段慧竹，劉佳星，閆 艷*，杜晨暉*

腸道菌群介導(dǎo)的酸棗仁總黃酮體內(nèi)代謝輪廓研究

段慧竹1，劉佳星2，閆 艷2*，杜晨暉1*

1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 太原 030619 2. 山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006

比較正常和抗生素大鼠對酸棗仁總黃酮體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化反應(yīng)的差異，及2組大鼠血漿中斯皮諾素的藥動學(xué)變化特征。采用ig聯(lián)合抗生素建立抗生素干預(yù)大鼠模型；正常與抗生素大鼠ig酸棗仁總黃酮（120 mg/kg），收集糞便及不同時(shí)間點(diǎn)的血漿樣品。采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析糞便中原型成分及代謝產(chǎn)物；以黃芩苷為內(nèi)標(biāo)，建立UPLC-MS/MS測定大鼠血漿中斯皮諾素含量的方法，并應(yīng)用于斯皮諾素在正常與抗生素大鼠體內(nèi)藥動學(xué)比較研究。正常及抗生素大鼠糞便中共鑒定了24個(gè)化合物，包括9個(gè)原型成分（維采寧II、斯皮諾素、牡荊素、異牡荊素、當(dāng)藥黃素、異當(dāng)藥黃素、山柰酚-3--蕓香糖苷、6′′′--香豆酰斯皮諾素、6′′′-阿魏酰斯皮諾素）和15個(gè)代謝產(chǎn)物。正常大鼠中主要發(fā)生氫化、糖基化等4種代謝反應(yīng)，抗生素干預(yù)后發(fā)生了脫甲氧基、去羥基化等6種代謝反應(yīng)。與正常組相比，抗生素組大鼠血漿中斯皮諾素的血藥濃度顯著降低（＜0.05），達(dá)峰時(shí)間和半衰期顯著升高（＜0.05）?？股馗深A(yù)會導(dǎo)致酸棗仁黃酮類成分在大鼠體內(nèi)代謝反應(yīng)紊亂，并影響斯皮諾素的藥動學(xué)行為。

酸棗仁總黃酮；抗生素大鼠；腸道菌群；體內(nèi)代謝；藥動學(xué)；維采寧II；斯皮諾素；牡荊素；異牡荊素；當(dāng)藥黃素；異當(dāng)藥黃素；山柰酚-3--蕓香糖苷；6′′′--香豆酰斯皮諾素；6′′′-阿魏酰斯皮諾素

酸棗仁為鼠李科植物酸棗Mill. var.(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟種子，具有養(yǎng)心安神，斂汗、生津之功效[1]。酸棗仁富含皂苷、黃酮、生物堿和脂肪酸等活性成分[2]。黃酮類成分在酸棗仁中含量較高（質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)3.94%），且具有鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、抗抑郁、抗氧化和改善學(xué)習(xí)記憶等多種藥理活性[3-7]。迄今，已從酸棗仁中分離鑒定了34種黃酮類成分，多為以芫花素為母核的C-6/8位碳糖苷黃酮，尚含有少量的C-3/7位的氧糖苷黃酮化合物[8]。

酸棗仁黃酮藥理活性廣泛，但體內(nèi)代謝過程研究表明其入血吸收困難，生物利用度低[9]。Zhang等[10]研究表明正常大鼠ig斯皮諾素20 mg/kg后，其絕對生物利用度僅為2.20%。正常大鼠分別iv斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素單體（5 mg/kg）后，兩者表現(xiàn)出相同的藥動學(xué)趨勢，均在0.75 h快速減少。此外，6′′′-阿魏酰斯皮諾素最大血藥濃度（max）明顯低于斯皮諾素，與ig酸棗仁黃酮提取物的結(jié)果一致[11]。本課題組前期研究也表明正常大鼠ig酸棗仁水提物（生藥量30 g/kg）后，斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素的max分別為（45.22±7.94）、（15.83±1.54）ng/mL[12]。由此可見，酸棗仁黃酮研究中存在藥動學(xué)與藥效學(xué)相矛盾的現(xiàn)象，對闡明酸棗仁黃酮類成分的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提出了挑戰(zhàn)。

腸道菌群作為“人體肝臟以外的第2個(gè)代謝性器官”，富含大量與物質(zhì)代謝相關(guān)的酶系[13]，因此對藥物的代謝轉(zhuǎn)化及吸收有重要影響。大部分酸棗仁黃酮具有C-6位碳糖苷的母核結(jié)構(gòu)，同時(shí)又具有酚羥基。正常腸道菌群對黃酮類成分的代謝反應(yīng)，一般包括糖基化反應(yīng)、去甲基化反應(yīng)、還原反應(yīng)以及環(huán)裂變反應(yīng)等[14-16]。本課題組前期研究酸棗仁水提物的體外腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)以斯皮諾素為母核的-糖黃酮苷和以山柰酚為母核的-糖黃酮苷，均可被腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化為次級黃酮苷[17]。Bao等[18]通過SD大鼠ig酸棗仁總黃酮180 mg/kg（相當(dāng)于原生藥30 g/kg），發(fā)現(xiàn)糞便中的代謝物在12 h最為豐富，且斯皮諾素和當(dāng)藥黃素在糞便中含量較高，表明其過程可能涉及了腸道菌群代謝。閆艷等[19]建立UHPLC-Q-Exactive軌道離子阱高分辨質(zhì)譜分析酸棗仁水提物體內(nèi)、體外成分，通過體內(nèi)-體外物質(zhì)組關(guān)聯(lián)，在正常大鼠ig酸棗仁水提物后的尿液中共鑒定和推斷出8個(gè)黃酮原型及4個(gè)代謝產(chǎn)物，并據(jù)此推斷黃酮類化合物體內(nèi)代謝反應(yīng)主要為腸道水解和環(huán)裂解反應(yīng)。因此，深入探討腸道菌群對酸棗仁黃酮類成分的代謝特征及藥動學(xué)的影響，對闡明酸棗仁藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

