王靜丁海燕

（大理大學公共衛(wèi)生學院，云南 大理671000）

從中藥中提取的多種天然化合物，如酚酸類［1-3］、黃酮類［4-5］、多糖類［6-7］、揮發(fā)油類［8-9］等，已被證實具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗癌等作用［10］。目前，由于抗生素的濫用，細菌耐藥已成為中國乃至全球性問題，尋找低毒高效的天然抗菌物質迫在眉睫［11］。其中，黃酮類、多糖、揮發(fā)油類等化合物在抑菌方面的文獻報道比較豐富完整，酚酸類化合物在抑菌方面的研究繁雜且較為分散［12］，無完整的體系，因此，本文對酚酸類化合物的來源、分類、抑菌作用以及對致病菌抑菌機制進行綜述，以期為酚酸類物質的研究開發(fā)提供科學的參考依據(jù)。

1 來源及分類

1.1 來源 天然酚酸類化合物作為植物中一類天然活性產物，其生物合成主要包括2 條代謝途徑，即莽草酸代謝途徑和苯丙烷代謝途徑，見圖1［3，13］。其中，莽草酸途徑合成的沒食子酸是最為常見的酚酸類物質，磷酸烯醇式丙酮酸和赤蘚糖-4-磷酸作為糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑的產物，結合并經過多步代謝過程最終轉化為沒食子酸［14］；而其余大多數(shù)酚酸類物質，如咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、對香豆酸等，可在關鍵酶苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶、4-香豆酰輔酶A 連接酶的作用下經苯丙烷代謝途徑合成［15］。除上述2 種途徑外，鄰羥基苯甲酸可將莽草酸途徑的產物分支酸，在丙酮酸裂解酶和異分支酸和酶的催化作用下合成；對羥基苯甲酸則可通過對羥基肉桂酸類酚酸及類黃酮等物質降解生成［16］。

圖1 酚酸生物合成途徑

1.2 分類

1.2.1 苯甲酸型 大多數(shù)酚酸類化合物是以苯甲酸為母核的C6-C1型化合物，如對羥基苯甲酸［17-18］、沒食子酸、香草酸［19］、原兒茶酸［20］等，見圖2、表1。

圖2 苯甲酸型酚酸類化合物結構式

表1 苯甲酸型酚酸類化合物

1.2.2 苯乙酸型 目前，針對苯乙酸型酚酸類化合物研究較少，其中從連翹中分離得到的對羥基苯乙酸、對羥基苯乙醇、3，4-二羥基苯乙醇、對甲氧基苯乙醛等均屬于苯乙酸型酚酸類化合物［18］，見圖3、表2。

圖3 苯乙酸型酚酸類化合物結構式

表2 苯乙酸型酚酸類化合物

1.2.3 肉桂酸型 肉桂酸型酚酸類化合物以苯丙酸類為主，包括簡單苯丙酸、苯丙酸苷類、苯丙酸聚合體等［19］。目前，以肉桂酸為母核的C6-C3型酚酸類化合物較為常見，如咖啡酸、芥子酸、對香豆酸、阿魏酸等［10］，見圖4、表3。

圖4 肉桂酸型酚酸類化合物結構式

表3 肉桂酸型酚酸類化合物

1.2.4 酚酸類衍生物 除上述酚酸類化合物外，多數(shù)酚酸類化合物屬于復雜的酚酸類衍生物［12］，它們產生的原因是酚酸類化合物中存在多個活性基團，如酚羥基、羧基、苯環(huán)、烯鍵等，多個活性基團之間相互作用生成復雜的酚酸衍生物，包括沒食子酸類衍生物、間苯三酚類化合物、丹酚酸類化合物、綠原酸及奎寧酸類衍生物、茶多酚化合物、鞣花酸鞣質、聚黃烷醇多酚、苯丙素類化合物等［21］。目前研究較多的植物酚酸類衍生物有松蘿酸［22］、綠原酸［23］、丹酚酸［24］等。其中，綠原酸是一種苯丙素類化合物，主要由咖啡酸的羧基和奎尼酸的羥基縮合形成的縮酚酸類化合物［25］。丹酚酸A 則是由是由1 分子丹參素與2 分子咖啡酸縮合而成，丹酚酸B 由3 分子丹參素與1 分子咖啡酸縮合而成［26］，見圖5、表4。

