江美芳張艷欣王丹丹高崎

（上海上藥杏靈科技藥業(yè)股份有限公司，上海200120）

銀杏葉為銀杏科銀杏屬植物銀杏Ginkgo bilobaL.的干燥葉，是我國特有品種，主產(chǎn)區(qū)有江蘇、山東、四川等地，不同產(chǎn)區(qū)環(huán)境不同，銀杏葉化學成分存在差異，品質不一。自20 世紀60 年代起，國內外對銀杏的化學成分、藥理活性及臨床應用進行研究［1-7］。銀杏葉提取物由銀杏的干燥葉經(jīng)提取加工制成，具有抗氧化、抗疲勞、擴張血管等作用［8-10］，對治療動脈粥樣硬化、高血壓、腦功能障礙等具有顯著療效［10-11］。銀杏酮酯是銀杏葉中的主要藥效成分高度富集提取物［12］。本實驗通過收集不同產(chǎn)地、采收期的苗圃銀杏葉，基于UPLC-QTOF-MS／MS 技術，建立同時測定銀杏葉中成分含量方法，全面表征不同產(chǎn)地銀杏葉品質特征。

化學成分是藥用植物在長期進化中與環(huán)境相互作用的結果［13］；土壤是藥用植物賴以生存和發(fā)展的物質基礎，土壤因子是藥用植物生長的主要環(huán)境因子［14］，土壤理化指標含量會直接影響藥用植物化學成分的含量［15］。因此，開展土壤因子與藥用植物有效成分含量關聯(lián)性研究，科學控制土壤條件，為合理規(guī)劃栽培優(yōu)質藥用銀杏葉提供數(shù)據(jù)支撐，為高品質銀杏葉制劑優(yōu)選原藥材提供科學指導。

1 材料

1.1 藥材 收集32 個采樣點2019 年采收期（7 月）的銀杏葉，經(jīng)專家鑒定為銀杏科銀杏屬植物銀杏Ginkgo bilobaL.的干燥葉。其中，采樣點S1～S13 位于四川都江堰，S14～S20 位于山東平邑，S21～S32 位于上海崇明。于2019 年7月，采用五點法挖取四川都江堰、山東平邑、上海崇明銀杏葉采樣點S2、S8、S12、S13、S14、S16、S19、S21、S24、S27、S29 處40 cm 左右深的土壤，混合均勻，編號同銀杏葉。

1.2 試劑 銀杏內酯A（批號W25A7K13730）、銀杏內酯B（批號D15D8G50608）、銀杏內酯C（批 號 C28S6G3986 ）、白果內酯（批 號P08J9F52398）、銀杏內酯J（批號D29J9G53845）、蘆?。ㄅ朰16M9S61523）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批 號 Y15N8H48277 ）、碟豆素（批 號M13J10S90494）、槲皮素3-O-葡萄糖基（1-2）鼠李糖苷（批號M13J10S90493）、水仙苷（批號S08A8D33447）、3-O｛2-O-［6-O（β 羥基-反-香豆酰）-葡萄糖基］-鼠李糖基｝ 山柰酚（批號M13J10S90492）、3-O｛2-O-［6-O（β 羥基-反-香豆酰）-葡萄糖基］-鼠李糖基｝ 槲皮素（批號M13J10S90491）、銀杏雙黃酮（批 號 GR-133-150405）、金松雙黃酮（批號P03M9F55041）、白果雙黃酮（批號Y15J9L63710）、銀杏酸C17∶1（批號Y18J10H73680）、銀杏酸C13∶ 0（批號P11D8F50448 ）、D-（-）奎寧酸（批 號A06N11L130218）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司；穗花杉雙黃酮（批號10412）、銀杏酸C15∶1（批號1130）、原兒茶酸（批號5668）、莽草酸（批號863）對照品均購于上海詩丹徳生物技術有限公司。甲醇、乙醇、甲酸為色譜純，均來自德國Fisher 公司；水為去離子水。