本研究首先采用ig三聯(lián)復(fù)合抗生素建立抗生素干預(yù)大鼠模型，利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)快速分析ig酸棗仁總黃酮后在正常與抗生素大鼠糞便中的原型及代謝產(chǎn)物。其次，建立采用UPLC-MS/MS同時(shí)測定大鼠血漿中斯皮諾素含量的方法，并應(yīng)用于正常與抗生素大鼠ig酸棗仁總黃酮后的斯皮諾素藥動學(xué)比較研究。以期從腸道菌群代謝和藥動學(xué)的角度，揭示腸道菌群對酸棗仁黃酮類成分吸收和代謝的影響，為酸棗仁總黃酮的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠16只，6～8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。動物實(shí)驗(yàn)符合動物倫理委員會的標(biāo)準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2021DW172）。動物飼養(yǎng)在室溫（24±2）℃、相對濕度55%～65%、12 h明暗循環(huán)的環(huán)境。動物飼養(yǎng)用水均經(jīng)過高壓滅菌，飼料及墊料均為無菌型。

1.2 儀器

5600 Q-TOF型高分辨質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）；Triple Quad 4500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，電噴霧電離源（美國AB Sciex公司）；LC-20AD型超高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；CPA225D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.3 藥品與試劑

頭孢羥氨芐、土霉素、紅霉素均購自上海索萊寶試劑有限公司；無菌飼料、無菌墊料購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；質(zhì)譜純甲醇、乙腈、甲酸購自美國Thermo Fisher Scientific公司；其他試劑均為分析純；對照品斯皮諾素（批號20160314）、6′′′-阿魏酰斯皮諾素（批號20160313）和內(nèi)標(biāo)黃芩苷（批號20130915）均購自寶雞市辰光生物科技有限公司；維采寧II（批號3922）、異牡荊素（批號7873）、當(dāng)藥黃素（批號4039）、牡荊素（批號3593）和山柰酚-3--蕓香糖苷（批號6510）均購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，經(jīng)HPLC歸一化法測定以上對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。酸棗仁總黃酮為實(shí)驗(yàn)室自制，紫外分光光度發(fā)測定酸棗仁總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58%，得率為0.4%，UPLC-MS/MS測定酸棗仁總黃酮中斯皮諾素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.4%[20]。

2 方法

2.1 糞便代謝產(chǎn)物定性分析

2.1.1 色譜條件 Acquity UPLC?HSS T3色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～8 min，5%～17% B；8～10 min，17% B；10～11 min，17%～18% B；11～12 min，18%～20% B；12～17 min，20%～23% B；17～22 min，23%～33% B；22～25 min，33%～100% B。體積流量為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 5600 Q-TOF離子源為電噴霧離子源（ESI）；正離子模式掃描；霧化氣（GS1，N2）壓力為55 psi（1 psi＝6.895 kPa）；輔助氣（GS2，N2）壓力為55 psi；源噴射電壓（IS）為5500 V；霧化溫度為450 ℃；氣簾氣（curtain gas，N2）壓力為30 psi。

2.1.3 動物分組、給藥及樣品收集 SD大鼠6只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組（＝3）和抗生素組（＝3），抗生素組大鼠以無菌水、無菌飼料喂養(yǎng)，并使用無菌墊料?？股亟M每天ig聯(lián)合抗生素[頭孢羥氨芐（100 mg/kg）、土霉素（300 mg/kg）和紅霉素（300 mg/kg）]，2次/d，連續(xù)3 d?？股亟M大鼠代謝2 d后ig酸棗仁總黃酮（120 mg/kg），連續(xù)給藥2 d；正常組ig等劑量的酸棗仁總黃酮，連續(xù)給藥2 d；于末次給藥前，各組大鼠禁食12 h，給藥后將大鼠置于代謝籠中，于置有冰盒的瓶子中收集0～24 h糞便，期間自由飲水。

2.1.4 樣本的預(yù)處理 糞便樣品50 ℃烘干，稱取2組糞便樣品各0.75 g，分別加入15 mL甲醇，超聲提取30 min，4 ℃、3500 r/min離心10 min，取上清液2 mL，上樣于活化后的SPE C18固相萃取小柱。依次用6 mL蒸餾水和6 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，N2吹干，以800 μL初始流動相復(fù)溶，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取上清分析。

2.1.5 16S rRNA測序 將收集的正常組與抗生素組大鼠糞便置于凍存管中，交于上海派森諾生物科技有限公司，進(jìn)行16S rRNA基因V3～4區(qū)的測序分析。

2.2 血漿藥動學(xué)研究

2.2.1 色譜條件 Acquity UPLC?HSS T3色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～8 min，5%～17% B；8～10 min，17% B；10～11 min，17%～18% B；11～12 min，18%～20% B；12～14 min，20%～33% B；14～17 min，33%～100% B。體積流量為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 AB Triple Quad 4500離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描模式為MRM負(fù)離子掃描；源噴射電壓（IS）為?4500 V；霧化溫度為550 ℃；氣簾氣（curtain gas，N2）壓力為40 psi；霧化氣（GS1，N2）壓力為50 psi；輔助氣（GS2，N2）壓力為50 psi。斯皮諾素及內(nèi)標(biāo)成分通過針泵進(jìn)樣優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，詳見表1。

表1 斯皮諾素和黃芩苷的質(zhì)譜參數(shù)信息

Table 1 Mass spectrometry parameters of spinosin and baicalin

成分tR/min碎片離子(m/z)二級碎片離子(m/z)去簇電壓/V碰撞電壓/eV 斯皮諾素11.31607.0427.0?160?45 黃芩苷12.74445.0269.3?90?36

2.2.3 儲備液的制備 取對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制備成含斯皮諾素1.02 mg/mL和黃芩苷0.96 mg/mL的單一對照品溶液。

2.2.4 工作溶液的制備 精密吸取斯皮諾素對照品儲備液適量加70%甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度分別為12.15、244.35、266.45、855.15、977.25、1 221.60 ng/mL的工作溶液；另精密吸取內(nèi)標(biāo)儲備液適量加70%甲醇溶液配制成黃芩苷為28.7 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.5 模擬生物樣本的制備 分別精密吸取內(nèi)標(biāo)溶液、斯皮諾素系列工作溶液各10 μL，加入到150 μL的空白血漿中制成質(zhì)量濃度為0.81、16.29、24.43、57.01、65.15、81.44 ng/mL的模擬生物樣本。

