林秋汛，王淑瑞，唐 學(xué)，潘世會，陳 浩，甘 晶

（1.山東大學(xué) 海洋學(xué)院，山東威海 264209；2.煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺 264005）

0 引言

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是由脫皮脫脂的大豆進一步去除所含非蛋白成分后得到的一種蛋白產(chǎn)品，價格低廉、富含營養(yǎng)且具有良好的成膜性［1］。但阻水性能差等缺點限制了它的應(yīng)用［2］。研究表明，美拉德反應(yīng)可用于蛋白質(zhì)改性，其通過還原糖的羰基與蛋白質(zhì)的氨基縮合重排，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進而改善蛋白質(zhì)的功能［3］。美拉德反應(yīng)對 SPI 進行改進的方法已有研究，但選用何種多糖能更好地發(fā)揮其協(xié)同作用、美拉德反應(yīng)程度與蛋白-多糖產(chǎn)物的性能有何聯(lián)系等問題仍待深入探討。普魯蘭多糖（pullulan，PUL）是一種由麥芽三糖單元通過α-（1，6）糖苷鍵相互連接組成的線性聚合物［4］，具有良好的阻隔性、抑菌性以及抗氧化能力等，是一種性能優(yōu)異的成膜材料［5-6］，能有效彌補大豆分離蛋白的缺陷。

有鑒于此，試驗以大豆分離蛋白和普魯蘭多糖為原料，探究pH 值和配比對美拉德反應(yīng)程度的影響，進而從配比角度研究 SPI-PUL 成膜性質(zhì)，探索美拉德反應(yīng)與膜性能之間的關(guān)系，為后續(xù)研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，普魯蘭多糖（食品級，華豫生物科技有限公司）；甘油（分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

B-260 型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；RH-KT/C 型磁力攪拌器（艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司）；YP601N 型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；T6 新世紀(jì)型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；NR110 型精密色差儀（深圳市三恩馳科技有限公司）；211-101 型數(shù)顯千分尺（東莞市景有模具五金有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備

1.3.1.1 不同pH 值的影響

參考王魯慧等［7］方法，略作修改。步驟如下：SPI∶PUL=1∶1 混合→蒸餾水溶解→攪拌15 h →調(diào)節(jié)pH 值分別為7.0，8.0，9.0，10.0，11.0 →80 ℃攪拌1 h →冷卻待測。

1.3.1.2 不同混合比例的影響

SPI∶PUL 配比分別為1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，調(diào)節(jié)pH=9.0，其余操作同1.3.1.1。

1.3.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的檢測

因美拉德中間反應(yīng)產(chǎn)物在290 nm 波長處有特征性吸收［8］，取1.3.1.1 和1.3.1.2 反應(yīng)產(chǎn)物，稀釋美拉德反應(yīng)產(chǎn)物濃度至0.06%，用紫外可見分光光度計測定其在290 nm 處的吸光度值。

1.3.3 膜的制備

樣液配制步驟同1.3.1.2，向配好的樣液加入體積分?jǐn)?shù)3%的甘油，攪拌30 min，然后取20 g 膜液倒入直徑為90 mm 的培養(yǎng)皿中，50 ℃烘箱干燥17 h。取出后置于盛有飽和KBr 溶液的干燥皿（60% RH，室溫）中，平衡24 h 后檢測膜性能。

