陳莎周佳瑛儲(chǔ)非凡林芝張偉琪朱愛芳*

（1.紹興市柯橋區(qū)婦幼保健院，浙江 紹興312030； 2.溫州醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州325035）

骨質(zhì)疏松是一種以單位體積內(nèi)骨量減少為特點(diǎn)的代謝性骨病變，多發(fā)于中老年人，絕經(jīng)后女性發(fā)病率高于男性［1］。雖然死亡率不及心腦血管疾病和惡性腫瘤，但是其并發(fā)癥骨折所造成的高致殘率嚴(yán)重影響患者身心健康［2-3］。目前已有的藥物如雙膦酸鹽類［4］、維生素D類［5］均不能達(dá)到理想的治療效果；雌激素類藥物具有較大副作用［6］。因此，迫切需要尋找到一種安全、高效的治療骨質(zhì)疏松的新藥物。

天然中藥單體憑借其活性強(qiáng)、副作用小等優(yōu)點(diǎn)，有望成為多種疾病的潛在治療藥物［7］。甜菊素提取自多年生草本植物甜葉菊，已有研究報(bào)道其能夠抑制NF-κB 通路，起到抗炎、抗氧化作用［8］。因此，本實(shí)驗(yàn)將探究甜菊素是否能夠通過減輕NFκB 介導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制破骨細(xì)胞的分化和功能。

中藥結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)的興起與成熟，能較好地深入探究其分子層面的作用機(jī)制。因此，本研究將結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)靶點(diǎn)預(yù)測、分子對(duì)接和Western blot 技術(shù)尋找出甜菊素的作用靶點(diǎn)，并通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證甜菊素對(duì)靶點(diǎn)及其下游信號(hào)通路作用，以期構(gòu)建一條“甜菊素-靶點(diǎn)-下游通路”作用邏輯鏈。

1 材料

1.1 動(dòng)物 10 周齡C57BL／6 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購自上海茂生衍生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0004。

1.2 試劑與藥物 甜菊素（純度98%，CAS 號(hào)57817-89-7）對(duì)照品購自成都曼斯特生物科技有限公司。CCK-8 試劑盒（貨號(hào)CA1210-500T）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色液（貨號(hào)G1492-4）購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠RANK 配體（RANKL）（貨號(hào)R0525）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）（貨號(hào)SRP3221）購自美國Sigma-Aldrich公 司；CTSK（貨 號(hào) ab207086）、c-Fos（貨 號(hào)ab222699）、IκB-α（貨號(hào)ab32518）特異性抗體購自英國Abcam 公司；AKR1B1（貨號(hào)67498-1-Ig）特異性抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；TRIzol（貨號(hào)15596018）購自美國Thermo Fisher Scientifie 公司；Acp5、V-ATpase-d2、CTSK、c-Fos、NFATc-1 特異性PCR 引物、SYBR Green（貨號(hào)A25742）購自美國Thermo Fisher Scientifie 公司。