表4 酚酸類衍生物

圖5 酚酸類衍生物結構式

2 抑菌作用

研究發(fā)現(xiàn)，酚酸類化合物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抑菌等作用［27-28］。其中，阿魏酸可通過介導ERK 信號通路來抑制炎癥因子水平，進而達到抗炎作用；而綠原酸則可通過降低iNOS 活性及抑制COX-2 蛋白表達來抑制脊髓損傷模型大鼠的炎癥反應［29-30］。沒食子酸、原兒茶酸、阿魏酸、咖啡酸、綠原酸等酚酸類化合物均可通過清除細胞內活性氧自由基和脂質過氧化物的積累、調控活性氧代謝過程關鍵酶活性等發(fā)揮抗氧化作用，且其酚羥基數(shù)量越多，抗氧化活性越強［31-33］。另有文獻指出，沒食子酸、綠原酸、咖啡酸及其衍生物等酚酸類化合物可通過保護細胞、調控相關凋亡基因表達起到抗腫瘤作用［34-35］。除上述作用外，研究發(fā)現(xiàn)，該類化合物在抑制病原微生物的生長方面也起著不可或缺的作用，因此，從植物中獲得的酚酸類化合物為解決抗生素的強耐藥性及亟待尋找天然新型抗菌化合物提供了新的思路［36］。

酚酸類化合物對革蘭氏陽性菌、陰性菌以及真菌均有一定的抑制作用。研究證實，沒食子酸、藜蘆酸葡萄糖酯對金黃色葡萄球菌均有較好的抑菌活性［37-38］。此外，酚酸類化合物的衍生物如沒食子酸丁酯、咖啡酸1，1-二甲基烯丙基酯等對單增李斯特菌同樣具備良好的抑菌效果［39］。張忠斌等［40］通過改良石硫法獲得的酚酸類提取物，對枯草芽孢桿菌具有較強的抑菌活性。目前，因抗生素的不合理使用出現(xiàn)了各種耐藥性細菌，研究發(fā)現(xiàn)，天然酚酸類化合物如原兒茶酸、對香豆酸、香草酸、咖啡酸等對耐藥性細菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均具有較強的抑菌活性［41］。另外，沒食子酸對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌等革蘭氏陰性致病菌也具有較好的抑菌效果［1，42］。朱金帥等［43］通過比較沒食子酸、原兒茶酸、綠原酸對水產品中的腐敗希瓦氏菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)3 個酚酸類化合物對該菌均具有較好的抑制效果，其中，沒食子酸的抑菌效果最強，該研究不僅為植物源性抗生素的制備指明了方向，同時也開拓了食品在保鮮防腐以及護膚品研制等方面的研究。酚酸類化合物除對細菌有抑菌活性外，對真菌也有一定的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，經綠原酸處理后的獼猴桃、櫻桃番茄等受病原真菌擬莖點霉、白地霉、灰霉的損害程度降低，提示酚酸類化合物對真菌擁有較好抑制效果［44］。另外，從果梅果實中分離得到的酚酸類化合物對瘡痂病菌、蘋果輪紋病菌、草莓炭疽病菌、辣椒疫霉病菌、馬鈴薯干腐病菌、禾谷鐮孢菌等6 種植物源真菌均有不同程度的抑制作用［45］。