1.3.4 膜性能檢測

1.3.4.1 色差值的測定

使用色差儀測量薄膜色度值，測量Hunter 值L、a、b［9］。根據(jù)下式計算膜的總色差ΔE：

式中 L'、a'、b'——標(biāo)準(zhǔn)樣品的Hunter 色度值；

L、a、b—— 膜的明亮程度、紅綠度和黃藍度。

1.3.4.2 厚度的測定

取膜的4 個頂點及中心，使用數(shù)顯千分尺測量5 點厚度［10］。

1.3.4.3 含水率的測定

取200 mg 膜樣品放入鋁盒中，干燥至恒重，測量干燥前后的重量［11］。計算含水率：

式中 m0——初始膜重，g；

m'f——干燥后膜重，g。

1.3.4.4 水蒸氣透過率的測定

根據(jù)ASTM E96-80 標(biāo)準(zhǔn)進行測定。以下式計算水蒸氣透過率：

式中 Δm/Δt—— 單位時間內(nèi)損失水分的重量，g/h；

A—— 密封在玻璃瓶口上的膜面積，m2；

Δp——膜兩側(cè)的水蒸氣分壓差，MPa；

e——膜厚度，m。

1.3.4.5 溶解度的測定

參照WANG 等［9］方法。將膜樣品切成3×3 cm 的矩形，烘干至恒重，稱重后于蒸餾水中浸泡24 h，溶解后將剩余膜樣品再干燥至恒重。以下式計算其在水中的溶解度：

式中 ma——溶解前質(zhì)量，g；

m1——溶解后質(zhì)量，g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每種樣品設(shè)置3 組平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 進行統(tǒng)計分析，組間差異顯著性采用方差分析，p<0.05 時認(rèn)為有顯著差異。采用MATLAB 進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件對美拉德反應(yīng)的影響

2.1.1 pH 值的影響

美拉德反應(yīng)初級階段經(jīng)歷Amadori 重排，重排產(chǎn)物的形成條件為pH>7［12］，試驗以290 nm 處吸光值的大小來表征中間階段產(chǎn)物的生成數(shù)量，進而衡量美拉德反應(yīng)程度。

由圖1所示，不同pH 值條件下SPI-PUL 反應(yīng)產(chǎn)物紫外吸光值差異顯著（p<0.05）。當(dāng)pH=9時吸光值達最大值，表明在此pH 值下SPI-PUL美拉德反應(yīng)程度最大，過高或過低的pH 值均會抑制美拉德反應(yīng)，可能是因為pH 值較低時會抑制美拉德反應(yīng)中有機酸的生成，從而抑制后續(xù)反應(yīng)的進行［13］；而當(dāng)pH 值較高時缺乏足夠的H+催化Amadori 重排［14］，故反應(yīng)程度較小。因此，在后續(xù)的研究中，為充分發(fā)生美拉德反應(yīng)，選擇pH=9 的反應(yīng)條件。

圖1 pH 值對SPI-PUL 美拉德反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of pH on the Maillard reaction of SPI-PUL

2.1.2 混合比例的影響

如圖2所示，隨著SPI 比例的增大，吸光值隨之增大（p<0.05），表明美拉德反應(yīng)程度隨SPI 比例的升高而增大?？赡苁且驗楫?dāng)SPI∶PUL=1∶1 時，SPI 含量是反應(yīng)的限制因素，當(dāng)SPI 占比增加，蛋白分子與多糖分子間碰撞幾率增大［15］，反應(yīng)速度加快。

圖2 混合比例對SPI-PUL 美拉德反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of mixing ratio on Maillard reaction of SPI-PUL

2.2 美拉德反應(yīng)對膜性能的影響

2.2.1 美拉德反應(yīng)對膜色差值的影響

由圖3感官評定可知，SPI∶PUL=1∶1 時，膜色澤偏白且亮度高；SPI∶PUL=5∶1 時，膜顏色偏黃綠色，且色澤較深暗。

圖3 不同混合比例的SPI-PUL 可食膜Fig.3 SPI-PUL edible films with different mixing ratios

將5 種混合比例的樣品根據(jù)美拉德反應(yīng)程度由小到大設(shè)置編號為1-5，并將1 號樣品作為標(biāo)準(zhǔn)樣，計算2-5 樣品相對于標(biāo)準(zhǔn)品的ΔL、Δa、Δb和ΔE。

