張細(xì)穩(wěn)

(江西科技師范大學(xué)，有機(jī)功能分子研究所，南昌 330013)

1 引言

堿土金屬元素包括鈹、鎂、鈣、鍶、鋇、鐳，Mg2+在細(xì)胞增殖的生化過程和脫氧核糖核酸(DNA)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性等許多細(xì)胞機(jī)制中起著重要的作用[1，2]，飲食中缺乏Mg2+是一些疾病的誘發(fā)原因[3-5]，同時也參與了生物體的神經(jīng)信號的傳遞[6，7]；Ca2+是生理液體和生物體中最豐富的元素之一，鈣離子在生物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要作用[8]，而且與多種疾病息息相關(guān)，如骨質(zhì)疏松[9]、冠心病[10]和阿爾茨海默癥[11]；90Sr2+是一種放射性金屬，在核電站附近的水環(huán)境中普遍存在。由于其半衰期較長(T1/2=28.7年)，可對生態(tài)系統(tǒng)造成長期污染[12，13]。因此開發(fā)能夠檢測堿土金屬離子的熒光傳感器對生命科學(xué)和環(huán)境保護(hù)具有重要意義。

咪唑并[1，2-a]吡啶是一種天然骨架，廣泛應(yīng)用于藥物化學(xué)，尤其是抑制類藥物的合成[14]，如CBP/P300的選擇性抑制劑[15]、醛脫氫酶抑制劑[16]等；除此之外，它還具有獨有的熒光特性和簡單的合成方法，逐漸被用于離子檢測和細(xì)胞靶向熒光探針[14，17-20]。為此，本研究設(shè)計并合成了一種對稱的含有兩個咪唑并[1，2-a]吡啶單元的增強(qiáng)型熒光探針1。

合成路線：探針1的合成路線

2 材料與方法

2.1 材料與儀器

除非另有說明，實驗過程中的溶劑均為色譜級溶劑與蒸餾水。測試儀器也會在后面提及。布魯克核磁共振譜儀(AV 500 MHz)，熒光光譜測量采用Hitachi F-4600熒光分光光度計，質(zhì)譜使用Agilent 1100離子阱質(zhì)譜儀。

2.2 探針1的制備與表征

在無水無氧、氬氣保護(hù)的氛圍中，向裝有10 mL色譜甲醇的50 mL史萊克瓶中加入2，6-二醛基吡啶(1.35 g，1.0 mmol)、2-氨基吡啶(1.88 g，2.0 mmol)和三氟甲基磺酸鈧(60.0 mg，0.12 mmol)，在室溫下攪拌60 min，隨后注入1.0 mmol叔丁基異腈。反應(yīng)繼續(xù)室溫攪拌48 h，反應(yīng)結(jié)束后，減壓旋干甲醇，用硅膠柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=5：1)得到淡黃色固體。1H NMR(500 MHz，CD3CN δ 8.36-8.37(d，J=5 Hz，2 H)，8.00-8.01(d，J=5 Hz，2 H)，7.90(t，J=5 Hz 10 Hz，1H)，7.46-7.47(d，J=5 Hz，2 H)，7.19(t，J=10 Hz 5 Hz，2 H)，6.83(t，J=5 Hz 10 Hz，2 H)，4.93(s，2 H)，1.02(s，18 H)。13C NMR(500 MHz，CDCl3)δ152.82，140.72，136.34，134.84，126.72，123.22，123.04，119.59，116.53，110.29，55.30，28.91。ESI-MS：m/z 454.2726[M+H+]+(calcd 453.2641)。

2.3 配制探針1溶液和分析物溶液

稱取4.53 mg(0.01 mmol)探針1并溶于10 mL色譜乙腈中，Ca2+、Mg2+、Sr2+、Al3+、Zn2+、Cd2+、Ag+、Cr3+、K+、Fe3+、Hg2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+、Co2+和Pb2+分別用各自對應(yīng)的硝酸鹽配制，濃度為0.1 mol/L。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針1對Mg2+、Ca2+、Sr2+的熒光識別及其光學(xué)性質(zhì)

