周恒曹依敏陳銘蘭嵐孫健毛秀紅季申

（上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203）

坤寶丸是由酒女貞子、覆盆子、麥冬等23 味藥材組成的中藥復(fù)方制劑，具有滋補(bǔ)肝腎、鎮(zhèn)靜安神等功效，臨床上對婦女絕經(jīng)前后及更年期綜合征有較好的療效［1-4］。麥冬是坤寶丸主要藥味，但山麥冬性狀與其相似，導(dǎo)致長期以來在中藥材市場上存在山麥冬代替麥冬的現(xiàn)象。文獻(xiàn)［5-11］報道，甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B 等高異黃酮是麥冬特征成分，而山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 分別是山麥冬2 個基原藥材湖北麥冬、短葶山麥冬特征成分，上述化合物均可作為檢測指標(biāo)用于區(qū)分麥冬和山麥冬，近幾年來也逐步應(yīng)用于含麥冬制劑中山麥冬摻偽的篩查［12-13］。

由于麥冬處方量在坤寶丸中不足2%，故需要建立靈敏準(zhǔn)確的方法對該藥材及其摻偽品山麥冬進(jìn)行分析，但傳統(tǒng)的TLC 法、HPLC-ELDS 法由于靈敏度不足，專屬性不強(qiáng)，均無法滿足檢測要求［14-15］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS／MS）法測定坤寶丸中麥冬及其摻偽品中甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B，山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 這4 種特征成分的含量，以期實(shí)現(xiàn)對該制劑中正品麥冬的質(zhì)量控制，也可對制劑中是否存在山麥冬摻偽麥冬投料進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。

1 材料

Agilent 1290 型超高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Triple Quad 6500 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配置MultiQuant 數(shù)據(jù)處理軟件、電噴霧源（美國AB SCIEX 公司）；BP211D、CP224S 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；Centrifuge 5810R 型離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；Mikro 200R 型高速冷凍離心機(jī)（德國Hettich 公司）；Elmasonic E300H 型超聲波清洗儀（德國Elma 公司）；Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（美國Milipore 公司）；Multivap 113型氮?dú)獯蹈蓛x（美國Organomation 公司）。甲基麥冬黃烷酮A（批 號Z11N8X48156）、甲基麥冬黃烷酮B（批 號Y25A10L86868）對照品均購自上海源葉生物科技有限公司；山麥冬皂苷B（批號111907-201001）、短葶山麥冬皂苷C（批號111908-201001）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。坤寶丸共179批，均為市售品，具體信息見表1。色譜純甲醇、乙腈（德國Merck 公司）；色譜純甲酸（美國Fisher Scientific 公司）。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度 洗脫，程序見表2；體積流量0.4 mL／min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

表2 梯度洗脫程序

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧（ESI）離子源，正負(fù)離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；電噴霧電壓5 500 V（正離子）、-4 500 V（負(fù)離子）；離子源溫度500 ℃；氣簾氣（CUR）20.0 psi（1 psi ＝6.895 kPa）；碰撞氣（CAD）7.0 psi；霧化氣（氮?dú)猓?0.0 psi；輔助氣50.0 psi；射入電壓（EP）10 V；射出電壓（CXP）15 V。其他參數(shù)見表3。

表3 各成分質(zhì)譜參數(shù)

2.3 溶液制備

2.3.1 對照品溶液 精密稱取各對照品，70%甲醇制成每1 mL 含山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C、甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B 各1 mg 的貯備液，精密量取適量，70%甲醇定容至100 mL，制成1 000 ng／mL 溶液，依次稀釋至5、10、50、100、200、400 ng／mL，即得，在4 ℃下保存。

2.3.2 供試品溶液 精密稱取本品粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入70% 甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（250 W、40 kHz）處理120 min，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，4 000 r／min 離心5 min，取上清液1 mL，14 000 r／min 離心5 min，取上清液，即得。

2.3.3 陰性樣品溶液 按處方配比，制得缺麥冬的陰性樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分MRM 離子流圖

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下不同質(zhì)量濃度對照品溶液各5 μL，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表4，可知各成分在5～400 ng／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表4 各成分線性關(guān)系