2.2.6 血漿樣品處理 取內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，揮干，加150 μL血漿渦旋1 min，然后加乙腈450 μL，渦旋3 min，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，取上清液400 μL于EP管中，離心濃縮蒸干，100 μL 70%甲醇（含0.1%甲酸）溶液復(fù)溶，4 ℃、13 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)樣分析。

2.2.7 方法學(xué)考察

（1）專屬性考察：取大鼠空白血漿、模擬生物血漿樣品和0.75 h含藥血漿按“2.2.6”項(xiàng)下方法處理血漿樣品進(jìn)樣分析。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低定量下限（LLOQ）：以待測成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為縱坐標(biāo)（），血漿中加入的待測成分對照品的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)（），采用1/2加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，求出線性回歸方程。LLOQ為標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，其響應(yīng)值應(yīng)為空白生物基質(zhì)干擾物響應(yīng)值的10倍以上（/≥10），且精密度表示為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）應(yīng)≤20%；并計(jì)算LLOQ點(diǎn)的準(zhǔn)確度，其回算的質(zhì)量濃度應(yīng)在標(biāo)示質(zhì)量濃度的±20%。其余質(zhì)控樣品回算的質(zhì)量濃度應(yīng)在標(biāo)示質(zhì)量濃度的±15%內(nèi)。

（3）精密度與準(zhǔn)確度：批內(nèi)精密度采用LLOQ、低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品工作液在同一工作日內(nèi)進(jìn)行測定。批間精密度采用3個(gè)分析批的LLOQ、低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品工作液連續(xù)3 d進(jìn)樣，每個(gè)濃度5個(gè)樣品進(jìn)樣分析，以RSD來評估批內(nèi)、批間精密度，LLOQ樣品的RSD不得超過20%，低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的RSD不得超過15%；用相對誤差（relative error，RE）來評估批內(nèi)、批間準(zhǔn)確度，LLOQ樣品的RE不得超過20%，低、中、高濃度質(zhì)控樣品的RE不得超過15%。

（4）基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率：取內(nèi)標(biāo)和LLOQ、低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控工作溶液各10 μL，揮干，加入150 μL空白血漿，按“2.2.6”項(xiàng)下制備質(zhì)控樣品（A）；取150 μL空白血漿按“2.2.6”項(xiàng)下方法處理，上清液分別加入內(nèi)標(biāo)、LLOQ、低、中、高濃度質(zhì)控工作液10 μL（B）；以水溶液代替空白血漿按“2.2.6”項(xiàng)下方法處理，上清液分別加入內(nèi)標(biāo)、LLOQ、低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控工作液10 μL（C）。以相同質(zhì)量濃度A與B溶液的峰面積比值計(jì)算提取回收率；以B與C溶液的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

（5）穩(wěn)定性：取內(nèi)標(biāo)和LLOQ、低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控工作溶液各10 μL，揮干，加入150 μL空白血漿，混勻，分別于?80 ℃反復(fù)凍融3次、?80 ℃下保存20 d和室溫下血漿樣品放置4 h考察樣品處理前穩(wěn)定性；按“2.2.6”項(xiàng)下方法處理后的質(zhì)控樣品考察進(jìn)樣器4 ℃放置24 h穩(wěn)定性及室溫下放置4 h穩(wěn)定性。以RSD和RE來評估樣品穩(wěn)定性，LLOQ樣品的RSD、RE不得超過20%，低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的RSD、RE不得超過15%。

2.2.8 動物分組及藥動學(xué)研究 SD大鼠10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常組（＝5）和抗生素組（＝5），抗生素組大鼠以無菌水、無菌飼料喂養(yǎng)，并使用無菌墊料?？股亟M按“2.1.3”項(xiàng)下方法造模成功后，代謝2 d；造模期間正常對照組ig等體積的生理鹽水。給藥前禁食12 h，自由飲水，2組大鼠均ig酸棗仁總黃酮（120 mg/kg）。分別于給藥前及給藥后0.083、0.167、0.333、0.5、0.75、1、2、4、6、10 h眼眶采血，置于預(yù)先涂有1%肝素鈉的EP管中，3500 r/min離心10 min，取上清，即得血漿。

2.2.9 藥動學(xué)數(shù)據(jù)處理 采用DAS 3.2.8數(shù)據(jù)處理軟件（中國藥理學(xué)會數(shù)學(xué)藥理學(xué)專業(yè)委員會），以非房室模型法（統(tǒng)計(jì)矩法）進(jìn)行藥動學(xué)參數(shù)達(dá)峰濃度（max）、達(dá)峰時(shí)間（max）、半衰期（1/2）、血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC0～t）、平均駐留時(shí)間（MRT0～t）、總體清除率（CL/F）等的計(jì)算，并對研究時(shí)間延長至無窮后的參數(shù)AUC0～∞、MRT0～∞進(jìn)行預(yù)測。

3 結(jié)果

3.1 正常與抗生素大鼠的菌群差異分析

3.1.1 菌群數(shù)量分析 在正常狀態(tài)下，糞便微生物與菌群之間保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，并且與宿主之間保持相對平衡。當(dāng)菌群發(fā)生改變，糞便微生物數(shù)量也隨之改變。如圖1所示，與正常組相比，抗生素組大鼠腸道菌群的分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）總數(shù)量顯著降低（＜0.01），表明抗生素組大鼠腸道菌群數(shù)量發(fā)生了明顯的改變，抗生素大鼠模型制備成功。

3.1.2 菌群多樣性分析 本研究腸道微生物群落的Alpha多樣性分析以Chao指數(shù)、Observed_species指數(shù)（表征豐富度）及Shannon指數(shù)（表征多樣性）進(jìn)行評估。如圖2所示，正常組大鼠腸道菌群中Chao指數(shù)、Observed_species指數(shù)及Shannon指數(shù)顯著高于抗生素大鼠（＜0.05），表明經(jīng)抗生素干預(yù)后大鼠腸道菌群Alpha多樣性降低，菌群穩(wěn)態(tài)被破壞。