由表1可知，隨著美拉德反應(yīng)程度增大，ΔL為負(fù)值且逐漸減小，說明膜的亮度逐漸減?。沪總體呈增大趨勢但仍然為負(fù)值，說明膜綠色程度有所減少，但與標(biāo)準(zhǔn)品相比，整體仍偏向綠色；Δb為正值且逐漸增大，說明膜黃色程度加深。隨著SPI 混合比例的增加，ΔE 也逐漸增大，與圖3所示結(jié)果一致，原因是作為蛋白-多糖可食膜，膜顏色受美拉德反應(yīng)影響較大，隨著SPI 濃度升高，美拉德反應(yīng)程度增大，非酶促褐變程度增加，以至膜ΔE 增加。

表1 SPI-PUL 美拉德反應(yīng)程度對膜色差值的影響Tab.1 Effect of SPI-PUL Maillard reaction degree on the value of film color difference

2.2.2 美拉德反應(yīng)對膜厚度的影響

如表2所示，不同反應(yīng)程度下所制可食膜厚度無顯著差異（p>0.05）。膜厚度最小為0.25 mm，最大為0.31 mm，均符合日?？墒衬な褂煤穸葮?biāo)準(zhǔn)。猜測可能是由于SPI 微觀上為球狀結(jié)構(gòu)，分子間產(chǎn)生較多的空隙與通道，PUL 與SPI 混合后能填補其空隙，以至厚度變化不明顯［16］。

表2 SPI-PUL 美拉德反應(yīng)程度對膜厚度的影響Tab.2 Effect of SPI-PUL Maillard reaction degree on films thickness

2.2.3 美拉德反應(yīng)對膜含水率的影響

如圖4所示，隨著美拉德反應(yīng)程度的增大，可食膜的含水率逐漸降低（p<0.05）。SPI∶PUL 由1∶1變?yōu)?∶1 時降低幅度最大，當(dāng)SPI∶PUL=5∶1 時可食膜含水率最低，為14.80%。這可能是因為PUL含有較多羥基，可與水作用形成氫鍵，具有較高持水性能，但當(dāng)SPI 占比增加時，會影響PUL 分子舒展，氫鍵形成數(shù)量減少，導(dǎo)致其持水性能下降［17］。

圖4 SPI-PUL 美拉德反應(yīng)程度對膜含水率的影響Fig.4 Effect of SPI-PUL Maillard reaction degrees on water content of films

2.2.4 美拉德反應(yīng)對膜水蒸氣透過率的影響

如圖5所示，SPI-PUL 可食膜的水蒸氣透過率呈先減小后增大的趨勢，不同配比的可食膜水蒸氣透過率有顯著區(qū)別（p<0.05）。當(dāng)SPI∶PUL=2∶1時水蒸氣透過率為3.77 g·m-1·h-1·MPa-1，達到最小值。從成膜原料的角度分析原因，SPI∶PUL由1∶1變?yōu)?∶1 的過程中，隨著SPI 占比增加，SPI 與PUL 兩者氫鍵作用增強，可食膜結(jié)構(gòu)更加致密，水蒸氣透過率降低；當(dāng)SPI∶PUL=2∶1 時，達最低值；SPI 占比繼續(xù)增加，成膜性質(zhì)受SPI 影響更大，膜液粘度變高，導(dǎo)致脫氣效果差，形成的膜孔隙多，同時，具有良好保濕能力的PUL 含量降低后，膜液水分蒸發(fā)大，在成膜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中形成的空洞數(shù)量多，因此膜的水蒸氣透過率較高［18］。以普魯蘭多糖為成膜基質(zhì)的復(fù)合膜，如吳佳［19］制備的普魯蘭多糖-殼聚糖復(fù)合膜、高翔［20］制備的普魯蘭多糖-結(jié)冷膠復(fù)合膜等，膜水蒸氣透過率隨PUL 含量的降低均呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢，與本試驗結(jié)果相似。從美拉德反應(yīng)的角度看，美拉德反應(yīng)高級階段會生成不溶于水的大分子聚合物，根據(jù)2.1.2 結(jié)果可知，SPI∶PUL=3∶1 至5∶1 時，美拉德反應(yīng)較大，因此膜液中所含的不溶性大分子聚合物較多，阻礙了SPU-PUL 交聯(lián)，使膜含有較多的空隙，故水蒸氣透過率大。