酚酸類化合物產生抑菌活性是多種因素共同作用的結果，包括酚酸類化合物不同的骨架構型，其核心苯環(huán)中飽和鏈長短、位置及取代數(shù)等，另外，酚酸類化合物的低聚物較其單體類化合物抑菌效果更好［3，46］。酚酸類化合物中羥基和甲氧基官能團的數(shù)量不同也會影響其抗菌活性，Sanchez-Maldonado等［47］通過研究6 種不同苯甲酸以及6 種不同肉桂酸的構效關系發(fā)現(xiàn)，酚酸類化合物的抑菌活性與pH 值也有一定的關系且肉桂酸型酚酸的抗菌活性強于苯甲酸型酚酸，而苯甲酸型酚酸的抗菌活性又與羥基數(shù)目呈負相關，與甲氧基官能團的數(shù)目呈正相關，對肉桂酸型酚酸影響不大。另外，研究表明，羥基肉桂酸抗菌活性受其雙鍵的影響，雙鍵數(shù)目減少其抗菌活性降低［48］。除此之外，酚酸之間還具有一定協(xié)同效應，崔收慶［49］發(fā)現(xiàn)，秸稈酚酸中發(fā)揮抑菌活性的主要為香豆酸和阿魏酸，在測量抑菌濃度時發(fā)現(xiàn)，與單獨使用香豆酸及阿魏酸相比，秸稈酚酸最小抑菌濃度降低了1.5～3倍，提示兩者具有協(xié)同效應。目前，有關酚酸類化合物之間是否存在協(xié)同效應的報道較少，有待進一步研究論證。

3 抑菌機制

目前，對酚酸類化合物抑菌機制的研究主要集中在對菌體包被結構的作用、抑制細菌蛋白質及核酸的合成、抑制微生物生理代謝活性等方面，通過研究其作用方式及位點，進一步分析其作用機制［50］。另外，上述方面雖然在一定程度上揭示了抗菌活性化合物的作用模式，但其機制研究并不系統(tǒng)深入，因此還可在其他方面進行更深一步的探索，如螯合金屬離子、抑制多藥外排系統(tǒng)、增強機體免疫力等，故本文從以上方面對酚酸類化合物的抑菌機制進行論述，以期為酚酸類化合物抑菌機制的探明提供思路［51-52］。

3.1 對菌體包被結構的作用 菌體的包被結構作為天然保護屏障發(fā)揮著不可或缺的作用，因此，多數(shù)研究從抑制細胞壁的合成、增強胞膜通透性、抑制生物被膜的形成等方面對酚酸類化合物的抑菌機制進行分析［53-54］。堿性磷酸酶作為細胞壁檢測的常用指標，主要存在于細胞壁膜之間，在微生物正常狀態(tài)下無法在胞外檢測到其活性［55］。然而，經阿魏酸處理后的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌胞外可檢測到堿性磷酸酶，說明阿魏酸可能通過抑制細菌細胞壁中肽聚糖的合成，致使其細胞壁降解進而使細菌失去屏障保護功能，破壞細胞壁的完整性，從而影響細菌正常形態(tài)［56-57］。蘇萌萌等［58］在研究綠原酸對熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌抑菌機制時從膜電位變化、掃描電鏡下菌體形態(tài)變化、處理后胞外ATP 與蛋白質濃度變化等方面著手，發(fā)現(xiàn)經綠原酸處理后，diSC3（5）熒光量增加，掃描電鏡下大多數(shù)菌體扁平、色澤暗淡，菌體變形嚴重，出現(xiàn)孔洞，胞外ATP與蛋白質等大分子化合物質量濃度增加，且作用時間越長菌體變化越明顯，說明綠原酸可通過作用于細胞膜，使其通透性發(fā)生改變，進而破壞細菌正常形態(tài)，最終影響其正常的生理功能。另外，作為細菌保護屏障的生物被膜，菌體包被結構主要是通過黏附于宿主表面，分泌胞外大分子化合物并將其包繞形成微生物群來發(fā)揮作用［59］，而酚酸類化合物則主要通過破環(huán)其保護屏障達到抑菌效果。劉美慧［38］發(fā)現(xiàn)沒食子酸則主要通過抑制細菌生物膜中胞外多糖的合成致使生物膜形成被抑制，進而達到抑菌效果。細菌細胞形態(tài)層面是酚酸類化合物抑菌機制研究的基礎，其中酚酸類化合物是通過何種具體機制，包括阻礙細菌包被結構的合成或是將其破壞產生孔洞等作用情況尚未可知，因此，針對酚酸類化合物細胞層面的抑菌機制還有待進一步研究探討。