1.3 儀器 Xevo G2-XS Q-TOF 飛行時間質譜儀（美國Waters 公司）；BS124S 電子分析天平、SQPQUINTIX65-1CN 電子分析天平（十萬分之一）（德國賽多利斯公司）；SF-TGL-16M 離心機（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Direct-Q 3UV 型超純水機（美國Millipore 公司）；FE28 PH計（瑞士梅特勒-托利多公司）；Cary 3500 紫外分光光度計、240FS AA 原子吸收分光光度計（美國安捷倫公司）；PANalytical Axios PW4400 X 射線熒光光譜儀（荷蘭帕納科公司）。

2 方法

2.1 銀杏葉主要成分含量測定

2.1.1 分析條件 Waters ACQUITY UPLC C18色譜柱（50 mm × 2.1 mm，1.7 μm）；流動相水（0.05%甲酸）（A）-甲醇（含0.05%甲酸）（B），梯度洗脫（0～1 min，98%A；1～13.5 min，98%～2% A；13.5～16.5 min，2% A；16.5～20 min，2%～98%A）；體積流量0.4 mL／min；柱溫40 ℃；檢測波長360 nm；進樣量5 μL。在負離子條件下采用Sensitivity 模式；掃描時間20 min；毛細管電壓-2.5 kV；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣體積流量800 L／h，溫度450 ℃；錐孔電壓40 V。

2.1.2 內標、對照品溶液的制備

2.1.2.1 內標溶液 精密稱取內標（格列本脲）2.00 mg至2 mL 量瓶中，甲醇定容，制成1.00 mg／mL貯備液，在-20 ℃下冷凍保存。準確移取500 μL至50 mL 量瓶中，分別用50% 甲醇、乙醇定容，制成10.00 μg／mL，即得，在-20 ℃下冷凍保存。

2.1.2.2 對照品溶液 精密稱取白果內酯、銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、銀杏內酯J、總內酯、水仙苷、碟豆素、3-O｛2-O-［6-O（β 羥基-反-香豆酰）-葡萄糖基］-鼠李糖基｝ 山柰酚、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、蘆丁、槲皮素3-O-葡萄糖基（1-2）鼠李糖苷、3-O｛2-O-［6-O（β 羥基-反-香豆酰）-葡萄糖基］-鼠李糖基｝ 槲皮素、總黃酮醇苷、穗花杉雙黃酮、金松雙黃酮、白果雙黃酮、銀杏雙黃酮、總雙黃酮、D-（-）奎寧酸、莽草酸、原兒茶酸、總有機酸、銀杏酸C13∶0、銀杏酸C15∶1、銀杏酸C17∶1、總烷基酚對照品，50%甲醇制成質量濃度分別為9.89、14.46、9.28、4.71、21.19、8.91、5.89、6.21、5.91、6.85、15.90、16.34、9.84、4.07、8.04、9.51、179.68、90.97、16.11、41.10、2.02、97.50 μg／mL 的貯備液，稀釋成不同質量濃度，加入10.00 μg／mL 內標溶液500 μL，定容至10 mL 量瓶中，即得。

2.1.3 供試品溶液制備

2.1.3.1 雙黃酮類、烷基酚類成分（前處理1）取藥材適量，粉碎后過4 號篩，精密稱取粉末0.1 g，5 mL 乙醇超聲提取10 min，3 000 r／min 離心10 min，吸取上清液，重復3次，合并上清液，加入10 μg／mL 內標溶液500 μL，定容至25 mL 量瓶中，即得，離心后進樣分析。

2.1.3.2 萜內酯類、黃酮醇苷類、有機酸類成分（前處理2）取藥材適量，粉碎后過4 號篩，精密稱取粉末0.1 g，5 mL50%甲醇超聲提取10 min，3 000 r／min 下離心10 min，吸取上清液，重復3次，合并上清液，加入10 μg／mL 內標溶液500 μL，定容至25 mL 量瓶中，即得，離心后進樣分析。

