004002、a190715116、a190408315、a190712007、a190617005、a190523001、a190715008、a190512002、a190610004、a190518003）。

1.3 儀器 BW-MWM101 型Morris 水迷宮（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；RM2235 型組織切片機（德國Leica 公司）；H12611 型光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；7300型PCR 儀（美國ABI 公司）；GelDoc XR Biorad 型凝膠電泳成像系統(tǒng)、E8015-C1 型轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 建模與分組 取無菌生理鹽水加入500 μg Aβ1-42，混勻，37 ℃孵育7 d，凝聚后開始建模。取60 只SD 大鼠采用Aβ1-42腦內(nèi)注射法建立阿爾茨海默癥模型［7］。將大鼠麻醉、固定，采用腦立體定位儀定位，剪掉大鼠頭頂部毛發(fā)，常規(guī)消毒，切開皮膚后定位雙側(cè)海馬區(qū)，將前囟作為基準點，后移4.5 mm，中線旁開移動2 mm，鉆孔將針頭沒入2 mm，采用微量泵將制備好的Aβ1-42注入雙側(cè)海馬區(qū)，10 min后將針頭拔出，縫合、消毒。術后肌肉注射青霉素2×105U預防感染。術后7 d 觀察到建模大鼠有行為障礙（被動回避反射及水迷宮學習障礙等）則建模成功。將建模成功大鼠隨機分為模型組、陽性藥組及大黃酚低、中、高劑量組，另將10 只正常SD 大鼠雙側(cè)海馬區(qū)注射等量無菌生理鹽水記為正常組。

2.2 給藥 術后第7 天開始，陽性藥組予以多奈哌齊0.33 mg／kg，大黃酚低、中、高劑量組分別予以大黃酚0.007、0.014、0.028 mg／kg，藥物溶于生理鹽水（N， N-二甲基甲酰胺助溶），灌胃給藥體積1 mL／100 g；模型組和正常組均予以等容量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)3 周。

2.3 Morris 水迷宮實驗評價學習、記憶能力 定位航行實驗為在水池邊緣55 cm 處將平臺固定，從4 個不同的方向?qū)⒋笫蠓湃胨?，利用跟蹤系統(tǒng)記錄航行軌跡和時間。在放入水中120 s 內(nèi)大鼠可自由尋找固定平臺，若找到可停留20 s，將大鼠入水后到爬上平臺的時間記為逃避潛伏期（PLA），若120 s 內(nèi)未找到平臺則將PLA 記為120 s，并引導大鼠至平臺停留20 s；空間探索實驗為在完成上述實驗后將平臺撤去，從原入水點放入水中，使其自由游泳120 s，記錄跨越原固定平臺位置的次數(shù)（TCP）。

2.4 大鼠海馬CA1 區(qū)組織病理改變和神經(jīng)元凋亡 采用HE 染色觀察大鼠海馬CA1 區(qū)組織病理改變，大鼠多聚甲醛心臟灌注，取海馬CA1 區(qū)（位于海馬頭部，參照大鼠海馬分區(qū)圖譜精準確定海馬CA1 區(qū)位置）組織，置于冰上操作。多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片（4 μm），60 ℃烘箱過夜，脫蠟至水，HE 染色，脫水后封片，封固，光鏡下觀察；采用TUNEL 法檢測大鼠海馬CA1 區(qū)組織神經(jīng)元凋亡，取海馬CA1 區(qū)組織，切片，常規(guī)脫蠟、脫水，3%過氧化氫溶液室溫處理10 min，消化后加緩沖液、TdT 和DIG-d-UTP 各1 μL，混勻后甩去多余的液體，置于濕盒中37 ℃孵育2 h，加封閉液，室溫30 min，稀釋生物素化抗地高辛抗體，混勻加至切片并置于濕盒中37 ℃孵育30 min，稀釋鏈霉親和素溶液，滴加50 μL 至切片，置于濕盒中37 ℃孵育30 min。加入二氨基聯(lián)苯胺顯色液，蘇木素輕度復染，光鏡下觀察，隨機選5 個不重復視野計算細胞凋亡率。

2.5 RT-qPCR 法檢測大鼠海馬CA1 區(qū)組織JNK、c-JUNmRNA 表達 取海馬CA1 區(qū)組織勻漿研磨，提取總RNA 并鑒定其純度與完整性。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒處理后進行PCR擴增實驗。JNK正向引物 5′-ATTGCTCGATATCGCTA GAGCTAGATCGA-3′，反向引物5′-TGCTCGAGAGACGCGA TAGCTAAACGTA-3′；c-JUN正向引物5′-ATGATATCGCGCG ATAGCTAAGAGCTAGA-3′，反向引物5′-TGTTGCGATATA TAGCGCGATAGCATACG-3′；β-actin正向引物 5′-CTCGCGCGATATAGCTAGAGAGCTATAGC-3′，反向引物5′-TGGTTGGGATAGAAAGCTAGACCGTCAG-3′。用Primer 5.0軟件合成后配置反應體系，共25 μL。擴增反應為94 ℃2 min；94 ℃15 s，55 ℃30 s，68 ℃1 min，55 ℃1 min，35 個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳后采用凝膠電泳成像系統(tǒng)進行半定量分析。