1.3 儀器 SW-CJ-2F／2FD 雙人凈化工作臺(tái)（廣州萬邦凈化設(shè)備有限公司）；Thermo 8000 系列水套式3429 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Sorvall ST40R 高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientifie 公司）；尼康E200 生物顯微鏡酶標(biāo)儀（日本尼康公司）；K3 plus 酶標(biāo)儀（北京優(yōu)健萌威醫(yī)藥科技有限公司）；GelDoc XR＋凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 骨髓單核巨噬細(xì)胞（BMMs）提取與培養(yǎng)小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇消毒后移入超凈臺(tái)，用經(jīng)過高壓蒸汽滅菌的鑷子、剪刀取下四肢，剔除皮毛和肌肉組織，分離出完整的股骨和脛骨，置于含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基中，切開長骨兩端，用5 mL 注射器吸取大皿中的培養(yǎng)基，對(duì)準(zhǔn)切口沖出長骨內(nèi)的骨髓，直至長骨由暗紅色變?yōu)橥ㄍ傅陌咨? 000 μL 移液槍將骨髓吹打混勻，40 μm過濾器過濾，濾液1 500 r／min 離心5 min，棄上清，加入α-MEM 完全培養(yǎng)基（10% 胎牛血清、0.5%雙抗）重懸，接種至T75 培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后隔天換液，直至細(xì)胞密度達(dá)90%后進(jìn)行細(xì)胞傳代，取1～3 代用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8 檢測BMMs 細(xì)胞存活率 將原代BMMs 細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞密度接種至96 孔板中，每孔加入100 μL 含50 ng／mL M-CSF 的α-MEM 完全培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清、1% 雙抗），置于37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁后更換相同培養(yǎng)基，分別加入5、10、20、40 μmol／L溶解于無菌PBS 的甜菊素，每組3 個(gè)復(fù)孔，置于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 d，隔天換液并補(bǔ)充對(duì)應(yīng)濃度的甜菊素，5 d 后在每孔中加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h 后取出，采用多功能酶標(biāo)儀，在450 nm 波長處檢測光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.3 TRAP 染色檢測破骨細(xì)胞形成 將原代BMMs細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種至96 孔板中，每孔加入100 μL 含50 ng／mL M-CSF 的α-MEM 完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁后分為對(duì)照組、RANKL 組、甜菊素組，RANKL 組給予50 ng／mL RANKL 刺激，甜菊素組在RANKL 刺激的基礎(chǔ)上分別給予5、10 μmol／L該成分，隔天更換培養(yǎng)基并補(bǔ)充兩者，培養(yǎng)5～7 d 至RANKL 組出現(xiàn)破骨細(xì)胞后移除培養(yǎng)基，2.5%戊二醛固定15 min，無菌PBS 清洗3次，加入TRAP 染液，置于37 ℃恒溫箱中孵育3 h，染色完成后用無菌PBS 洗去多余染液，在顯微鏡下觀察拍照，以細(xì)胞核≥3 個(gè)的細(xì)胞為破骨細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)其數(shù)量。

2.4 甜菊素預(yù)測靶點(diǎn)的獲取及分子對(duì)接驗(yàn)證 從PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）中獲取甜菊素結(jié)構(gòu)式的sdf 文件，上傳到 PharmMappper 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.lilabecust.cn／pharmmapper／）［9］以預(yù)測甜菊素的潛在目標(biāo)，設(shè)置PharmMappper 參數(shù)，Generate Conformers為Yes；Maximum Generated Conformations 為300；Select Target Set 為Human Protein Target Only，為了提高預(yù)測準(zhǔn)確性，選取預(yù)測結(jié)果中NormFit ＞0.9的靶 點(diǎn)。再 從PDB 數(shù)據(jù)庫（http：／ ／www.rcsb.org／）［10］中下載篩選出的預(yù)測靶點(diǎn)的蛋白構(gòu)象的pdb 文件，為了確保對(duì)接結(jié)果有更高可信度，選用來源于人或者小鼠。最后采用LibDock 對(duì)甜菊素和預(yù)測靶點(diǎn)進(jìn)行模擬對(duì)接評(píng)分，得分＞100 視為對(duì)接成功［11］。

2.5 RT-qPCR 檢測破骨細(xì)胞溶骨相關(guān)基因和調(diào)節(jié)分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá) 將原代BMMs 細(xì)胞以每孔8×104個(gè)的密度接種至6 孔板中，每孔加入2 mL含50 ng／mL M-CSF 的α-MEM 完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁后分為對(duì)照組、RANKL 組、甜菊素組，RANKL 組給予50 ng／mL RANKL 刺激，甜菊素組在RANKL 刺激的基礎(chǔ)上給予10 μmol／L 該成分，隔天更換培養(yǎng)基并補(bǔ)充兩者，培養(yǎng)5 d 后移除培養(yǎng)基，每孔加入600 μL TRIzol，置于冰上靜置裂解5 min，吸取混合液至1.5 mL EP 管中，加入150 μL氯仿，振蕩15 s 后靜置5 min，4 ℃、12 000 r／min離心15 min 后取上清，加入500 μL 異丙醇，靜置10 min，4 ℃、12 000 r／min 離心15 min，棄去上清，75%乙醇清洗1次，即得總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測破骨細(xì)胞溶骨相關(guān)基因（Acp5，V-ATpase-d2，CTSK）和調(diào)節(jié)分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（c-Fos， NFATc-1）相對(duì)表達(dá)，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 熒光素報(bào)告酶分析 將構(gòu)建有NF-κB 熒光素酶基因的RAW264.7 細(xì)胞接種于96 孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔5×103個(gè)，加入100 μL 含50 ng／mL MCSF 的α-MEM 完全培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁后按“2.5”項(xiàng)下方法分組及給藥，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，采用熒光素報(bào)告酶試劑盒和多功能酶標(biāo)儀檢測熒光素酶活性。

