朱成之，段 旭，張 娜，徐志輝，鄧旭輝，李 榮，沈其榮

青枯病不同發(fā)病率土壤對番茄植株氮素吸收效率的影響①

朱成之，段 旭，張 娜，徐志輝，鄧旭輝，李 榮*，沈其榮

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術(shù)研究重點實驗室/江蘇省有機固體廢棄物協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部資源節(jié)約型肥料工程技術(shù)研究中心，南京 210095)

為研究青枯病不同發(fā)病率土壤對番茄植株氮素吸收效率的影響，以番茄為供試植物，采集連作多年后6種青枯病不同發(fā)病率(12.5%、21.9%、40.0%、59.4%、83.3% 和91.6%)的土壤，進行盆栽試驗。結(jié)果表明，隨著初始土壤青枯病發(fā)病率逐漸升高，番茄植株生物量和氮素吸收效率呈下降趨勢，且存在顯著相關(guān)性；初始土壤中全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量與植株的氮素吸收效率無顯著相關(guān)；初始土壤的細菌多樣性和群落組成與植株的氮素吸收效率無顯著相關(guān)，但基于OTU的細菌群落變化與植物氮素吸收效率呈顯著相關(guān)性，溶桿菌屬()和藤黃單胞菌屬()細菌與植株氮素吸收效率呈顯著正相關(guān)，其中溶桿菌屬()細菌同時與發(fā)病率呈顯著負相關(guān)。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，受不同程度的連作障礙影響，土壤的氮素含量與植物氮素吸收效率無顯著相關(guān)性，而初始土壤的細菌群落與植物氮素吸收效率存在顯著相關(guān)性。

連作障礙；青枯病；氮素吸收效率；番茄；土壤細菌群落

番茄青枯病是一種全球性的土傳細菌性病害，一旦發(fā)生難以控制且極具毀滅性，往往會造成巨大的經(jīng)濟損失[1]，嚴(yán)重破壞土壤的健康狀況，制約著番茄的生產(chǎn)[2-3]。連作土壤中微生物多樣性下降，微生物間相互作用減少是導(dǎo)致不同類型連作障礙的主要原因[4]。另外，連作在導(dǎo)致土傳病害的同時，由于植株對養(yǎng)分的選擇性吸收，容易導(dǎo)致一些元素的缺乏，造成養(yǎng)分失衡[5]，導(dǎo)致土壤退化，引起植株發(fā)育不良[6]，產(chǎn)量和品質(zhì)下降[7]。土壤微生物與植株的養(yǎng)分吸收息息相關(guān)[8-10]，然而，不同發(fā)病程度的土壤對作物養(yǎng)分吸收效率的影響，土壤初始微生物群落與植物養(yǎng)分吸收間的關(guān)系，尚缺乏系統(tǒng)研究。

氮是植物體內(nèi)許多重要有機化合物的成分，影響著植物的代謝過程和生長發(fā)育[11]，它是植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、磷脂和某些生長激素的重要組分之一[12]，也是某些植物激素、維生素等對生命活動起調(diào)節(jié)作用物質(zhì)的主要成分[13]，且對作物最終產(chǎn)量的貢獻約為40% ～ 50%[14]。植株的氮素吸收受多種因素影響，研究表明，連作會使土壤中的氮素形態(tài)和積累發(fā)生變化，進而影響作物的生長過程和產(chǎn)量形成[15-16]；土壤微生物也會影響植株的氮素吸收利用[17]，對土壤氮素的有效性及其在地上、地下的循環(huán)特征方面起著調(diào)控作用[18]。此外，目前我國的氮肥利用率低于發(fā)達國家[19]。因此，研究不同連作障礙土壤下的植株氮素吸收效率及其影響因素，具有重要意義。