3.2 抑制微生物生理代謝活性 微生物體內非特異性酶類的活性變化對微生物生長代謝會造成一定影響，如β-半乳糖苷酶雖然主要反映膜通透性改變，但因細菌本身是一個整體，細胞包被結構出現(xiàn)問題，同時也會影響其他層面［60］。研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸通過改變細胞膜的通透性，致使胞內酶β-半乳糖苷酶漏出率升高，其分子機制主要與其代謝過程中蛋白質、還原糖、丙酮的水平有關，進而阻礙菌株的能量代謝及蛋白質合成，達到抑菌的作用［61］。另外，Su等［62］研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸能使銅綠性假單胞菌P1 細胞的內膜滲透性升高、外膜剝落、脂多糖生物合成中基因表達降低，進而對銅綠假單胞菌P1 細胞內代謝產生干擾，致使菌體死亡。植物多酚可通過抑制ATP 的合成而降低胞內ATP 水平，從而抑制其能量代謝，進而導致細菌死亡［63］。Di Pasqua等［64］研究發(fā)現(xiàn)，百里香酚能夠通過抑制沙門桿菌蛋白質的合成，阻斷了三羧酸循環(huán)途徑，進而導致能量代謝受阻而發(fā)揮作用。香豆素對細菌的呼吸速率有一定抑制作用，其可通過減少細菌能量的利用，進而達到抑菌效果［39］，但目前酚酸類化合物在抑制細菌能量代謝機制方面的研究尚淺，有待進一步研究。

3.3 抑制細菌蛋白質及核酸的合成 遺傳物質承擔著親代與子代之間傳遞遺傳信息、指導蛋白質合成等作用，控制著細胞的生長發(fā)育，具有較好的穩(wěn)定性，是一切細胞的基本組成成分［65］，而這個過程相輔相成，最終實現(xiàn)抑菌的效果。因此，通過影響細胞膜通透性以及能量代謝過程，會使得細菌DNA 復制和蛋白質合成受阻，進而造成細胞死亡。迷迭香提取物會影響細菌細胞膜的通透性，進而干擾DNA 復制和蛋白質代謝，造成細菌代謝發(fā)生紊亂，從而發(fā)揮一定的抑菌作用［66］。Ulanowska等［67］研究發(fā)現(xiàn)，植物多酚類化合物能通過夠干擾DNA 和RNA 的合成，降低細胞遺傳化合物的表達，從而起到抑菌作用。DNA 旋轉酶是主要負責DNA 的合成、復制及修復和轉錄等過程，而多酚類化合物則可通過降低DNA 旋轉酶的活性，進而使DNA 合成受阻［53］。Chung等［68］研究發(fā)現(xiàn)，多酚類化合物對大腸桿菌的抑制作用主要體現(xiàn)在影響DNA 修復過程，從而達到抑菌效果。目前，酚酸類化合物對菌體蛋白質抑制及核酸合成等方面的抑菌機制的文獻報道較少，而多酚類化合物研究相對較多，因此為酚酸類化合物機制的研究拓寬了方向。

3.4 螯合金屬離子 除上述一些非特異性因素影響外，酚酸類化合物還可在以下特異性因素的影響下發(fā)揮作用。包括微生物在內的生物系統(tǒng)均高度依賴于環(huán)境中的金屬離子，酚酸類化合物中鞣質產生抑菌作用的機制為鰲合環(huán)境中鐵消耗引起的抗菌活性［52，69］。Bag等［70］也發(fā)現(xiàn)，沒食子鞣質可通過螯合環(huán)境中鐵的消耗來抑制大腸桿菌的生長。其中，酚酸類化合物因富含多種帶有羥基、酚羥基類的官能團，可以通過消耗螯合微生物體內金屬離子，進而抑制微生物代謝。