2.7 Western blot 檢測c-Fos、CTSK、IκBα、AKR1B1蛋白表達(dá) BMMs 細(xì)胞按“2.5”項(xiàng)下方法分組及給藥，采用細(xì)胞總蛋白提取試劑裂解細(xì)胞提取蛋白，SDS-PAGE 電泳分離目標(biāo)蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶，在4 ℃下封閉過夜，棄去封閉液，洗膜3次，每次15 min，加入一抗，在4 ℃下孵育12 h，洗膜3次，每次15 min，加入二抗，常溫孵育2 h，在凝膠成像系統(tǒng)下顯影，Image Lab 軟件對(duì)所得條帶灰度值進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用Student’st檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 甜菊素對(duì)BMMs 細(xì)胞活性的影響 如圖1 所示，與對(duì)照組（0 μmol／L）比較，各濃度甜菊素OD值無明顯變化（P＞0.05），表明該成分濃度在0～40 μmol／L 范圍內(nèi)對(duì)BMMs 細(xì)胞無毒性。

圖1 甜菊素對(duì)BMMs 細(xì)胞活性的影響（， n＝3）Fig.1 Effect of steviosin on BMMs cell viability（， n＝3）

3.2 甜菊素抑制RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化 如圖2 所示，與對(duì)照組比較，RANKL 組BMMs 細(xì)胞分化融合為多核破骨細(xì)胞；與RANKL 組比較，甜菊素組破骨細(xì)胞數(shù)量呈劑量依賴性減少（P＜0.01），即10 μmol／L 時(shí)效果最強(qiáng)。

圖2 甜菊素抑制RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化Fig.2 Inhibitory effect of steviosin on differentiation of RANKL-induced osteoclasts

3.3 甜菊素與AKR1B1 的分子對(duì)接 共預(yù)測得到290 個(gè)甜菊素的潛在作用靶點(diǎn)，其中NormFit＞0.9的靶點(diǎn)共有26 個(gè)。經(jīng)LibDock 分子對(duì)接后，共有5個(gè)靶點(diǎn)與甜菊素對(duì)接成功，其中AKR1B1 以200.062 的得分位居第一，見圖3、表2。

表2 甜菊素與預(yù)測靶點(diǎn)的LibDock 對(duì)接評(píng)分Tab.2 LibDock docking scores for steviosin and predicted targets

圖3 甜菊素與AKR1B1 的分子對(duì)接Fig.3 Molecular docking for steviosin and AKR1B1

3.4 甜菊素抑制RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞中AKR1B1 的表達(dá) 如圖4 所示，與對(duì)照組比較，RANKL 組破骨細(xì)胞中AKR1B1 表達(dá)升高（P＜0.05）；與RANKL 組比較，甜菊素組破骨細(xì)胞中AKR1B1 表達(dá)降低（P＜0.05）。

圖4 甜菊素抑制破骨細(xì)胞中AKR1B1 表達(dá)（，n＝3）Fig.4 Inhibitory effect of steviosin on AKR1B1 expressions in osteoclasts（， n＝3）

3.5 甜菊素抑制破骨細(xì)胞溶骨相關(guān)基因和調(diào)節(jié)分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá) 如圖5 所示，與對(duì)照組比較，RANKL 組破骨細(xì)胞溶骨相關(guān)基因Acp5、VATpase-d2、CTSK以及調(diào)節(jié)分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子c-Fos、Naftc-1 mRNA 表達(dá)均升高（P＜0.01）；與RANKL 組比較，甜菊素組破骨細(xì)胞中上述基因表達(dá)均降低（P＜0.01）。

圖5 各組破骨細(xì)胞Acp5、 V-ATpase-d2、 CTSK、 c-Fos、 Naftc-1 mRNA 表達(dá)（， n＝3）Fig.5 mRNA expressions of Acp5， V-ATpase-d2，CTSK， c-Fos and Naftc-1 of osteoclasts in each group（， n＝3）