2.1.4 線性關系考察 精密稱取干燥至恒重的對照品適量，50%甲醇溶解并逐級稀釋，得到不同質量濃度，在“2.1.1”項條件下各進樣測定2 次。以對照品質量濃度為橫坐標（X），對照品、內標峰面積比值為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.1.1”項條件下進樣測定6次，測得各成分色譜峰出峰時間、峰面積RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液適量，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1”項條件下進樣測定，測定各成分色譜峰出峰時間、峰面積RSD均小于3%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復性試驗 取供試品溶液適量，在“2.1.1”項條件下進樣測定6次，測得各成分色譜峰出峰時間、峰面積RSD 均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的藥材粉末0.05 g，共6份，分別按50%、100%、150% 水平加入對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，每個水平平行2份，在“2.1.1”項條件下進樣測定，計算回收率。結果，各成分平均加樣回收率均在90.29%～105.41% 范圍內，RSD 均小于3%。

2.2 土壤理化性質測定 參考《NY／T1377-2007土壤pH 的測定》，采用電位法測定土壤pH。參考《HJ613-2011 土壤 干物質和水分的測定重量法》，采用重量法測定土壤水分。參考《NY／T 1121.6-2006 土壤檢測第6 部分：有機質的測定》，采用重鉻酸鉀容量法測定土壤水分。參考《LY／T 1288-2015 森林土壤氮的測定》，采用酚二磺酸比色法測定土壤水分。參考《NY／T 1121.7-2014 土壤檢測第7 部分：土壤有效磷的測定》，采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定土壤水分。參考《NY／T 889-2004 土壤速效鉀和緩效鉀含量的測定》，采用以中性乙酸銨溶液浸提、火焰光度計測定。

2.3 數(shù)據(jù)分析 采用SIMCA14.1 軟件進行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），DPS 9.01 軟件對數(shù)據(jù)進行灰色關聯(lián)度分析，Canoco5 軟件進行冗余分析。

3 結果

3.1 含量測定 總離子流圖見圖1，結果見表2。

圖1 銀杏葉總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of G.biloba leaves

表2 各成分含量測定結果（mg／g， n＝3）Tab.2 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3.2 差異性成分篩選 OPLS-DA 分析顯示，R2X＝0.76，R2Y＝0.953，Q2＝0.891，表明模型可靠，載荷圖見圖2，可知3 個基地藥材成分具有顯著差異，分布在3 個象限間。為了確定影響分組的差異標志物，采用變量重要性投影（VIP）進行分析，發(fā)現(xiàn)銀杏酸C17∶1、莽草酸、原兒茶酸、銀杏內酯B、金松雙黃酮、銀杏酸C13∶0、銀杏內酯A、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、白果內酯VIP 值均大于1，表明對分類結果影響較大，可作為為不同種植基地的品質標志物。

圖2 不同產(chǎn)地樣品OPLS-DA圖Fig.2 OPLS-DA diagram of samples from different producing areas

3.3 土壤因子對主要成分含量的影響 選取與土壤采集點相對應的11 個銀杏葉采樣點，匯總各成分含量，將其與土壤因子進行關聯(lián)性分析，結果見表3。由此可知，3 個產(chǎn)地土壤性質具有顯著差異，其中山東平邑、四川都江堰土壤養(yǎng)分高，而上海崇明較缺乏，可能與四川都江堰基地氮肥施較多，山東平邑、上海崇明磷肥、鉀肥施加較多有關。

表3 不同種植基地采收期土壤理化性質（）Tab.3 Soil physicochemical properties at harvest time in different planting bases（）

表3 不同種植基地采收期土壤理化性質（）Tab.3 Soil physicochemical properties at harvest time in different planting bases（）

注：同一行不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

3.3.1 灰色關聯(lián)度分析 表4 顯示，各成分含量與土壤因子的灰色關聯(lián)值在0.5～0.8 之間，表明兩者關系密切，成分積累主要受pH、有機質、有效磷、硝態(tài)氮的影響，程度分別為萜內酯類，有機質＞pH＞硝態(tài)氮＞有效磷；黃酮醇苷類，pH ＞有機質＞硝態(tài)氮＞有效磷；有機酸類，速效鉀＞有效磷＞pH＞有機質；烷基酚類，水分＞氨態(tài)氮＞pH＞硝態(tài)氮；雙黃酮類，pH＞水分＞有機質＞速效鉀。

表4 各成分含量與土壤因子灰色關聯(lián)值Tab.4 Grey correlation values between various constituent contents and soil factors

