劉曉俊郭文婷沈鵬程龍

（1.昆明市食品藥品檢驗(yàn)所藥品檢驗(yàn)中心，云南 昆明650032； 2.昆明學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南 昆明650214； 3.上海愛(ài)博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海200335）

感冒清熱顆粒由荊芥穗、防風(fēng)、柴胡、葛根、白芷等11 味藥材組成，具有疏風(fēng)散寒、解表清熱的功效，方中葛根所含葛根素具有解肌退熱、生津止渴［1］、抗炎、抗過(guò)敏［2-5］等作用；白芷所含歐前胡素具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、平喘、抗菌等多種藥理作用［6-11］；防風(fēng)指標(biāo)成分為升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷，前者具有鎮(zhèn)靜、抗菌、降壓等作用，后者具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等多種功效［12-14］。2020年版《中國(guó)藥典》 一部對(duì)感冒清熱顆粒的質(zhì)量控制以薄層鑒別為主，僅對(duì)葛根中葛根素含量采用HPLC 法進(jìn)行測(cè)定，并未涉及升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素等其他有效成分，不能全面反映該制劑質(zhì)量，而文獻(xiàn)［13-21］也大多僅采用HPLC 法分別測(cè)定葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素含量。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS／MS 法同時(shí)測(cè)定感冒清熱顆粒中葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素的含量，以期為全面評(píng)價(jià)該制劑質(zhì)量、完善其標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 超高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；AB SCIEX 三重四級(jí)桿／復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；AL104 電子分析天平［萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；DV215CD 十萬(wàn)分之一微量分析天平（美國(guó)奧豪斯公司）；Chorus LC216-134 超純水制備儀［威立雅水處理技術(shù)（上海）有限公司］；SONOREXRK 255 超聲波清洗器（德國(guó)Bandelin 公司）。

1.2 試劑與藥物 葛根素（批號(hào)110752-200912，純度96.0%）、歐前胡素（批號(hào)110826-201616，純度99.6%）、5-O-甲基維斯阿米醇 苷（批號(hào)111523-201208，純度96.4%）、升麻素苷（批號(hào)111522-201008，純度93.9%）對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。3 批感冒清熱顆粒分別來(lái)自廣西維威制藥有限公司（批號(hào)181214，含蔗糖，12 g／袋）、廣東恒誠(chéng)制藥有限公司（批 號(hào)1811207，含蔗糖，12 g／袋）、葵花藥業(yè)集團(tuán)（冀州）有限公司（批號(hào)18022301，無(wú)蔗糖，6 g／袋）。甲醇、乙腈均為色譜純；甲酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸，梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；體積流量0.2 mL／min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 質(zhì)譜條件 SCIEX 4000 Q TRAP 三重四級(jí)桿／復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)；電噴霧離子源（ESI源），溫度550 ℃，電壓5.5 kV；正離子模式；噴霧氣（Gas1）55 psi（1 psi ＝6.895 kPa）；輔助加熱氣（Gas2）55 psi；氣簾氣（CUR）30 psi，其他參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 各成分質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)照品葛根素10.23 mg、升麻素苷10.07 mg、5-O-甲基維斯阿米醇苷10.04 mg、歐前胡素10.06 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為貯備液，分別精密吸取2 000、250、125、125 μL，置于同一250 mL 量瓶中，20%甲醇定容至刻度，搖勻，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為7 857.00、946.00、484.00、501.00 ng／mL）。

圖1 各成分UPLC-MS／MS 色譜圖Fig.1 UPLC-MS／MS chromatograms of various constituents

2.4 供試品溶液制備 取各批樣品適量，研細(xì)，6 g／袋取約0.4 g，12 g／袋取約0.8 g，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，20%甲醇超聲（頻率33 kHz、功率250 W）處理30 min，冷卻，20%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液1.0 mL至10 mL量瓶中，20%甲醇定容至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mL，置于10 mL 量瓶中，20%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成系列質(zhì)量濃度，在“2.1”和“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表3，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。再以信噪比為10∶1 計(jì)算定量下限（LOQ），結(jié)果分別為葛根素8.27 pg、升麻素苷7.39 pg、歐前胡素5.22 pg、5-O-甲基維斯阿米醇苷5.63 pg；以信噪比為3∶1 計(jì)算檢測(cè)下限（LOD），結(jié)果分別為葛根素2.48 pg、升麻素苷2.22 pg、歐前胡素1.57 pg、5-O-甲基維斯阿米醇苷1.69 pg。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度試驗(yàn) 取“2.5”項(xiàng)下對(duì)照品溶液（葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素質(zhì)量濃度分別為1 571.40、189.20、96.80、100.20 ng／mL），0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，在“2.1”和“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素峰面積RSD 分別為0.92%、1.29%、0.98%、1.32%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號(hào)18022301），室溫下 于0、2、4、6、8、12 h 在“2.1”和“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素峰面 積 RSD 分別為 1.91%、1.46%、1.31%、1.73%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品（批號(hào)18022301）6份，每份約0.4 g，精密 稱定，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”和“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得葛根素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、歐前胡素含量RSD分別為1.41%、0.97%、1.18%、1.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的同一批本品（批號(hào)18022301）6份，每份約0.2 g，精密稱定，置于50 mL 量瓶中，精密加入“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液（982.08 μg／mL 葛根素1 000 μL、945.57 μg／mL 升麻素苷60 μL、967.86 μg／mL 5-O-甲基維斯阿米醇苷60 μL、1 001.98 μg／mL 歐前胡素300 μL），按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”和“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。2.10 樣品含量測(cè)定 取3 批樣品各2份，其中批號(hào)18022301 約0.4 g，批號(hào)181214、1811207 各約0.8 g，精密稱定，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”和“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表5 各成分含量測(cè)定結(jié)果（n＝2）Tab.5 Results of content determination of various constituents（n＝2）

3 討論

3.1 測(cè)定方法選擇 課題組前期采用HPLC 法測(cè)定感冒清熱顆粒中葛根素、歐前胡素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，發(fā)現(xiàn)歐前胡素色譜峰保留時(shí)間較長(zhǎng)，含量較低，在供試品中未能檢出；本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-MS／MS法，上述4 種成分均能準(zhǔn)確定量，并且具有分析時(shí)間短、準(zhǔn)確度高、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。

3.2 流動(dòng)相選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸，發(fā)現(xiàn)以后者洗脫時(shí)保留時(shí)間短，各成分離子強(qiáng)度高，分離程度、峰形更理想，故以其為流動(dòng)相。

3.3 含量分析 3 個(gè)廠家感冒清熱顆粒中葛根素、歐前胡素含量穩(wěn)定，均能達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)，但升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量差異較大，分別達(dá)3.5、4.5倍，可能是藥材質(zhì)量差異、生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定所致，需引起關(guān)注。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-MS／MS 法同時(shí)測(cè)定感冒清熱顆粒中葛根素、歐前胡素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，該方法快速高效，靈敏度高，重復(fù)性好，可為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。