綜上，目前國內(nèi)外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，長期連作造成土壤健康狀況變化，進而影響植株的生長，然而從障礙土壤氮素含量及細菌群落出發(fā)，探究連作障礙對植物氮素吸收利用的影響還很少。本文旨在從不同發(fā)病率的番茄青枯土出發(fā)，研究不同發(fā)病率土壤氮素含量及初始細菌群落對植株氮素吸收效率的影響，以期為通過調(diào)控土壤微生物，改善因連作障礙造成植株養(yǎng)分吸收效率低的問題提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自南京市蔬菜科學(xué)研究所(31o43’N, 118o46’E)設(shè)施蔬菜大棚。供采樣大棚自2013年3月種植番茄，用于開展有機肥、生物有機肥、純化肥等不同施肥模式對連作番茄青枯病的影響試驗。采用對角線取樣法采集因不同施肥模式造成的番茄青枯病不同發(fā)病率的6個不同處理土壤(表1)，采土當(dāng)季(2019年6月)青枯病發(fā)病率分別為12.5%、21.9%、40.0%、59.4%、83.3% 和91.6%，每種土壤的基本理化性質(zhì)如表1所示。每種土壤采集30 kg，采集回實驗室自然風(fēng)干后，磨土過5目篩待用。

供試作物為番茄，品種為上海合作903。

供試肥料為化肥，分別為尿素(含N 46.3%)、重過磷酸鈣(含P2O543%)和硫酸鉀(含K2O 52%)。

表1 盆栽試驗前青枯病不同發(fā)病率土壤的基本理化性狀

1.2 供試土壤樣品采集

番茄田間試驗每個小區(qū)面積8 m2，種植世紀(jì)紅冠品種番茄40株，田間當(dāng)季試驗結(jié)束后，分別采集6個不同青枯病發(fā)病率的小區(qū)土壤，將番茄植株連根帶土取出后，采集土體土壤用于DNA提取，每種發(fā)病率的處理采集6個重復(fù)，共6個處理，累計36個土壤樣品，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 供試土壤DNA提取

提取土壤DNA進行高通量測序。使用PowerSoil DNA(MoBio Laboratories Inc., USA)試劑盒，參照說明書提取土壤樣品總DNA，–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測序數(shù)據(jù)的分析

根據(jù)Caporaso等[20]和Kozich等[21]的試驗方法，分別用520F：5′-AYT GGG YDT AAA GNG -3′和802R：5′-TAC NVG GGT ATC TAA TCC -3′引物測定細菌16S rRNA基因的V4區(qū)片段。將高通量測序獲得的原始下機數(shù)據(jù)進行一系列處理獲得用于后續(xù)分析OTU表格和分類信息，具體步驟如下：采用UPARSE 標(biāo)準(zhǔn)處理流程[22]，對序列質(zhì)量進行質(zhì)控，去除低質(zhì)量序列，拼接正反向序列；運用USEARCH軟件，按照UPARSE pipeline將拼接好的序列在97% 序列相似度的條件下生成可操作分類單元(OTU)初始表，提取每個OTU的代表性序列[22]；將OTU代表性序列上傳至網(wǎng)站http://rdp.cme.msu.edu進行序列比對(RDP na?ve Bayesian classifier, cutoff = 80%)。選用RDP 16S rRNA database數(shù)據(jù)庫對細菌群落進行分類注釋[23]，最終獲得每個OTU對應(yīng)的具體分類信息。

1.5 盆栽試驗設(shè)計

盆栽試驗于2019年8—10月在江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術(shù)研究重點實驗室宜興基地溫室進行，供試作物為番茄，共設(shè)置6個處理，分別為采集至青枯病發(fā)病率為12.5%、21.9%、40.0%、59.4%、83.3% 和91.6% 的田間6個處理移除番茄植株后的土壤。每個處理設(shè)置12個重復(fù)，每個盆缽裝土1.5 kg，72盆盆栽按番茄全生育期所需養(yǎng)分量(總氮225 kg/hm2，總磷(P2O5)150 kg/hm2和總鉀(K2O)225 kg/hm2)的1% 量施肥，每盆施肥量為：尿素0.52 g、重過磷酸鈣3.25 g和硫酸鉀0.47 g，與土拌勻作為基肥，每盆種植一株番茄，選取長勢均一的種苗移栽，常規(guī)管理。在番茄移栽后40 d的花期測定番茄植株生物量，此時所有植株均未發(fā)病。