3.3.2 冗余分析 為了清晰直觀地展示土壤因子與各成分含量的相互關系，對兩者進行RDA［16-18］分析排序制圖，結果見圖3。從各土壤因子向量的長度來看，有效磷、pH、有機質、水分箭頭連線最長，可知四者對各成分含量變異起到較好的解釋作用，即為關鍵因子，與灰色關聯(lián)度分析結果基本一致，其中有機質比較靠近第一排序軸的負軸方向，表明與第一排序軸的負軸方向相關性更大；pH 較靠近第一排序軸的正軸方向，表明與第一排序軸的正軸方向相關性更大；水分、硝態(tài)氮、速效鉀比較接近第二排序軸，表明與第二排序軸相關性更大，而第一排序軸與土壤因子、各成分含量的相關性遠大于第二排序軸。

圖3 各成分含量與土壤因子關系的冗余分析圖Fig.3 Redundancy analysis diagram of relationships between various constituent contents and soil factors

采用t-value 雙序圖對各成分含量有顯著影響的土壤因子進行逐一分析，結果見圖4。由此可知，萜內酯類成分主要與土壤中水分、pH 有較大相關性，與土壤水分、pH 均呈負相關；雙黃酮類成分主要與土壤中有機質、水分有較大相關性，與土壤有機質呈負相關，與土壤水分呈正相關；烷基酚類成分主要與土壤中有效磷、有機質有較大相關性，與土壤有效磷、有機質均呈負相關；總黃酮醇苷類成分主要與土壤中水分、pH 有較大相關性，與土壤水分和pH 均呈正相關；有機酸類成分主要與土壤中水分、pH 有較大相關性，與土壤水分、pH 均呈正相關。

圖4 土壤因子和成分含量關系的t-value 雙序圖Fig.4 t-value double sequence diagrams for relationships between soil factors and various constituent contents

4 討論

不同產(chǎn)地銀杏葉具有不同質量特征。對四川都江堰、山東平邑、上海崇明3 個產(chǎn)地采收期銀杏葉含量進行方差多重比較，山東平邑和四川都江堰總內酯含量顯著高于上海崇明；黃酮醇苷類化合物，3 個基地不具有顯著性差異；雙黃酮類化合物，上海崇明和四川都江堰顯著高于山東平邑；有機酸類化合物，山東平邑顯著高于其他兩個，烷基酚類化合物，山東平邑總烷基酚含量顯著低于其他兩個產(chǎn)地。臨床上，銀杏內酯常被制備成注射劑，用于瘀血阻絡所致的缺血性腦卒中［19］，銀杏內酯注射劑可主要選用山東平邑和四川都江堰的銀杏苗圃葉，以獲得更高得率、更高品質的產(chǎn)品。有機酸類成分，具有抗氧化、抗病毒和抗菌等藥理活性［20］，廣泛應用于藥物的合成，如抗流感藥物磷酸奧司他韋等［21］，在有機酸類藥物制劑，可選用山東平邑銀杏苗圃葉，以獲得高產(chǎn)、高價值的產(chǎn)品。臨床上銀杏葉更多的是用于銀杏葉提取物制劑，用于治療心、腦血管疾病，其中主要藥效成分是黃酮和內酯，生產(chǎn)過程中，應考慮不同產(chǎn)地銀杏葉質量差異，使生產(chǎn)過程投料均一化，保證藥品批次間質量穩(wěn)定性，保證用藥有效和安全。

銀杏葉品質主要受土壤中有效磷、pH、有機質、水分這四個環(huán)境因子影響。山東平邑的萜內酯類成分含量相對最高，這與東平邑土壤有機質含量高、土壤水分含量低相關，萜內酯類成分含量與土壤有機質呈正相關性，與pH 和水分呈負相關性，上海崇明等地可通過適當?shù)脑鍪┯袡C糞肥提高土壤有機質，通過控制灌溉量、挖溝排水等控制土壤水分。

綜上所述，本研究為不同臨床療效銀杏葉制劑原藥材選取提供參考，為科學合理規(guī)劃范種植銀杏葉提供了依據(jù)，同時也表明銀杏葉質量標準不能僅參考黃酮類和萜內酯類，不同產(chǎn)地銀杏葉品質不一，應多組分多表征，才能全面控制銀杏葉質量。