3.1.3 菌群差異分析 為了明確抗生素干預(yù)對大鼠腸道菌群的影響，利用微生物信息進(jìn)行LEfSe分析。結(jié)果以顯著差異物種LDA值分布柱狀圖（圖3）進(jìn)行展示。正常腸道菌群主要由厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形桿門和疣微菌門組成。LEfSe分析顯示在正常大鼠糞便中包括厚壁菌門的乳酸桿菌屬、瘤胃球菌、梭菌科梭菌屬、擬桿菌門的普雷沃菌屬、變形菌門的志賀氏菌屬、放線菌門的安德克氏菌屬、疣微菌門的阿克曼菌屬等13種標(biāo)志性差異菌屬（LDA＞3，＜0.05）。經(jīng)抗生素干預(yù)后，大鼠腸道菌群的數(shù)量和組成均有顯著改變，LEfSe分析顯示僅有厚壁菌門的真細(xì)菌屬和放線菌門的雙歧桿菌屬成為其標(biāo)志性菌屬（LDA＞3，＜0.05），菌群組成穩(wěn)態(tài)被破壞。

3.2 正常大鼠與抗生素大鼠糞便中原型成分及代謝產(chǎn)物的鑒定

利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分別對酸棗仁總黃酮體外樣品、正常組大鼠糞便樣品、抗生素組大鼠糞便樣品進(jìn)行檢測，基峰離子流圖見圖4。利用Metabolite Pilot軟件對采集的正常組和抗生素大鼠組糞便原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，原型成分與代謝產(chǎn)物信息見表2。

首先，對已知成分采用對照品進(jìn)行裂解規(guī)律分析。在正離子模式下，斯皮諾素、當(dāng)藥黃素和6′′′阿魏酰斯皮諾素均產(chǎn)生了碎片離子429.118 2、351.086 3、327.086 7和297.076 0。177.054 3為6′′′阿魏酰斯皮諾素阿魏?；奶卣魉槠x子。異牡荊素和牡荊素分別為以芹菜素為母核的C-6碳糖和C-8碳糖。在正離子模式下，兩者通過丟失中性碎片-C5H10O5、-CO和-H2O，產(chǎn)生特征碎片337、313、283。維采寧II為以芹菜素為母核的C-6和C-8雙碳糖類，337、325、295為其特征碎片[21]。以上黃酮碳糖類成分均有規(guī)律地脫去120（C4H8O4）、90（C3H6O3）和60（C2H4O2）產(chǎn)生碎片離子。此外，山柰酚-3--蕓香糖苷為酸棗仁中代表性的黃酮氧糖苷類成分。在正離子模式下，其通過直接脫掉雙糖苷產(chǎn)生287的特征碎片[22]。

表2 基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS的正常組和抗生素組大鼠的原型及代謝產(chǎn)物

Table 2 Prototype and metabolites of rats in normal group and antibiotic-treated groupbased on UHPLC-Q-TOF-MS/MS

編號tR/min[M＋H]+偏差/(×10?6)碎片離子分子式成分平均峰面積(n = 3) 正常組抗生素組 1a9.68595.165 3?0.7577.153 5, 559.143 6, 457.112 0, 379.070 1, 337.070 1, 325.070 4, 313.070 9, 295.059 5C27H30O15維采寧II7.03×10?4±8.98×10?31.05×10?5±1.25×10?4** M110.63741.221 5?2.9609.177 0, 489.137 1, 447.124 9, 429.116 3, 351.085 6, 327.085 7, 297.074 1C33H40O19斯皮諾素葡萄糖基化去甲氧基產(chǎn)物ND6.93×10?4±4.07×10?4 M211.21625.172 5?0.7607.171 5, 505.131 5, 463.121 4, 445.110 0, 397.0903, 367.080 5, 343.078 3, 313.070 4C28H32O16斯皮諾素羥基化產(chǎn)物ND9.94×10?4±6.97×10?4 M311.92463.122 6?2.0445.112 0,409.090 6, 367.068 8, 343.080 4, 313.070 4C22H22O11當(dāng)藥黃素羥基化產(chǎn)物ND2.93×10?4±1.87×10?4 M413.41449.144 40.3431.132 8, 413.122 6, 395.111 8, 365.101 7, 353.101 9, 329.101 6, 299.090 7, 275.054 2, 245.043 7, 233.043 5, 209.043 8C22H24O10當(dāng)藥黃素氫化產(chǎn)物9.29×10?5±1.14×10?4ND M513.44771.233 7?0.7651.189 8, 609.176 3, 591.167 7, 489.139 8, 447.126 2, 429.116 2, 351.084 9, 327.085 8, 297.075 1, 285.073 7, 145.050 9C34H42O20斯皮諾素葡萄糖基化 產(chǎn)物ND1.10×10?5±4.91×10?4 2a13.68609.182 31.4489.139 1, 447.127 7, 429.118 2, 351.086 3, 327.086 7, 297.076 0, 285.075 7C28H32O15斯皮諾素2.57×10?4±3.11×10?43.67×10?7±4.97×10?3* 3a13.70433.112 2?1.6415.102 2, 397.090 5, 337.070 9, 313.070 4, 283.059 8C21H20O10牡荊素2.21×10?5±2.62×10?54.04×10?5±7.03×10?4 M613.83579.169 6?2.2433.112 1, 415.098 7, 337.070 1, 313.069 3, 301.139 9C27H30O14維采寧II去羥基化產(chǎn)物ND1.79×10?4±4.97×10?3 4a14.01433.113 61.5397.090 5, 367.083 5, 337.071 4, 313.069 7, 283.058 6C21H20O10異牡荊素3.49×10?5±4.55×10?42.09×10?6±8.04×10?5* 5a14.63447.129 11.1429.118 2, 411.107 4, 351.086 3, 327.086 7, 297.076 0C22H22O10當(dāng)藥黃素4.51×10?6±5.24×10?56.90×10?6±2.90×10?4* M714.65429.118 10.2411.098 5, 393.093 9, 375.264 3, 351.083 8, 327.104 8, 323.162 1, 297.074 8, 285.078 8C22H20O9當(dāng)藥黃素脫水產(chǎn)物3.18×10?5±3.74×10?35.15×10?5±2.23×10?5 M814.95463.123 2?0.7445.111 6, 397.090 9, 367.080 3, 343.080 0, 313.070 8C22H22O11當(dāng)藥黃羥基化產(chǎn)物ND5.98×10?4±1.48×10?3 615.38447.126 10.5327.085 9, 299.054 5C22H22O10異當(dāng)藥黃素3.49×10?5±4.55×10?42.09×10?6±8.04×10?5** M915.88449.108 50.4287.054 9, 145.050 1C21H20O11山柰酚葡萄糖基化產(chǎn)物ND1.78×10?5±4.70×10?4 715.89595.166 71.5449.106 6, 287.054 2C27H30O15山柰酚-3-O-蕓香糖苷ND9.32×10?5±2.99×10?4 M1016.17771.213 20.1651.165 8, 609.177 9, 447.153 7, 429.117 7, 351.085 2, 327.085 2, 297.075 8, 163.038 6C37H38O186′′′-阿魏酰斯皮諾素去甲基產(chǎn)物ND9.76×10?5±5.81×10?4 818.15755.215 1?0.4635.174 4, 609.179 7, 447.128 0, 429.117 4, 327.086 0, 297.075 8, 147.043 9C37H38O176′′′-p-香豆酰斯皮諾素3.62×10?2±1.61×10?22.56×10?6±1.13×10?4** 9a18.36785.228 2?0.7665.185 8, 605.164 8, 489.138 4, 447.128 5, 429.118 2, 351.086 3, 327.086 7, 297.076 0, 285.075 1, 177.054 3C38H40O186′′′-阿魏酰斯皮諾素ND1.32×10?7±5.02×10?6 M1118.55447.129 30.9411.284 7, 343.091 5, 327.081 7, 297.068 9, 285.074 7, 207.024 4C22H22O10芫花素葡萄糖基化產(chǎn)物1.67×10?4±6.11×10?3ND M1218.99803.238 5?1.0683.211 1, 429.118 2, 351.085 5, 327.085 6, 195.064 6C38H42O196′′′-阿魏酰斯皮諾素水合產(chǎn)物1.00×10?5±8.77×10?5ND M1318.90433.132 8?2.0415.138 9, 397.125 3, 337.118 5, 327.112 5, 311.106 0, 301.107 2, 297.221 3, 285.221 4, 249.075 7, 245.083 3C22H22O9當(dāng)藥黃素去甲基產(chǎn)物1.14×10?4±3.73×10?3ND M1421.06755.218 1?0.1635.173 4, 447.128 5, 429.114 3, 351.082 6, 327.085 1, 285.073 4, 147.044 1C37H38O176′′′-阿魏酰斯皮諾素去甲氧基產(chǎn)物ND4.29×10?4±1.79×10?4 M1522.37415.138 90.3397.314 8, 355.115 2, 327.088 7, 323.082 4, 279.209 9, 263.066 4, 235.116 0C22H22O8當(dāng)藥黃素去羥基化產(chǎn)物ND1.93×10?4±6.60×10?2