2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測大鼠海馬CA1 區(qū)組織JNK、p-JNK、c-JUN、p-c-JUN、caspase12 蛋白表達 取海馬CA1區(qū)組織，提取總蛋白，定量后取15 μL 上樣，加上樣緩沖液變性，電泳至溴酚藍接近凝膠底部，300 mA 電流濕轉(zhuǎn)1 h，脫脂奶粉常溫封閉1.5 h，加入一抗4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h。顯影，曝光，采用凝膠圖像分析軟件進行半定量分析。

2.7 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，結(jié)果以（）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，每2 樣本比較采用SNK-q檢驗，干預前后比較采用配對t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大黃酚對大鼠學習、記憶能力的影響 60 只大鼠造模成功51只，成功率為85%，隨機分為模型組（10 只）、陽性藥組（11 只）和大黃酚低、中、高劑量組（各10只）。與干預前比較，干預后模型組PLA 延長（P＜0.01），TCP 減少（P＜0.01），陽性藥組和大黃酚各劑量組PLA 均縮短（P＜0.05，P＜0.01），TCP 均增加（P＜0.05，P＜0.01）；干預前，與正常組比較，模型組、陽性藥組和大黃酚各劑量組PLA 均延長（P＜0.01），TCP 均減少（P＜0.01）；干預后，與模型組比較，陽性藥組和大黃酚各劑量組PLA 均縮短（P＜0.01），TCP 均增加（P＜0.01），且呈劑量依賴性，大黃酚中劑量組作用與陽性藥組相當，大黃酚高劑量組作用優(yōu)于陽性藥組，見表1。

表1 各組干預前后學習、記憶能力對比（）

表1 各組干預前后學習、記憶能力對比（）

注：與干預前比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與陽性藥組比較，△P＜0.05。

3.2 大黃酚對大鼠海馬CA1 區(qū)組織病理學變化和細胞凋亡率的影響 正常組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細胞飽滿，形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，細胞核呈正圓形，核仁清晰；模型組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)細胞皺縮嚴重，形態(tài)不規(guī)則，多呈三角錐形，層次紊亂，核固縮、深染，核仁消失，且有嚴重的碎裂、溶解表現(xiàn)；大黃酚低劑量組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)不規(guī)則，有明顯變形，層次紊亂，部分細胞核固縮、深染，核仁消失，且有碎裂、溶解表現(xiàn)；大黃酚中劑量組和陽性藥組大鼠海馬CA1 區(qū)有部分神經(jīng)細胞形態(tài)不規(guī)則，層次紊亂，少量細胞核固縮、深染，核仁不清晰，且有部分碎裂、溶解表現(xiàn)；大黃酚高劑量組大鼠海馬CA1 區(qū)有極少神經(jīng)細胞形態(tài)不規(guī)則，層次紊亂，極少細胞核固縮表現(xiàn)，大多核仁清晰，稍有碎裂、溶解表現(xiàn)，見圖1。

圖1 各組大鼠海馬CA1 區(qū)組織病理學變化（×400）

與正常組比較，模型組大鼠海馬CA1 區(qū)組織細胞凋亡率升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和大黃酚各劑量組海馬CA1 區(qū)組織細胞凋亡率均降低（P＜0.01）；與陽性藥組比較，大黃酚低劑量組海馬CA1 區(qū)組織細胞凋亡率升高，高劑量組細胞凋亡率降低（P＜0.01），見表2、圖2。

表2 各組大鼠海馬CA1 區(qū)組織細胞凋亡率比較（）

表2 各組大鼠海馬CA1 區(qū)組織細胞凋亡率比較（）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與陽性藥組比較，△△P＜0.01。

圖2 各組大鼠海馬CA1 區(qū)細胞凋亡率TUNEL 染色（×200）

3.3 大黃酚對大鼠海 馬 CA1 區(qū)組織JNK、c-JUN、caspase12 mRNA 表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠海馬CA1 區(qū)組織JNK、c-JUN、caspase12 mRNA 表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和大黃酚各劑量組上述mRNA 表達均降低（P＜0.01）；與陽性藥組比較，大黃酚低劑量組大鼠海馬CA1 區(qū)組織上述mRNA 表達降低（P＜0.05），高劑量組上述mRNA 表達升高（P＜0.01），見表3。

表3 各組大鼠海馬CA1 區(qū)組織JNK、 c-JUN、 caspase12 mRNA 表達比較（）

表3 各組大鼠海馬CA1 區(qū)組織JNK、 c-JUN、 caspase12 mRNA 表達比較（）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與陽性藥組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