3.6 甜菊素對(duì)c-Fos 通路的抑制作用 如圖6 所示，與RANKL 組比較，甜菊素組c-Fos、CTSK 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.01）。

圖6 甜菊素抑制c-Fos 通路激活（， n＝3）Fig.6 Inhibitory effect of steviosin on c-Fos pathway activation（， n＝3）

3.7 甜菊素對(duì)NF-κB 通路的抑制作用 如圖7A所示，與對(duì)照組比較，RANKL 組NF-κB 的熒光素酶活性增強(qiáng)（P＜0.01）；與RANKL 組比較，甜菊素組NF-κB 的熒光素酶活性減弱（P＜0.01）。如圖7B～7C 所示，與對(duì)照組比較，RANKL 組NF-κB通路激活中關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白IκBα 的表達(dá)降低（P＜0.01）；與RANKL 組比較，甜菊素組IκBα 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖7 甜菊素抑制NF-κB 通路活化（， n＝3）Fig.7 Inhibitory effect of steviosin on NF-κB pathway activation（， n＝3）

4 討論

甜菊素是一種天然來源的雙萜配糖體，也作為甜味劑使用，具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤［12］等多種生物活性，本研究探討甜菊素通過抑制破骨細(xì)胞活性從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的作用。

破骨細(xì)胞的活性主要體現(xiàn)在能否從BMMs 細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞，以及其溶骨功能的強(qiáng)弱［6］。破骨細(xì)胞的骨溶解功能主要由CTSK 行使［13］，Acp5則能增強(qiáng)CTSK 的功能。本研究顯示甜菊素降低了RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞中CTSK和Acp5 的表達(dá)，提示甜菊素對(duì)破骨細(xì)胞溶骨功能具有抑制作用。V-ATpase-d 能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，已有研究證明抑制V-ATpase-d2 阻止了前體細(xì)胞融合形成破骨細(xì)胞［14］。NFATc-1 是有關(guān)破骨細(xì)胞分化和功能行使關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，c-Fos 是激活蛋白-1（AP-1）的重要組成部分［15］，兩者均能夠促進(jìn)下游CTSK、Acp5 和V-ATpase-d2 的表達(dá)，抑制NFATc-1 和c-Fos 表達(dá)便能抑制下游效應(yīng)蛋白的表達(dá)，從而很大程度上地抑制破骨細(xì)胞的活性，本研究結(jié)果證實(shí)這一點(diǎn)。

除了NFATc-1、c-Fos、NF-κB 在RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中也扮演重要的角色［16-17］，RANKL 和RANK 結(jié)合，通過膜受體TRAF6 激活核因子κB 激酶抑制劑（IKK），活化的IKK 進(jìn)而降解IκBα［18］，從而釋放NF-κB，NF-κB 轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核［19］，促進(jìn)了NFATc-1 和c-Fos，進(jìn)而通過一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化。IκBα 作為這條通路中的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)與NF-κB 通路的活性呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，甜菊素能上調(diào)破骨細(xì)胞中IκBα 表達(dá)，表明甜菊素也能夠通過抑制NFκB 途徑來發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞分化的作用。

AKR1B1 是一種NADPH 依賴性酶，催化各種醛和酮還原為相應(yīng)的醇［20］，具有較好的抗氧化作用，有研究顯示其能夠激活p65 從而活化NF-κB信號(hào)通路［21-22］。根據(jù)LibDock 對(duì)甜菊素和AKR1B1對(duì)接的高評(píng)分，預(yù)測甜菊素可能通過AKR1B1 調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路的活性。

綜上所述，甜菊素可能通過抑制AKR1B1／NFκB軸，進(jìn)而減少轉(zhuǎn)錄因子NFATc-1 和c-Fos 表達(dá)，最終起到抑制破骨細(xì)胞分化和功能的作用。本課題組后續(xù)將會(huì)對(duì)甜菊素深層機(jī)制及其在體內(nèi)的作用進(jìn)一步研究，為將來開發(fā)安全、高效的治療骨質(zhì)疏松的藥物提供基礎(chǔ)。