a通過與對照品比較確定；ND為未檢測到；與正常組比較：*＜0.05**＜0.01

adetermined by comparison with standard; ND is not detected;*< 0.05**< 0.01normal group

參考以上裂解特征碎片及文獻(xiàn)報(bào)道[23]，在2組糞便中快速表征和鑒別了24個(gè)化合物，其中9個(gè)原型成分和15個(gè)代謝產(chǎn)物。

由表2可知，在抗生素組大鼠糞便中鑒定了9種原型成分，分別為維采寧II（1）、斯皮諾素（2）、牡荊素（3）、異牡荊素（4）、當(dāng)藥黃素（5）、異當(dāng)藥黃素（6）和山柰酚-3--蕓香糖苷（7）、6′′′--香豆酰斯皮諾素（8）及6′′′-阿魏酰斯皮諾素（9）；在正常大鼠鑒定了維采寧II（1）、斯皮諾素（2）、牡荊素（3）、異牡荊素（4）、當(dāng)藥黃素（5）、異當(dāng)藥黃素（6）及6′′′--香豆酰斯皮諾素（8）共7種原型成分。其中異當(dāng)藥黃素（6）及6′′′--香豆酰斯皮諾素（8）通過與文獻(xiàn)比對鑒別[24]。

在正常組與抗生素組大鼠糞便中共鑒定了15種代謝產(chǎn)物。抗生素組大鼠糞便中11種代謝產(chǎn)物，即M1～M3、M5～M10和M14～M15，主要發(fā)生去甲基化、脫甲氧基、去羥基化等I相代謝反應(yīng)及葡萄糖基化II相代謝反應(yīng)。如圖4所示，抗生素組大鼠糞便總離子流圖信息更為豐富，抗生素大鼠中11種代謝物結(jié)構(gòu)式及二級質(zhì)譜圖信息見圖5、6。

M2的相對分子質(zhì)量（/625.172 5）比斯皮諾素多16。二級質(zhì)譜顯示碎片離子/505.131 5為母離子丟失C4H8O4（120）所得。此外，碎片離子/463.121 4比斯皮諾素特征碎片/447多16，推測M2為斯皮諾素羥基化代謝產(chǎn)物。M3和M8的準(zhǔn)分子離子峰分別為/463.122 6和/463.123 2，比當(dāng)藥黃素相對分子質(zhì)量多16，且其二級質(zhì)譜碎片離子分別比當(dāng)藥黃素特征碎片離子351.086 3、327.086 3和297.075 5多16，因此推測M3和M8為當(dāng)藥黃素的羥基化產(chǎn)物。

