劉玉潔 韓勇

（山東省日照市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 276800）

2021 年8 月2 日，山東畜牧獸醫(yī)局印發(fā)《山東省重點(diǎn)動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)凈化工作方案（2021 版），要求推進(jìn)全省重點(diǎn)動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)凈化，提高規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)管理水平和疫病防控能力，推動(dòng)動(dòng)物疫病防控從穩(wěn)定控制到凈化消滅轉(zhuǎn)變。2021 年10 月7 日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部下發(fā)《關(guān)于推進(jìn)動(dòng)物疫病凈化的意見(jiàn)》，要求推進(jìn)動(dòng)物疫病凈化工作，力爭(zhēng)通過(guò)5 年時(shí)間，在全國(guó)建立一批高水平的凈化場(chǎng)。

布魯氏菌?。˙rucellosis）又稱馬耳他熱或波狀熱，是由布魯氏菌（Brucella）引起的一種人畜共患自然疫源性傳染病，布魯氏菌常引起動(dòng)物流產(chǎn)、不孕，故又被稱之為傳染性流產(chǎn)病[1]。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為二類動(dòng)物疫病，可感染人類及多種家畜和野生動(dòng)物，引起相似的臨床癥狀與病理?yè)p傷，如發(fā)熱、流產(chǎn)與不育、慢性關(guān)節(jié)炎及神經(jīng)損害等，嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)[2]。在世界動(dòng)物衛(wèi)生組織疫病名錄中，牛結(jié)核病被列為B 類動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。牛結(jié)核病的流行對(duì)養(yǎng)殖業(yè)及民眾健康都會(huì)造成嚴(yán)重的危害[3]。炭疽桿菌是由炭疽芽孢桿菌引起的一種人畜共患傳染病，衛(wèi)生部門(mén)將其列為法定報(bào)告的乙類傳染病，農(nóng)業(yè)部門(mén)將其列為多種動(dòng)物共患的二類動(dòng)物疫病。

以上3 種疫病均為人畜共患病，能對(duì)動(dòng)物和人造成嚴(yán)重危害，尤其是布病近年來(lái)在日照市人感染較多，為從源頭控制疫病，日照動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心選擇2 家奶牛場(chǎng)，6 家羊場(chǎng)，通過(guò)2 年持續(xù)監(jiān)測(cè)，了解布氏桿菌、結(jié)核分枝桿菌和炭疽桿菌病原感染狀況，為凈化提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品類型和數(shù)量

選擇8 家規(guī)模牛羊場(chǎng)，其中奶牛場(chǎng)2 家，羊場(chǎng)6 家（3 家免疫布病疫苗，3 家未免疫布?。?。按照置信水平95%，預(yù)期流行率6%，每次采樣不少于50 份。每頭奶牛采集血清、抗凝血。每只羊采集血清。每個(gè)牛羊場(chǎng)采集環(huán)境拭子10 份（見(jiàn)表1）。

表1 2020～2021 年采樣情況統(tǒng)計(jì)（單位：個(gè)）

1.2 樣品采樣和處理方法

1.2.1 血清

每頭牛羊用促凝血管采集血5ml，室溫靜置30min 后，3000r/min 離心3～5min，取上層血清1～1.2ml 放1.5ml 離心管中，在離心管蓋上編號(hào)。

1.2.2 抗凝血

每頭牛用頸靜脈或尾靜脈采血，加入肝素抗凝劑采集血3ml，顛倒混勻3～5 次，室溫靜置30min 后在采樣管上編號(hào)。

1.2.3 環(huán)境拭子

采集牛羊場(chǎng)環(huán)境樣品，采集至少3 個(gè)畜舍、糞污處理點(diǎn)、飼料儲(chǔ)存點(diǎn)等高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)10 份樣品。

1.3 檢測(cè)試劑和方法

布病競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試劑盒、結(jié)核γ-干擾素ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢科前公司。布病虎紅平板凝集抗原購(gòu)自哈藥集團(tuán)。炭疽熒光PCR 試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)元亨公司。牛型、禽型結(jié)核菌素購(gòu)自瑞士BOVIGAM。

1.4 主要儀器設(shè)備

自動(dòng)核酸提取儀960 購(gòu)自西安天隆公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MD 公司，高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自Sigma 公司等。

1.5 方法

1.5.1 布氏桿菌

對(duì)3 家未免疫疫苗的羊場(chǎng)采用布病虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）和布病競(jìng)爭(zhēng)ELISA（cELISA）進(jìn)行檢測(cè)。cELISA 檢測(cè)陽(yáng)性的確診為陽(yáng)性，RBT 檢測(cè)陽(yáng)性的再用cELISA 或布病試管凝集試驗(yàn)（SAT）進(jìn)行確診。對(duì)3 家免疫疫苗的羊場(chǎng)采集血清用RBT 和cELISA 進(jìn)行免疫效果初篩，RBT 陽(yáng)性的用cELISA或布病試管凝集試驗(yàn)（SAT）進(jìn)行確定。RBT 和SAT 參照動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)（GB/T18646-2018），cELISA 試驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.2 結(jié)核分枝桿菌