1.6 番茄生物量的統(tǒng)計

于番茄移栽后第40天植株花期時測定番茄植株鮮物質(zhì)量和干物質(zhì)量。鮮物質(zhì)量：采集各處理完整植株，稱取植株鮮質(zhì)量。干物質(zhì)量：105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒量，稱取植株干質(zhì)量。

1.7 土壤和植株氮素含量的測定

對盆栽試驗前采集的初始土體土及盆栽種植40 d結(jié)束后的植株氮素含量進行測定，測定方法參照《土壤農(nóng)化分析》[24]。土壤全氮(TN)采用高氯酸–硫酸消煮法結(jié)合流動分析儀(BRAN+LUEBBE AutoAnalyzer 3，下同)測定。土壤NH4+-N、NO3–-N：稱取2.000 g的風(fēng)干土壤樣品于三角瓶中，加入20 ml 0.01 mol/L氯化鈣溶液，170 r/min震蕩30 min，過濾后用流動分析儀測定。植株氮素含量采用過氧化氫–硫酸消煮法結(jié)合流動分析儀測定。

1.8 植株氮素吸收效率

植株氮素吸收效率=植株氮素累積量/(土壤氮素含量+氮素投入量)

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Microsoft Excel 2007對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。用SPSS軟件(20.0, SPSS Inc. Chicago, IL)進行單因素方差分析(ANOVA)，用Duncan檢驗法來比較處理間的差異，顯著性水平設(shè)定為<0.05。用R語言(version 3.2.0)軟件對16S rDNA測序結(jié)果進行分析以及對微生物、土壤氮素含量、發(fā)病率和植株氮素吸收效率進行斯皮爾曼相關(guān)性分析，顯著水平設(shè)定為<0.05。

2 結(jié)果

2.1 青枯病不同發(fā)病率土壤對番茄生物量的影響

青枯病不同發(fā)病率土壤對番茄植株的影響如圖1所示。不同發(fā)病率土壤對植株的鮮物質(zhì)量和干物質(zhì)量有顯著性影響，整體上為土壤發(fā)病率越高，植株的鮮物質(zhì)量和干物質(zhì)量值越低，發(fā)病率91.6% 的土壤上，植株的鮮物質(zhì)量和干物質(zhì)量最低，平均每株干鮮物質(zhì)量值僅有8.76 g和52.63 g。而發(fā)病率12.5% 的土壤上則為最高，分別達到平均每株干鮮物質(zhì)量值為13.07 g和102.53 g。相比于發(fā)病率最低的土壤，發(fā)病率越高的土壤與發(fā)病率為12.5% 的土壤的植株鮮物質(zhì)量差異越顯著，且發(fā)病率為40.0%、59.4%、91.6% 的土壤與發(fā)病率為12.5% 的土壤的植株干物質(zhì)量差異顯著。

(圖中小寫字母不同表示不同處理間差異達P< 0.05顯著水平，下同)

2.2 植株氮素吸收效率及其與植株生物量的相關(guān)性

不同發(fā)病率土壤種植番茄后植株氮素吸收效率如圖2所示，發(fā)病率為12.5% 的土壤種植的番茄植株氮素吸收效率顯著高于發(fā)病率為91.6% 的土壤，其余處理雖然無顯著差異，但整體上體現(xiàn)出隨土壤發(fā)病率的增加，植株氮素吸收效率下降的趨勢(圖2)。氮素吸收效率與植株鮮物質(zhì)量和干物質(zhì)量的相關(guān)性分析表明，氮素吸收效率與植株的鮮物質(zhì)量和干物質(zhì)量均呈顯著正相關(guān)(圖3)，值均小于0.01。