M1產(chǎn)生/741.221 5 [M＋H]+的分子離子峰。母離子通過脫去C5H8O4（132）產(chǎn)生碎片離子609.177 0，推測母核為斯皮諾素。碎片離子609進(jìn)一步丟失中性碎片C4H8O4（120）產(chǎn)生碎片離子489.137 1或直接脫去1分子Glu，產(chǎn)生碎片離子447.124 9、327.085 7和297.074 1。因此，推測M1為斯皮諾素葡萄糖基化再脫甲氧基代謝產(chǎn)物。M14產(chǎn)生755.218 1的分子離子峰，相對分子質(zhì)量比6′′′-阿魏酰斯皮諾素少了30，并產(chǎn)生特征碎片離子447.128 5、429.114 3和327.085 1。因此推測M14為6′′′-阿魏酰斯皮諾素的脫甲氧基代謝產(chǎn)物。

M5準(zhǔn)分子離子峰為/771.233 7 [M＋H]+，比斯皮諾素相對分子質(zhì)量多162（Glu），結(jié)合二級質(zhì)譜碎片信息/609.176 3、489.139 8、327.085 8，推測M5為斯皮諾素的葡萄糖基化代謝產(chǎn)物。M9產(chǎn)生449.108 5 [M＋H]+的分子離子峰，通過丟失1分子Glu（162）產(chǎn)生特征碎片離子/287.054 9 （山柰酚），推測M9為山柰酚葡萄糖基化產(chǎn)物。

圖5 酸棗仁總黃酮在抗生素大鼠糞便中代謝途徑

圖6 抗生素大鼠糞便中11種代謝產(chǎn)物提取離子流圖

M6產(chǎn)生579.169 6 [M＋H]+的分子離子峰。其相對分子質(zhì)量比維采寧II多16，并產(chǎn)生碎片離子337.070 1、313.069 3和301.139 9，推測M6為維采寧II的脫羥基代謝產(chǎn)物。M15產(chǎn)生415.138 9的分子離子峰，比當(dāng)藥黃素少32，并產(chǎn)生與當(dāng)藥黃素相同的碎片離子327.088 7，因此，推測M15為當(dāng)藥黃素脫2分子羥基代謝產(chǎn)物，且羥基均從糖基側(cè)鏈丟失。

M10產(chǎn)生771.213 2 [M＋H]+的分子離子峰和碎片離子609.177 9、447.153 7、327.085 2和297.075 8。此外，163.038 6為阿魏?；揅H3生成的碎片離子，推測M10為6′′′-阿魏酰斯皮諾素的去甲基產(chǎn)物，且甲基從阿魏?；鶃G失。

正常大鼠糞便中鑒定了5種代謝產(chǎn)物，即M4、M7、M11～M13，主要發(fā)生氫化、去甲基化、糖基化、水合等代謝反應(yīng)類型。M4產(chǎn)生分子離子峰449.144 4，碎片離子431.132 8、413.122 6、353.101 9和329.101 6分別比當(dāng)藥黃素碎片離子429.117 6、411.107 4、351.086 3和327.087 2多2，推測M4為當(dāng)藥黃素氫化代謝產(chǎn)物。M11產(chǎn)生447.129 3的分子離子峰，通過丟失中性碎片C4H8O4產(chǎn)生碎片離子327.081 7及碎片離子z 297.068 9、285.074 7和207.024 4。與本課題組前期[25]研究一致，推測M11為芫花素葡萄糖基化代謝產(chǎn)物。M12產(chǎn)生803.238 5的分子離子峰，通過丟失中性碎片C4H8O4產(chǎn)生碎片離子683.211 1及碎片離子429.118 2、327.085 6和195.064 6。其中碎片離子195.064 6較阿魏?；槠x子多18，因此，推測M12為6′′′-阿魏酰斯皮諾素水合產(chǎn)物。M13產(chǎn)生分子離子峰433.132 8，碎片離子415.138 9、397.125 3、337.118 5均比當(dāng)藥黃素碎片離子429.117 6、411.107 4、351.086 3少14，推測M13為當(dāng)藥黃素去甲基化代謝產(chǎn)物。

2組中共同鑒別到7種原型成分及1種代謝產(chǎn)物，其峰面積均在抗生素組均顯著高于正常組（＜0.05），見表2。共有代謝產(chǎn)物M7產(chǎn)生/429.118 1 [M＋H]+的分子離子峰，比當(dāng)藥黃素相對分子質(zhì)量少16，產(chǎn)生當(dāng)藥黃素特征碎片離子/411.098 5、351.083 8、327.104 8、297.074 8，推測其為當(dāng)藥黃素脫水反應(yīng)的代謝產(chǎn)物。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 專屬性 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下，血漿中內(nèi)源性基質(zhì)對待測成分斯皮諾素（R＝11.31 min）和內(nèi)標(biāo)黃芩苷（R＝12.74 min）無干擾，表明該色譜質(zhì)譜條件下待測成分的專屬性良好。MRM色譜圖見圖7。

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與LLOQ 斯皮諾素的回歸方程為＝0.110 20＋0.108 84，2＝0.999 6，線性范圍為0.81～81.44 ng/mL，LLOQ為0.81 ng/mL，在線性范圍內(nèi)相關(guān)性良好。

A-空白血漿 B-空白血漿中添加斯皮諾素對照品及內(nèi)標(biāo) C-ig酸棗仁總黃酮0.75 h的血漿樣品

3.3.3 精密度和準(zhǔn)確度考察 如表3所示，待測成分LLOQ、低、中、高質(zhì)量濃度的批內(nèi)精密度的RSD為6.04%～13.30%，準(zhǔn)確度的RE為?4.50%～10.96%，且LLOQ的RSD和RE均小于20%；批間精密度的RSD在5.50%～10.31%，準(zhǔn)確度的RE為?6.42%～14.81%，LLOQ樣品的RSD和RE均在20%以內(nèi)，符合生物樣品含量測定要求。

3.3.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率 斯皮諾素LLOQ、低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率結(jié)果見表4。血漿中斯皮諾素的基質(zhì)效應(yīng)在90.15%～107.97%，RSD為4.52%～16.96%。斯皮諾素LLOQ、低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品平均提取回收率均＞70%，RSD＜15%，符合生物樣本含量測定的要求。