圖5 SPI-PUL 美拉德反應(yīng)程度對膜水蒸氣透過率的影響Fig.5 Effect of SPI-PUL Maillard reaction degrees on water vapor permeability rate of films

2.2.5 美拉德反應(yīng)對膜溶解度的影響

如圖6所示，隨著SPI 配比增加，美拉德反應(yīng)程度增大，膜溶解度逐漸減小（p<0.05）。當(dāng)SPI∶PUL=1∶1 時溶解度為33.09%，為最大值；當(dāng)SPI∶PUL=5∶1 時溶解度為23.44%，達到最小值。

圖6 SPI-PUL 美拉德反應(yīng)程度對膜溶解度的影響Fig.6 Effect of SPI-PUL Maillard reaction degree on film solubility

可食膜溶解度隨美拉德反應(yīng)程度增加而減小。一方面是因為美拉德反應(yīng)進入高級階段后，會形成不溶于水的大分子聚合物，反應(yīng)程度越大，生成的不溶物也越多，以至膜的溶解度降低。另一方面，由于PUL 主鏈上含有高濃度羥基［21］，親水性強，但隨著SPI 占比增加，SPI 與PUL 復(fù)合后掩蓋了PUL 的親水性，水分難以向膜內(nèi)擴散從而導(dǎo)致溶解度降低。KCHAOU 等［11］研究魚明膠-葡萄糖美拉德復(fù)合膜的溶解度，發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)能夠降低膜的溶解度。HAMDI 等［22］通過美拉德反應(yīng)修飾藍蟹殼聚糖基膜，發(fā)現(xiàn)隨著美拉德反應(yīng)程度的增大，可食膜的溶解度降低。

2.2.6 綜合指標(biāo)評價

綜合色差、厚度、含水率、水蒸氣透過率和溶解度指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)SPI∶PUL=5∶1 時可食膜性能最優(yōu)。此外，王強［23］在研究不同SPI-PUL 配比對膜抗拉伸強度的影響時發(fā)現(xiàn)，隨著配比中SPI 含量的增加，膜抗拉伸強度增大。借鑒到本試驗可知，SPI∶PUL=5∶1 的膜抗拉伸強度最大。綜上所述，最佳成膜配比為SPI∶PUL=5∶1。

3 結(jié)語

（1）SPI-PUL 美拉德反應(yīng)程度與pH 值和配比密切相關(guān)。當(dāng)pH=9 時，美拉德反應(yīng)程度最大；美拉德反應(yīng)程度隨SPI 占比的增加而增大。

（2）美拉德反應(yīng)程度影響膜的性質(zhì)。隨著膜基質(zhì)中 SPI 占比的增加，美拉德反應(yīng)程度增大，膜顏色加深，色差加大；膜的厚度無顯著變化；膜的含水率和溶解度均減??；水蒸氣透過率先減小后增大再減小。當(dāng)SPI∶PUL=2∶1 時，水蒸氣透過率最小，為3.77 g·m-1·h-1·MPa-1。綜合評價得出，SPI-PUL 可食膜最佳成膜工藝為pH=9，混合比例為SPI∶PUL=5∶1。

（3）本文從pH 值、配比2 個方面探究影響美拉德反應(yīng)程度的因素，檢測膜的物理性質(zhì)，構(gòu)建膜的性能與美拉德反應(yīng)程度間的關(guān)系。但美拉德反應(yīng)過程較為復(fù)雜，影響因素繁多，且該反應(yīng)如何影響膜性質(zhì)機理仍較為模糊，需待進一步研究。試驗還未對膜的抗氧化性、抑菌性等化學(xué)性質(zhì)及機械強度進行研究，待后續(xù)進一步探討。