3.4 大黃酚對大鼠海馬CA1 區(qū)組織JNK、p-JNK、c-JUN、p-c-JUN、caspase12 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠海馬CA1 區(qū)組織JNK、p-JNK、c-JUN、p-c-JUN、caspase12 蛋白表達均升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和大黃酚各劑量組大鼠海馬CA1 區(qū)組織上述蛋白表達均降低（P＜0.05）；與陽性藥組比較，大黃酚低劑量組大鼠海馬CA1 區(qū)組織上述蛋白表達均升高（P＜0.05，P＜0.01），高劑量組上述蛋白表達均降低（P＜0.05，P＜0.01），見表4。

表4 各組大鼠海馬CA1 區(qū)組織JNK、p-JNK、c-JUN、p-c-JUN、caspase12 蛋白表達（）

表4 各組大鼠海馬CA1 區(qū)組織JNK、p-JNK、c-JUN、p-c-JUN、caspase12 蛋白表達（）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與陽性藥組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

4 討論

阿爾茨海默癥的發(fā)病原因和機制目前尚不明確，與遺傳、壞境、年齡增長等有關［8］，可出現(xiàn)進行性加重性認知功能障礙與行為損害，記憶和學習能力受損。在海馬區(qū)頭部組織對各種傷害性刺激較為敏感，即CA1區(qū)，神經(jīng)細胞變性、凋亡與學習和記憶能力減退均有密切關系［9］。因此，在阿爾茨海默癥治療中應積極減輕海馬CA1 區(qū)組織病理損害，減少神經(jīng)細胞凋亡，以改善其學習和記憶能力。

雙側(cè)海馬區(qū)注入Aβ1-42是目前常用的阿爾茨海默癥大鼠造模方法，該方法建模的成功率并不高，本研究中阿爾茨海默癥建模成功率為85.00%，與既往報道相符［10］。大黃酚有抗菌、消炎、止咳、促進腸道運動、增強神經(jīng)興奮性、抑制黑色素瘤生長等［11-12］。干預后模型組大鼠學習、記憶能力指標均惡化，陽性藥組和大黃酚各劑量組均較干預前改善，且干預后均優(yōu)于模型組，高劑量組作用最佳，提示大黃酚和多奈哌齊均可改善阿爾茨海默癥大鼠的學習、記憶能力，且高劑量大黃酚作用更為理想。陽性藥組和大黃酚各劑量組大鼠海馬CA1 區(qū)病理改變均較模型組減輕，且高劑量組與正常組較為接近；陽性藥組和大黃酚各劑量組細胞凋亡率均下降，且高劑量組與正常組最為接近，表明大黃酚和多奈哌齊還可減輕阿爾茨海默癥大鼠海馬CA1 區(qū)組織病變，減少細胞凋亡，且高劑量大黃酚的效果最為理想。

JNK 與腦內(nèi)長時程增強效應的形成及學習、記憶能力的維持和改變均有重要的關聯(lián)［13-14］。在某種傷害性因素刺激下，如Aβ1-42在海馬區(qū)沉積，JNK 可被激活，其磷酸化水平升高，調(diào)控神經(jīng)細胞的增殖、分化和凋亡，誘導細胞凋亡，導致機體學習、記憶能力減退［15］。JNK 通路下游的分子c-JUN 也被激活，其基因和蛋白表達增強，磷酸化水平也升高，可協(xié)同JNK 誘導神經(jīng)細胞凋亡，可對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不可逆的傷害，誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?6］。caspase12 屬于真核細胞凋亡調(diào)控基因的重要組成部分，可參與細胞的生長、分化與凋亡調(diào)節(jié)。caspase12 位于JNK 信號通路的下游，與細胞凋亡程度呈正相關，可參與細胞內(nèi)重要蛋白質(zhì)合成折疊環(huán)境的調(diào)控，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性［17］。對阿爾茨海默癥大鼠予以有效措施抑制JNK 通路信號的傳導，可降低JNK、c-JUN、caspase12 基因與蛋白表達，下調(diào)其磷酸化水平，減少海馬組織神經(jīng)細胞凋亡［18］，提示可將JNK 信號通路作為阿爾茨海默癥治療的作用靶點。模型組大鼠海馬CA1 區(qū)組織JNK、c-JUN、caspase12 mRNA與蛋白表達及p-JNK、p-c-JUN 蛋白表達均高于正常組；陽性藥組和大黃酚各劑量組上述指標均低于模型組；且低劑量組上述指標均高于陽性藥組；高劑量組上述指標均低于陽性藥組，提示大黃酚和多奈哌齊均可抑制阿爾茨海默癥大鼠海馬組織CA1 區(qū)JNK 信號通路的激活，抑制JNK、c-JUN 和caspase12 mRNA 與蛋白表達及p-JNK、p-c-JUN 蛋白表達，且大黃酚的作用呈劑量依賴性。綜上所述，大黃酚和多奈哌齊均可改善阿爾茨海默癥大鼠的學習和記憶能力，減輕海馬組織CA 區(qū)病理損傷，減少神經(jīng)細胞凋亡，可能是通過抑制JNK 信號通路激活。此外，大黃酚的作用劑量依賴性，高劑量大黃酚的作用優(yōu)于多奈哌齊。