3.3.5 樣品穩(wěn)定性 斯皮諾素在LLOQ、低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品的模擬血漿樣品的?80 ℃下凍融3次的穩(wěn)定性、?80 ℃冷凍條件下保存20 d的長期穩(wěn)定性、室溫下25 ℃放置4 h的短期穩(wěn)定性、樣品處理后在室溫下25 ℃放置4 h和自動進(jìn)樣器中放置24 h的穩(wěn)定性結(jié)果見表5，模擬血漿樣品的穩(wěn)定性RSD在1.21%～14.91%，RE在?6.45%～14.64%；處理后樣品穩(wěn)定性的RSD在0.97%～13.91%，RE在?10.69%～7.87%。LLOQ濃度樣品RSD與RE均小于20%，表明斯皮諾素在模擬生物樣本中的穩(wěn)定性符合生物樣本分析要求。

表3 斯皮諾素的批內(nèi)和批間精密度

Table 3 Intra-batch and inter-batches accuracy of spinosin

理論質(zhì)量濃度/(ng·mL?1)批內(nèi)(n = 5)批間(n = 5) 計(jì)算質(zhì)量濃度/ (ng·mL?1)精密度RSD/%準(zhǔn)確度RE/%計(jì)算質(zhì)量濃度/ (ng·mL?1)精密度RSD/%準(zhǔn)確度RE/% 0.410.398.09?4.500.389.41?6.42 0.810.9013.3010.960.9310.3114.81 57.0158.467.222.5458.797.193.12 65.1569.656.046.9167.865.504.16

表4 斯皮諾素的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

Table 4 Matrix effects and extraction recovery of spinosin

質(zhì)量濃度/(ng·mL?1)基質(zhì)效應(yīng)/%基質(zhì)效應(yīng)RSD/%提取回收率/%提取回收率RSD/% 0.4196.80±16.4116.9689.29±6.066.78 0.8190.15±4.074.5278.08±3.694.72 57.01107.97±4.825.2091.69±5.245.71 65.15104.63±7.738.0873.82±3.344.52

表5 不同儲存條件下斯皮諾素的穩(wěn)定性

Table 5 Stability of spinosin under different storage conditions

質(zhì)量濃度/(ng·mL?1)?80 ℃反復(fù)凍融?80 ℃保存20 d室溫放置4 h進(jìn)樣器放置24 h室溫放置4 h RSD/%RE/%RSD/%RE/%RSD/%RE/%RSD/%RE/%RSD/%RE/% 0.4114.911.7112.8914.6410.382.1910.11?10.6913.912.61 0.814.155.125.496.016.743.132.964.0410.19?8.03 57.011.21?6.454.77?1.384.28?3.580.971.124.247.87 65.153.4712.998.161.127.7412.044.733.826.58?1.05

3.4 正常與抗生素大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究

采用以上分析方法對正常與抗生素組大鼠ig酸棗仁總黃酮后斯皮諾素的含量進(jìn)行測定。應(yīng)用DAS 3.2.8軟件對藥動學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行非房室模型擬合，計(jì)算藥動學(xué)參數(shù)。采用SPSS軟件對正常組與抗生素組的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。如圖8所示，2組大鼠血漿中斯皮諾素的藥時(shí)曲線均呈雙峰吸收現(xiàn)象。如表6所示，與正常組比較，抗生素組大鼠血漿中斯皮諾素的max顯著降低（＜0.05），max、1/2和MRT0～t顯著增高（＜0.05），表明在菌群破壞的情況下，斯皮諾素入血吸收明顯減少，達(dá)峰時(shí)間延長。提示大鼠腸道菌群變化可導(dǎo)致酸棗仁黃酮成分的吸收減少和延遲，同時(shí)也更好地解釋了抗生素組大鼠糞便中斯皮諾素的相對峰面積較正常組高的現(xiàn)象。

圖8 正常組和抗生素組大鼠ig酸棗仁總黃酮后血漿中斯皮諾素的藥時(shí)曲線

表6 斯皮諾素的藥動學(xué)參數(shù)

Table 6 Pharmacokinetic parameters of spinosin

參數(shù)單位正常組抗生素組 Cmaxng·mL?140.73±10.6225.27±6.89* Tmaxh1.45±1.435.00±2.88* t1/2h2.78±1.038.73±7.87* AUC0～tng·h?1·mL?1167.53±57.99142.64±46.40 AUC0～∞ng·h?1·mL?1192.29±70.13168.80±54.85 MRT0～th3.82±0.415.20±1.22* MRT0～∞h5.15±1.036.75±1.80 CL/FL·h?1·kg?1129 728.79±30 750.13191 003.77±64 276.76

與正常組比較：*＜0.05

*< 0.05normal group

4 討論

本研究探索了正常大鼠與抗生素大鼠ig酸棗仁總黃酮后糞便中原型成分及代謝產(chǎn)物種類的差異，結(jié)果顯示抗生素組大鼠體內(nèi)發(fā)生的反應(yīng)類型及I相代謝產(chǎn)物明顯多于正常組大鼠，并比較了具有改善睡眠和抗焦慮作用的活性成分斯皮諾素在正常大鼠與抗生素大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)行為。

在正常與抗生素大鼠糞便中共鑒定了9種原型成分。共有原型成分維采寧II、斯皮諾素、異牡荊素、當(dāng)藥黃素、異當(dāng)藥黃素和6′′′--香豆酰斯皮諾素的平均峰面積在抗生素大鼠糞便中顯著高于正常大鼠（＜0.05）。研究報(bào)道酸棗仁中黃酮類成分可在體外被腸道菌群代謝，如-糖苷類山柰酚-3--蕓香糖苷可在體外腸道菌群作用下脫去蕓香糖，進(jìn)而發(fā)生環(huán)裂解反應(yīng)，生成小分子酚酸類，并在24 h完全降解[26]；正常大鼠腸道菌群中優(yōu)勢種屬如乳酸桿菌屬、瘤胃球菌屬、梭菌科梭菌屬等菌屬中存在可以與黃酮-糖苷和-糖苷發(fā)生相互作用的酶系，參與包括糖基水解反應(yīng)、去甲基化反應(yīng)、脫羥基化反應(yīng)、還原反應(yīng)以及環(huán)裂變反應(yīng)等多種代謝反應(yīng)[27-31]。在抗生素干預(yù)下大鼠腸道菌群穩(wěn)態(tài)環(huán)境受到破壞，對酸棗仁黃酮類成分的代謝轉(zhuǎn)化能力降低[32-34]，這可能是原型成分在抗生素組大鼠糞便中峰面積顯著高于正常組的主要原因。