圖2 青枯病不同發(fā)病率土壤對植株氮素吸收效率的影響

2.3 初始土壤氮素含量與植株氮素吸收效率的相關(guān)性

分析不同發(fā)病率土壤初始氮素含量與植株氮素吸收效率的相關(guān)性，結(jié)果表明，不同發(fā)病率土壤NH4+-N含量與植株氮素吸收效率顯著負相關(guān)，=0.016。NO3–-N和土壤全氮含量與植株氮素吸收效率間無顯著相關(guān)性(圖4)，值分別為0.31和0.81。

2.4 初始土壤細菌群落與植株氮素吸收效率的相關(guān)性

2.4.1 不同發(fā)病率土壤初始細菌多樣性及其與植株氮素吸收效率的相關(guān)性 種植番茄前不同發(fā)病率土壤微生物Alpha多樣性(Richness，Chao和Shannon)不同但無明顯規(guī)律(圖5)，進一步分析發(fā)現(xiàn)其與植株氮素吸收效率無顯著相關(guān)性(圖6)。

圖3 植株氮素吸收效率與生物量的相關(guān)性

圖4 不同發(fā)病率初始土壤氮素含量與植株氮素吸收效率的相關(guān)性

基于Bray-Curtis距離計算出不同發(fā)病率土壤初始細菌群落Beta多樣性(PCoA)(圖7A)。結(jié)果表明，發(fā)病率為12.5%、40.0%、83.3%、91.6% 的處理和發(fā)病率為21.9% 和59.4% 的處理分別沿著第一軸(PCoA1)有規(guī)律地分開，而發(fā)病率為12.5%、40.0%、83.3%、91.6% 的處理分別沿著第二軸(PCoA2)有規(guī)律地分開。PCoA1軸的差異可以解釋全面分析結(jié)果的27.1%，PCoA2軸的差異可以解釋全面分析結(jié)果的6.4%。且第一軸(PCoA1)和第二軸(PCoA2)與植株氮素吸收效率(圖7B)間無顯著性相關(guān)。

2.4.2 初始土壤關(guān)鍵細菌類群與植株氮素吸收效率相關(guān)性 根據(jù)種植番茄前不同發(fā)病率土壤細菌群落的測序結(jié)果，計算基于OTU的群落變化與植株氮素吸收效率間的相關(guān)性，結(jié)果如圖8所示，Mental檢測表明OTU的群落變化與植株氮素吸收效率有顯著正相關(guān)關(guān)系。進一步從所有OTU中挑選與植株氮素吸收效率顯著相關(guān)的OTU，結(jié)果如表2所示，其中OTU39、OTU142和OTU106與氮素吸收效率呈顯著負相關(guān)，這些OTU分別在屬水平上歸類于、和屬；而OTU236、OTU2920、OTU3160和OTU2203與植株氮素吸收效率呈顯著正相關(guān)，這些OTU分別屬于、、和屬(表2)。

圖5 不同發(fā)病率初始土壤細菌Alpha多樣性(Richness，Chao和Shannon)

圖6 不同發(fā)病率初始土壤細菌Alpha多樣性(Richness，Chao和Shannon)與植株氮素吸收效率的相關(guān)性

進一步探究與氮素吸收效率具顯著正相關(guān)性的OTU與發(fā)病率的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果如圖9所示，與植株氮素吸收效率呈顯著正相關(guān)的OTU2203 ()，同時與發(fā)病率呈顯著負相關(guān)，值小于0.01。

