徐 俊 陳冰心 朱永亮 奚沁華 嚴(yán) 蘇

1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇蘇州 215006；2.蘇州普瑞森基因有限公司，江蘇蘇州 215000

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是西方世界癌癥相關(guān)的第二大死因[1]；在我國，CRC 是第三大常見癌癥，第五大死亡原因[2]。CRC 通常起源于結(jié)直腸腺瘤（colorectal adenoma，CRA）[3]，隨著APC 基因的丟失以及KRAS、TP53 等基因激活和失活突變的累積，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[4]。目前認(rèn)為在經(jīng)典的腺瘤—癌發(fā)展進(jìn)程中，CRA 患者存在明顯的腸道菌群失衡現(xiàn)象[5-6]，其發(fā)生是涉及多個細(xì)菌類群組成改變的復(fù)雜過程。如能將這種復(fù)雜的變化提煉為一個簡單的指標(biāo)，將有助于推動腸道菌群研究的臨床應(yīng)用。

目前臨床缺乏對CRA 非侵入性安全高效的早期檢測手段[7]。本研究擬運用16S rRNA 高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析方法，觀察CRA 患者和健康志愿者腸道菌群組成差異并以此構(gòu)建模型，為發(fā)展CRA 早期診斷標(biāo)志物提供新的思路及理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017 年1 月至2018 年7 月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院行腸鏡檢查的96 例CRA 患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18 周歲；②在蘇州地區(qū)居住滿5 年以上；③腸鏡和病理學(xué)結(jié)果明確。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有結(jié)直腸手術(shù)史；②近1 個月使用過非甾體類抗炎藥、抗生素、類固醇皮質(zhì)激素及益生菌；③有腸道感染、腸功能紊亂、炎癥性腸病、代謝性疾?。ㄌ悄虿?、肥胖、高脂血癥）、嚴(yán)重肝腎疾病及免疫缺陷；④有特殊飲食習(xí)慣（高脂肪、高蛋白、低膳食纖維）或飲食限制。同期以相同排除標(biāo)準(zhǔn)納入59 名腸鏡未見異常的健康體檢者作為對照組。所有志愿者于腸道準(zhǔn)備前留取糞便樣本，并進(jìn)行糞便隱血試驗（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT）和血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）檢測。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性，見表1。本研究通過蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會審核[批準(zhǔn)號+56（2016）]，每位受試者簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料比較

1.2 研究方法

使用TIANamp 糞便DNA 試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號：DP328）進(jìn)行糞便DNA 提取。使用NanoDrop 2000c 分光光度計（賽默飛世爾科技公司）對純化核酸進(jìn)行定量。通過PCR 技術(shù)對細(xì)菌16S V3-V4區(qū)域擴增，所用引物為：16SF_V3：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3’和16SR_V4：5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGACTACNVGGGTWTCTAATC-3’。將PCR 產(chǎn)物在Illumina Miseq測序平臺進(jìn)行雙端測序分析。

使用PANDAseq（v0.21.1）拼接V3-V4 序列，用Trimmomatic（V0.30）進(jìn)行質(zhì)量過濾。通過Vsearch（v1.9.6）去除序列中的嵌合體。按97%相似度進(jìn)行out群落聚類。通過Cytoscape 將豐度差異菌屬構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。使用R 中的隨機森林分類系統(tǒng)訓(xùn)練OTU 預(yù)測患者風(fēng)險。

基于差異菌株構(gòu)建加權(quán)失衡指數(shù)（weighted dysbiosis index，WDI）模型，WDI 定義為樣本到健康組質(zhì)心歐式距離（μN）與樣本到疾病組質(zhì)心歐式距離（μD）的差值，即WDIs（S，μD，μN）=，其 中Si，μDi，μNi 分別代表樣本S、μN、μD 第i 類群豐度，F(xiàn)Ci 是第i 類群倍數(shù)變化。WDI 正值代表測試樣本遠(yuǎn)離健康組距離超過疾病組，處于失衡狀態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，觀察不同檢測方法對CRA 的診斷效能。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基本特征比較