3.5 抑制多藥外排系統(tǒng) 細菌的外排泵是細菌細胞膜上的一類蛋白質成分，其主要功能為將進入細胞內的藥物選擇性或非選擇性地泵出體外，從而使得進入細胞內的抗菌藥物濃度降低，進而導致細菌產生耐藥性［71］。目前，對細菌外排泵Nor A、Tet K、MRS 等研究較多，Nor A 泵屬于主要協(xié)同轉運蛋白家族，其主要作用是將喹諾酮類、維拉帕米等藥物以及溴化乙啶等泵出，研究發(fā)現(xiàn)，沒食子酸在亞抑制濃度下對Nor A 外排泵有抑制作用，因此將沒食子酸與喹諾酮等類型抗生素同時應用，可增強其抗菌效果［72］。目前，該作用模式的相關研究較少，需進一步研究。

3.6 增強機體免疫力 免疫系統(tǒng)是抵御感染的天然屏障，酚酸類化合物或可作為良好的免疫激動劑，在機體抗細菌感染方面發(fā)揮重要作用［52，73］。Reyes等［74］在研究單寧衍生物對腸道鼠傷寒沙門氏菌感染的體外和體內保護作用時發(fā)現(xiàn)，給藥后小鼠脾臟和肝臟中的細菌數(shù)量減少，表明沒食子酸和鞣酸對沙門氏菌有一定的抑制作用，其機制可能主要與抑制巨噬細胞中病原體的侵襲和細胞內生長有關。因此，酚酸類化合物是否可通過增強機體免疫力來發(fā)揮抗菌作用有待進一步佐證。

4 展望

近年來，天然酚酸類化合物的抑菌活性已被證實并廣泛應用于抗生素的制備、食品保鮮以及護膚品的研制等方面，應用前景廣闊。然而，對酚酸類化合物的化學結構類型及其生物活性之間的關聯(lián)性探索、不同種類酚酸化合物之間以及酚酸類化合物與抗生素之間是否存在協(xié)同作用研究較少，仍處于初步階段。雖然酚酸類化合物的抑菌作用機制在細胞形態(tài)學上研究較為深入，但體現(xiàn)在何種具體機制上有待進一步佐證，另外，能量代謝、蛋白質、核酸分子層面研究相對薄弱，需繼續(xù)研究填補相應空白。在抑菌機制的研究方面，常用抗生素的抗菌作用機制或可為酚酸類化合物機制的研究拓寬新的思路，例如與特定靶標蛋白結合或從抑制細菌核糖體蛋白質的合成以及抑制作為核酸合成原料的葉酸合成等途徑來展開研究。目前，課題組主要從事雪地茶抗菌試驗工作，并明確了雪地茶醇提物對多種致病菌具有較好的抗菌活性，主要包括金黃色葡萄球菌、表面葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌，甲型副傷寒桿菌、乙型副傷寒桿菌等革蘭氏陰性菌以及白色念珠菌等致病真菌，且其抑菌活性呈濃度依賴性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，雪地茶甲醇提取物可通過破壞致病菌包被結構導致菌體內容物外泄、絡合微生物胞內Fe3＋等方式作用于病原微生物，并測得甲醇提取物中的主要成分為酚酸及縮酚酸類化合物，而這些化合物主要為雪地茶的次生代謝產物，故下一步將開展以抗菌為指導的雪地茶酚酸類化合物的提取、分離純化及鑒定，在獲得單體化合物后，進行不同層面的抑菌機制試驗研究，以期為酚酸類化合物的開發(fā)及利用提供有益的參考。