對(duì)兩家規(guī)模牛場(chǎng)采用結(jié)核分枝桿菌γ-ELISA 試驗(yàn)和變態(tài)變態(tài)反應(yīng)（PPD），任何一種方法檢測(cè)陽(yáng)性的診斷為陽(yáng)性。結(jié)核分枝桿菌γ-ELISA 試驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，PPD 按照動(dòng)物結(jié)核病診斷技術(shù)（GB/T18645-2020）執(zhí)行。

1.5.3 炭疽桿菌

對(duì)8 家規(guī)模牛羊場(chǎng)采集環(huán)境樣品，提取病毒核酸，進(jìn)行炭疽桿菌熒光PCR 檢測(cè)，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原學(xué)監(jiān)測(cè)

由表2 可知2020～2021 年連續(xù)2 年對(duì)8 個(gè)牛羊場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，僅在2020 年1 個(gè)羊場(chǎng)中檢測(cè)出2 份布病樣品。2021 年均未檢測(cè)到布氏桿菌、結(jié)核分枝桿菌和炭疽桿菌，說(shuō)明日照市凈化成效顯著。

表2 2019-2021 年場(chǎng)病原學(xué)場(chǎng)陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)（單位：個(gè)）

2.2 布病免疫抗體檢測(cè)情況

由表3 可知，2020～2021 年，對(duì)接受布病免疫的3 個(gè)羊場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，2 個(gè)羊場(chǎng)布病免疫抗體水平均超過(guò)70%，達(dá)到保護(hù)要求，其中1 個(gè)羊場(chǎng)抗體水平低于70%，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整免疫程序，提高抗體水平。

表3 布病疫苗免疫抗體水平統(tǒng)計(jì)（單位：份）

3 討論

3.1 凈化總體情況

根據(jù)2020～2021 年連續(xù)監(jiān)測(cè)結(jié)果可知，8 個(gè)牛羊場(chǎng)，布氏桿菌、結(jié)核分枝桿菌和炭疽桿菌凈化效果較好，僅有1 個(gè)羊場(chǎng)在2020 年檢測(cè)出2 份布病樣品。到2021 年，全市有5 家牛羊場(chǎng)通過(guò)省級(jí)“布魯氏菌凈化場(chǎng)”，畜間達(dá)到穩(wěn)定控制標(biāo)準(zhǔn)，人間病例呈下降趨勢(shì)。

3.2 檢測(cè)方法優(yōu)化

布病平板凝集試驗(yàn)（RBT）檢測(cè)抗體是IgG 類，敏感性高，操作簡(jiǎn)單，但容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，在實(shí)際應(yīng)用中常作為初篩手段。布病試管凝集（SAT）特異性高、敏感性高，耗時(shí)較長(zhǎng)，常作為血清學(xué)確診手段。布病平板凝集和ELISA 有一定的假陽(yáng)性率，試管凝集有一定假陰性率[4]。競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法操作精準(zhǔn)，結(jié)果簡(jiǎn)明，可避免人為的誤判[5]。在臨床應(yīng)用中，常需兩種或兩種以上方法相互配合。本次監(jiān)測(cè)采用布病RBT、cELISA進(jìn)行初選，SAT 進(jìn)行確診，凈化效果顯著。

本監(jiān)測(cè)對(duì)400 份樣品同時(shí)進(jìn)行牛結(jié)核菌PPD 試驗(yàn)和γ-干擾素ELISA 試驗(yàn)，檢測(cè)均為陰性。陳建豪對(duì)433 份樣本用γ-干擾素ELISA 檢測(cè)與皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)方法進(jìn)行比對(duì)，兩者敏感性為84%，特異性為96.81%，符合率為96.07%（416/433）[6]。朱建華等對(duì)29 頭結(jié)核陽(yáng)性牛同時(shí)進(jìn)行牛結(jié)核菌素PPD 試驗(yàn)和γ-干擾素ELISA 試驗(yàn)，符合率82.6%[7]。由于PPD 存在游標(biāo)卡尺測(cè)量誤差等缺點(diǎn)，γ-干擾素ELISA 存在循環(huán)的γ-干擾素水平過(guò)高、使用藥物等因素影響。本次監(jiān)測(cè)采用PPD 和ELISA 聯(lián)合監(jiān)測(cè)凈化，效果更好。

3.3 下步工作重點(diǎn)

經(jīng)過(guò)2 年持續(xù)監(jiān)測(cè)，8 個(gè)牛羊場(chǎng)布氏桿菌、結(jié)核分枝桿菌和炭疽桿菌凈化效果較好，僅有1 個(gè)羊場(chǎng)在2020 年檢測(cè)出2 份布病樣品，以上條件說(shuō)明日照市牛羊場(chǎng)具備開(kāi)展布氏桿菌、結(jié)核分枝桿菌凈化條件。布氏桿菌仍在2020 年檢出1 個(gè)場(chǎng)檢出病原陽(yáng)性，說(shuō)明日照市布病仍存在風(fēng)險(xiǎn)。下一步要繼續(xù)采取消毒、生物安全措施，做好凈化工作。