3 討論

青枯病是由青枯勞爾氏菌()引起的主要發(fā)生于茄科作物(如番茄、煙草、辣椒等)的細菌性土傳病害[25]。青枯病危害性較大，是嚴(yán)重制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)生產(chǎn)的主要土傳病害之一。本研究利用青枯病發(fā)病率分別為12.5%、21.9%、40.0%、59.4%、83.3% 和91.6% 的土壤進行盆栽試驗，探究不同發(fā)病率土壤是如何影響植株氮素吸收的。已有研究表明，連作障礙是由土壤養(yǎng)分失衡、有害微生物增加、土壤性質(zhì)惡化、化感物質(zhì)積累和微生物區(qū)系劣變等綜合因素作用的結(jié)果[26]。長期連作會造成根際周圍的土壤營養(yǎng)平衡失調(diào)，有益微生物數(shù)量降低[27]，植物生長受到阻礙，導(dǎo)致作物減產(chǎn)[28-34]。本研究通過在不同發(fā)病率土壤中種植番茄后對植株生物量和氮素吸收效率進行測定，結(jié)果顯示青枯病發(fā)病率越高的土壤植株長勢越差，且發(fā)病率越高的土壤植株干鮮重越低，植株的氮素吸收效率也越低，即高發(fā)病率土壤中的植株長勢差，生物量低，植株氮素吸收能力差，這和已有的研究一致。阮維斌等[35]研究發(fā)現(xiàn)大豆連作障礙導(dǎo)致大豆生物量下降，養(yǎng)分吸收總量顯著降低，固氮作用減弱，植株黃化等。本研究也表明了植株氮素吸收效率與植株的干鮮物質(zhì)量呈顯著正相關(guān)，植株的氮素吸收效率越高，植株的長勢越好。

圖7 土壤細菌Beta多樣性(A)及其與植株氮素吸收效率的相關(guān)性(B)

圖8 細菌OTU的群落變化與植物氮素吸收效率的相關(guān)性

在探究番茄植株在不同發(fā)病率土壤下影響植株氮素吸收效率的因素時，對種植番茄前的初始土壤提取土壤DNA進行高通量測序，同時測定初始土壤氮素含量。結(jié)果表明，并非初始土壤氮素含量越高，植株氮素吸收效率越高。影響植株氮素吸收效率的理化因素有多種，土壤氮磷比、碳氮比等都會影響植株的氮素吸收效率[36-37]，本研究并沒有發(fā)現(xiàn)土壤氮素含量與植株的氮素吸收效率間的正相關(guān)關(guān)系。

進一步在研究土壤初始微生物區(qū)系與番茄植株氮素吸收效率的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，初始土壤細菌群落的Alpha多樣性和Beta多樣性與植物氮素吸收效率均無顯著相關(guān)性。土壤微生物在土壤為植物提供養(yǎng)分過程中起著關(guān)鍵作用，它是陸地生態(tài)系統(tǒng)植物多樣性和生產(chǎn)力的重要驅(qū)動者[38]，本研究發(fā)現(xiàn)細菌群落多樣性指標(biāo)與植株氮素吸收效率無顯著相關(guān)性。但從PCoA分析發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)病率的供試土壤具有不同的細菌群落組成，這證實了不同健康程度的土壤具有不同的細菌群落多樣性[39]，且已有研究表明了有益細菌類群在防控青枯病發(fā)生和促進植株生長方面的聯(lián)合效應(yīng)[40]，推測土壤微生物群落中的某些關(guān)鍵細菌類群的差異，造成了植株的氮素吸收效率的差異。從細菌群落中的7 424個OTU中篩選出與植株氮素吸收效率顯著相關(guān)的OTU，結(jié)果顯示，OTU236、OTU2920、OTU3160、OTU2203與氮素吸收效率呈顯著正相關(guān)，他們分別屬于溶桿菌屬()、藤黃單胞菌屬()、藤黃單胞菌屬()、溶桿菌屬()。在與氮素吸收效率顯著正相關(guān)的微生物中，進一步發(fā)現(xiàn)OTU2203(溶桿菌屬)同時也與發(fā)病率呈負相關(guān)。研究表明，溶桿菌屬細菌對真菌、革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌均有明顯的拮抗作用，與其他生防菌相比，溶桿菌屬細菌能夠分泌幾丁質(zhì)酶、β-1,3-葡聚糖酶等多種胞外酶，該酶通過水解病原菌細胞壁抑制其增殖，從而提高植物的抗真菌能力[41]。同時溶桿菌屬也能分泌活性小分子物質(zhì)、生物表面活性劑、抗生素等來抑制病原菌的生理生化過程，從而達到對病原菌的拮抗效果[42]。溶桿菌屬因其高效、廣譜的拮抗作用，現(xiàn)已成為植物病害生防微生物的重要組成部分[43]。此外，藤黃單胞菌屬也對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等均具有一定的抗性，但對真菌沒有抗性[44]。目前已有研究表明有復(fù)合菌劑在盆栽試驗條件下能對番茄青枯病有抑制效果，同時也能促進番茄植株的生長[45]，本研究的結(jié)果與此一致。而溶桿菌屬和藤黃單胞菌屬是如何同時影響植株抗病和氮素吸收效率的，以及其在二者之間的作用機制還有待研究。