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取50 ng／mL 對照品溶液5 μL，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定6次，測得山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C、甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B 峰面積RSD 分別為2.8%、2.6%、2.2%、1.9%，表明儀器精密度較好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（85 號）粉末0.5 g，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，測得山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷含量RSD 分別為4.2%、3.6%；取本品（10 號）粉末0.5 g，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，測得甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B 含量RSD 分別為5.1%、3.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取陰性樣品0.5 g，共9份，置于具塞錐形瓶中，加入低、中、高水平（2.5、5、10 μg／g）對照品溶液，每個水平3份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C、甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B 平均加樣回收率分別為108.6%、105.0%、91.2%、91.3%，RSD 分別為4.5%、4.0%、4.6%、4.5%。

2.5.5 基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn) 取陰性樣品0.5 g，共6份，按

“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，氮吹儀上40 ℃水浴濃縮至約0.4 mL，分別加入100 ng／mL 對照品溶液50、100 μL，1 000 ng／mL 對照品溶液50、100、200、400 μL，70%甲醇定容至1 mL，渦旋混勻，14 000 r／min 離心5 min，取上清液，即得基質(zhì)對照品溶液（5、10、50、100、200、400 ng／mL），分別精密吸取5 μL，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行回歸，計算斜率，測定基質(zhì)效應(yīng)，公式為基質(zhì)效應(yīng)＝ ［（基質(zhì)匹配回歸方程斜率／溶劑回歸方程斜率）-1］×100%。結(jié)果，山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C、甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B 基質(zhì)效應(yīng)分別為-2%、4%、12%、11%，均不明顯［16-17］，表明可采用溶劑回歸方程代替基質(zhì)匹配回歸方程來進(jìn)行定量分析。

2.5.6 檢出限考察 檢出限以基質(zhì)對照品溶液的最低濃度值（LCL）為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計算，測得山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C、甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B 檢出限均為0.25 μg／g。

2.6 樣品含量測定 取179 批樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批2份，在“2.1”“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測定，計算含量，結(jié)果見表5。由此可知，53 批檢出山麥冬皂苷B，58 批檢出短葶山麥冬皂苷C，8 批同時檢出山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C，其余60 批僅檢出甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B。另外，在檢出山麥冬皂苷B 或短葶山麥冬皂苷C 的119 批樣品中，有8 批也同時檢出甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B。

表5 各成分含量測定結(jié)果（μg／g）

3 討論

3.1 麥冬特征成分選擇 談夢霞等［9］通過PLS-DA 發(fā)現(xiàn)，與山麥冬比較，麥冬中賴氨酸、精氨酸、纈氨酸、麥冬皂苷D、甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B 含量較高，可作為兩者差異成分；本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B 比較，相同質(zhì)量濃度的麥冬皂苷D 對照品溶液在質(zhì)譜中的響應(yīng)要低100～300倍，而且在麥冬、山麥冬中的含量差異也更小，故以麥冬皂苷D 為麥冬特征成分可能會造成誤判。另外，坤寶丸藥味復(fù)雜，賴氨酸、精氨酸、纈氨酸等氨基酸的專屬性較差，也無法用于麥冬、山麥冬的區(qū)分鑒定，故最終選擇甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B 作為麥冬特征成分。

3.2 結(jié)果分析 179 批坤寶丸中有119 批檢出山麥冬特征成分，占總量的66.5%，表明麥冬與山麥冬混用現(xiàn)象較為普遍，但2015 年版《中國藥典》 暫未對坤寶丸中麥冬成分設(shè)置質(zhì)控項(xiàng)目，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有待修訂完善。文獻(xiàn)［6］報道，湖北麥冬中山麥冬皂苷B 含量為80～150 μg／g，而其須根中該成分含量達(dá)1 090～2 830 μg／g。假設(shè)坤寶丸完全使用湖北麥冬投料，以處方量占比2%計算，則山麥冬皂苷B 含量應(yīng)大致為1.6～3.0 μg／g，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分樣品中該成分實(shí)際含量明顯超出了這一范圍，推測可能存在湖北麥冬須根投料的情況，需引起關(guān)注。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立UHPLC-MS／MS 法測定坤寶丸中麥冬及其摻偽品的4 種特征成分含量，該方法樣品前處理快速簡便，檢測靈敏度較高，準(zhǔn)確度良好，可為該制劑質(zhì)量控制提供可靠的分析手段和參考依據(jù)。