2組大鼠糞便中共鑒定到15種代謝產(chǎn)物。正常大鼠糞便中檢測到了5種代謝產(chǎn)物；抗生素大鼠糞便中鑒定到了反應(yīng)類型更為豐富的11種代謝產(chǎn)物，包括較為特殊的脫甲氧基代謝產(chǎn)物及去羥基化代謝產(chǎn)物。Jin等[35]研究表明在偽無菌大鼠糞便中檢測到丹酚酸A的脫甲氧基及去羥基化反應(yīng)代謝產(chǎn)物，而在正常大鼠糞便中未檢測到其代謝產(chǎn)物。已有文獻(xiàn)報(bào)道肝臟中存在細(xì)胞色素P450等酶系，可以催化黃酮類成分發(fā)生脫甲氧基和去羥基化等I相代謝反應(yīng)[36-37]，因此在抗生素大鼠糞便中這2種代謝產(chǎn)物可能主要由肝臟的代謝產(chǎn)生[38-39]。而在正常大鼠體內(nèi)，脫甲氧基及去羥基化的代謝產(chǎn)物可能進(jìn)一步被腸道菌群轉(zhuǎn)化為下游代謝產(chǎn)物。

藥動學(xué)結(jié)果顯示，抗生素大鼠和正常大鼠血漿中斯皮諾素的吸收均呈現(xiàn)雙峰吸收。與正常組相比，在抗生素大鼠血漿中斯皮諾素max顯著降低（＜0.05），max和1/2顯著增高（＜0.05），表明在抗生素大鼠體內(nèi)斯皮諾素吸收減少且消除減慢。Jiao等[40]研究發(fā)現(xiàn)6′′′-對香豆酰斯皮諾素和6′′′-阿魏酰斯皮諾素等斯皮諾素衍生物，均可被由大鼠腸道菌群產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶體外催化發(fā)生脫糖基化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為斯皮諾素。本課題組研究亦發(fā)現(xiàn)腸道菌群可有效水解斯皮諾素衍生物的對香豆酰、阿魏酰和對羥基苯甲酰等基團(tuán)，生成共同的代謝產(chǎn)物斯皮諾素；進(jìn)而斯皮諾素可被水解生成當(dāng)藥黃素（6-C糖）[17]。本研究中抗生素干預(yù)大鼠的腸道菌群處于紊亂狀態(tài)，菌群中優(yōu)勢菌門數(shù)量急劇下降[41-43]，包括有β-葡萄糖苷酶活性的如擬桿菌屬、乳酸桿菌屬、普雷沃菌屬等菌屬，從而減緩了對斯皮諾素及其系列衍生物的代謝轉(zhuǎn)化速率，導(dǎo)致抗生素大鼠體內(nèi)斯皮諾素max與正常大鼠相比較低，并保持在比較穩(wěn)定的水平。

本研究從腸道菌群代謝和藥動學(xué)的角度，初步闡釋了腸道菌群對酸棗仁黃酮類成分吸收和代謝的影響，同時(shí)也為酸棗仁總黃酮的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及吸收代謝機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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metabolic profile of total flavonoids inmediated by gut microbiota

DUAN Hui-zhu1, LIU Jia-xing2, YAN Yan2, DU Chen-hui1

1. College of Traditional ChineseMedicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Taiyuan 030619, China 2. Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

To compare the differences ofmetabolic transformation reaction of total flavonoids in Suanzaoren (, ZSSF) in normal and antibiotic-treated rats and pharmacokinetic characteristic changes of spinosin in plasma of both groups.Rats were treated with antibiotics by intragastric administration, normal and antibiotic-treated rats were ig ZSSF (120 mg/kg), then feces and plasma from different time periods were collected. UHPLC-Q-TOF-MS/MS was used to analyze the prototype components and metabolites in feces, and baicalin was used as internal standard to establish a UPLC-MS/MS method for the determination of spinosin in rat plasma, which was applied to the comparative study of pharmacokinetics between normal and antibiotic-treated rats.A total of 24 compounds were identified from both normal and antibiotic-treated rats, including nine prototype components (vitzenin II, spinosin, vitexin, isovitexin, swertisin, isoswertisin, kaempferol-3--rutinoside, 6′′′--couma acylspinosin, 6′′′-feruloyl spinosin) and 15 metabolites. In normal rats, four metabolic reactions such as hydrogenation and glycosylation were mainly occurred, and six metabolic reactions such as demethoxylation and dehydroxylation were occurred after antibiotic intervention. Compared with normal group, plasma concentration of spinosin in antibiotic-treated group was significantly decreased (< 0.05), while peak time and half-life were significantly prolonged (< 0.05).Antibiotic intervention can lead to metabolic disorder of ZSSF in rats and affect the pharmacokinetic behavior of spinosin.

total flavonoids of; antibiotic-treated rats; gut microbiota; metabolism; pharmacokinetics; vitzenin II; spinosin; vitexin; isovitexin; swertisin; isoswertisin; kaempferol-3--rutinoside; 6′′′--couma acylspinosin; 6′′′-feruloyl spinosin

R285.5

A

0253 - 2670(2022)14 - 4376 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.017

2022-01-18

山西省科技廳中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展資金項(xiàng)目（YDZJSX2021C025）；山西省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（20210302123237，20210302123470）；山西省衛(wèi)生健康委“十大晉藥”項(xiàng)目（ZYCZL 2020007）；山西中醫(yī)藥大學(xué)青年科學(xué)家培育項(xiàng)目（2021PY-QN-07）

段慧竹（1996—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴庂Y源開發(fā)與利用。Tel: 18434376753 E-mail: Duanhz0506@163.com

杜晨暉，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。Tel: (0351)3179982 E-mail: dch@sxtcm.edu.cn

閆 艷，副教授，博士，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制及中藥體內(nèi)過程分析。Tel: (0351)7018379 E-mail: yanyan520@sxu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]