每個樣本平均可獲得110 000 條序列，序列平均長度為453.7 bp。兩組ACE、Chao1、Shannon 和Simpson指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）；兩組序列數(shù)、序列長度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.11、0.32，P=0.92、0.76）。見圖1。

圖1 兩組基本特征比較

2.2 兩組菌群組成比較

與對照組比較，CRA 組肺炎克雷伯菌、糞副擬桿菌、梭桿菌屬豐度增加；放線菌門、毛螺菌科、布勞特氏菌屬、雙歧桿菌屬、羅氏桿菌屬、鏈球菌屬、假丁酸弧菌屬、潰瘍梭桿菌種豐度減少。見圖2。

圖2 兩組菌群組成比較

2.3 多種檢測方法對CRA 的診斷效能

FOBT 診斷CRA 的靈敏度為15.63%（15/96），特異度為91.53%（54/59），誤診率為8.47%（5/59），漏診率為84.38%（81/96）。WDI 診斷CRA 的靈敏度為83.33%，特異度為71.19%，曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.795（P ＜0.0001，95%CI：0.712～0.877）；CEA診斷CRA 的靈敏度為71.88%，特異度為52.54%，AUC為0.614（P=0.017，95%CI：0.523～0.706）。見圖3。

圖3 基于WDI 和CEA 的ROC 曲線

3 討論

本研究運用高通量測序比較CRA 組和對照組腸道菌群組成，顯示CRA 階段存在明顯的菌群失衡現(xiàn)象。與臨床常用的FOBT 和CEA 比較，基于11 個豐度差異類群構(gòu)建的WDI 模型在CRA 診斷中具有更為優(yōu)秀的效能。

研究表明，CRA 患者肺炎克雷伯菌豐度高于對照組[8]，而糞副擬桿菌在進(jìn)展期腺瘤中明顯富集[9]。腺瘤中梭桿菌屬豐度與局部炎癥呈正相關(guān)，而與腺瘤大小或數(shù)量無明顯相關(guān)性[10]。毛螺菌可減少腸道息肉的發(fā)生[11]，其在CRA 組的豐度低于對照組[12]。雙歧桿菌可以降低結(jié)腸pH、抑制潛在的病原體[13]。Rezasoltani等[14]發(fā)現(xiàn)，CRA 組雙歧桿菌、羅氏桿菌明顯減少，且息肉越大、分化越差、豐度降低越明顯。此外，CRA 患者布勞特菌屬的豐度也是下降的[15]，該菌還涉及代謝相關(guān)疾病[16]。假丁酸弧菌屬和潰瘍梭桿菌同為產(chǎn)丁酸鹽類細(xì)菌[17]。丁酸鹽具有抑制結(jié)腸炎癥和癌變的作用，本研究中上述類群在CRA 組的缺失與發(fā)病機制的聯(lián)系還有待進(jìn)一步研究。

大規(guī)模人群篩查是降低結(jié)直腸腫瘤發(fā)病率的重要途徑[18]。現(xiàn)有的方法包括：FOBT、血清CEA、糞便DNA、膠囊內(nèi)鏡、氣鋇雙重造影、CT、結(jié)腸鏡等[19]，但往往存在依賴先進(jìn)設(shè)備、檢查費用昂貴、放射性危害、對腺瘤檢出率不高等問題[20-23]。有報道，F(xiàn)OBT 對CRA 的診斷敏感度為47.7%[24]，而CEA 的敏感度僅為11%～18%[25]，缺乏參考價值。本研究構(gòu)建的模型對于CRA的診斷潛能明顯優(yōu)于這兩者。鑒于腸道菌群模型只需采集患者糞便，無創(chuàng)便捷，在擴大樣本量尋找更具代表性的菌株優(yōu)化模型基礎(chǔ)上，或許有望將其發(fā)展為CRA 早期篩查的一種新手段。