表2 與氮素吸收效率相關(guān)的關(guān)鍵細菌種群

圖9 與氮素吸收效率顯著正相關(guān)的OTU與初始發(fā)病率的相關(guān)性

4 結(jié)論

本研究表明，隨著初始土壤番茄青枯病發(fā)病率的逐漸升高，番茄植株長勢越來越差，且植株的氮素吸收效率也越來越低，初始土壤的全氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量與植株的氮素吸收效率無顯著正相關(guān)。在初始土壤的細菌群落方面，多樣性和群落組成與植株的氮素吸收效率無顯著性相關(guān)性，但基于OTU的細菌群落變化與植物氮素吸收效率呈顯著相關(guān)性，與番茄植株氮素吸收效率呈顯著正相關(guān)的OTUs分別歸屬于溶桿菌屬(OTU236和OTU2203)和藤黃單胞菌屬(OTU2920和OTU3160)，其中溶桿菌屬的細菌OTUs同時與初始土壤青枯病發(fā)病率呈負相關(guān)。

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Effects of Soils with Different Bacterial Wilt Disease Incidences on Nitrogen Absorption Efficiency of Tomato Plants

ZHU Chengzhi, DUAN Xu, ZHANG Na, XU Zhihui, DENG Xuhui, LI Rong*, SHEN Qirong

(College of Resources and Environmental Sciences/Jiangsu Provincial Key Laboratory of Solid Organic Waste Utilization/Jiangsu Collaborative Innovation Center of Solid Organic Wastes/Educational Ministry Engineering Center of Resource-Saving Fertilizers, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to evaluate the effects of soils with different bacterial wilt disease incidences on nitrogen uptake efficiency of tomato plants, tomato was used as the test plant and soils with different disease incidences (12.5%, 21.9%, 40.0%, 59.4%, 83.3% and 91.6%) were collected to conduct a greenhouse pot experiment. The results showed that with the increase of initial soil bacterial wilt disease incidence, tomato plant biomass and nitrogen uptake efficiency showed a significant decreasing trend. There was no significant correlation between the contents of soil total N, ammonium N and nitrate N with plant N uptake efficiency at the beginning. No significant correlation between initial soil bacterial diversity and community composition with plant nitrogen absorption efficiency; however, significant correlation was observed between bacterial community change based on OTU analysis and plant N uptake efficiency. The relative abundances ofandshowed a significant and positive correlation with plant N uptake efficiency, and among whichalso showed a significant and negative correlation with tomato bacterial wilt disease incidence. In conclusion, this study observed that the initial bacterial community in soil with continuous cropping obstacle, but not nitrogen nutritional status, was correlated with the plant nitrogen uptake.

Continuous cropping obstacle; Bacterial wilt disease; Nitrogen absorption efficiency; Tomato; Soil bacteria community

S154

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.03.003

朱成之, 段旭, 張娜, 等. 青枯病不同發(fā)病率土壤對番茄植株氮素吸收效率的影響. 土壤, 2022, 54(3): 446–454.

國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0200305)、國家自然科學(xué)基金項目(41977044，32002132)、江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK20200562)、中國博士后基金面上項目(2020M671520)和大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目(202013xx06)資助。

(lirong@njau.edu.cn)

朱成之(1997—)，女，安徽蕪湖人，碩士研究生，主要從事植物營養(yǎng)學(xué)研究。E-mail: 535665015@qq.com