在室溫下，研究了探針1在乙腈溶液(2×10-5mol/L)中對各種金屬離子(Ca2+、Mg2+、Sr2+、Al3+、Zn2+、Cd2+、Ag+、Cr3+、K+、Fe3+、Hg2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+、Co2+和Pb2+)的響應(yīng)，如圖1A所示，在380 nm光的激發(fā)下，當(dāng)向探針1的乙腈溶液中加入2 μL的各種金屬離子后，Mg2+使探針1的熒光從112增強(qiáng)到1544，發(fā)射波長由原來的493 nm變?yōu)?45 nm；Ca2+使探針1的熒光從112增強(qiáng)到2021，發(fā)射波長由原來的493 nm變?yōu)?23 nm；Sr2+使探針1的熒光從112增強(qiáng)到912，發(fā)射波長由493 nm移動到483 nm；熒光從很弱的黃色熒光變?yōu)槊髁恋狞S色。而從圖1B和1C中則可以更明顯地看出加入除Mg2+、Ca2+、Sr2+之外的金屬離子，并不能改變探針1的熒光強(qiáng)度，可以初步看出探針1對Mg2+、Ca2+、Sr2+具有選擇性。

圖1 380 nm光激發(fā)下，探針1的乙腈溶液(2×10-5mol/L)在加入各種金屬離子之后的，(A)熒光變化譜圖，(B)熒光變化柱狀圖，(C)熒光變化的照片

隨后在探針1的乙腈溶液中分別用Mg2+、Ca2+、Sr2+對探針1進(jìn)行了熒光滴定實驗。如圖2A所示，向探針1的乙腈溶液中逐滴滴加Mg2+時，探針1的熒光從112分別增強(qiáng)到1544，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了約14倍，當(dāng)?shù)渭拥?當(dāng)量。即20 μ mol/L時達(dá)到最大熒光強(qiáng)度，且繼續(xù)滴加熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定；在圖2B所示，根據(jù)檢測限公式LOD=3δ/A得到探針1對Mg2+的檢測限為21 nM；最后根據(jù)Benesi-Hildebrand計算得到探針1與Mg2+的結(jié)合常數(shù)為26187 L/mol。

圖2 380 nm光激發(fā)下，探針1的乙腈溶液(2×10-5mol/L)對(A)Mg2+的熒光滴定點圖，(B)探針1對Mg2+的檢測限

同理，當(dāng)向探針1的乙腈溶液中逐滴滴加Ca2+時，探針1的熒光從112分別增強(qiáng)到2021，滴加到84 μmol/L后熒光強(qiáng)度保持不變(圖3A)；根據(jù)檢測限公式LOD=3δ/A得到探針1對Ca2+的檢測限分別48 nM(如圖3B)。根據(jù)Benesi-Hildebrand計算得到探針1與Ca2+的結(jié)合常數(shù)為13707 L/mol。

圖3 380 nm光激發(fā)下，探針1的乙腈溶液(2×10-5mol/L)對(A)Ca2+的熒光滴定圖，(B)探針1對Ca2+的檢測限

最后向探針1的乙腈溶液中逐滴滴加Sr2+時，探針1的熒光從112分別增強(qiáng)到1140，滴加到50 μmol/L后熒光強(qiáng)度保持不變(圖4A)；根據(jù)檢測限公式LOD=3δ/A得到探針1對Sr2+的檢測限分別43 nM(如圖4B)。根據(jù)Benesi-Hildebrand計算得到探針1與Sr2+的結(jié)合常數(shù)為209060 L/mol。通過這些測試可以看出探針1對Mg2+、Ca2+、Sr2+有良好的選擇性以及較高的靈敏度。

圖4 380 nm光激發(fā)下，探針1的乙腈溶液(2×10-5mol/L)對(A)Sr2+的熒光滴定點圖，(B)探針1對Sr2+的檢測限

3.2 探針1對Mg2+、Ca2+、Sr2+的識別機(jī)理

為了研究探針1與Mg2+、Ca2+、Sr2+的識別機(jī)理，首先通過 Jod’s plot 實驗對探針1與Mg2+、Ca2+、Sr2+進(jìn)行了絡(luò)合比的測試，如圖5所示，當(dāng)Mg2+、Ca2+、Sr2+的體積分?jǐn)?shù)為0.5時熒光強(qiáng)度最大，說明Mg2+、Ca2+、Sr2+與探針1均是以1：1的方式結(jié)合的。

圖5 380 nm光激發(fā)下，探針1乙腈溶液中與(A)Mg2+的絡(luò)合比，(B)Ca2+的絡(luò)合比，(C)Sr2+的絡(luò)合比

為了進(jìn)一步了解Mg2+、Ca2+、Sr2+在探針1的乙腈溶劑中與探針分子的作用機(jī)理，首先通過質(zhì)譜儀對添加Mg2+、Ca2+、Sr2+前后的離子峰的變化進(jìn)行了測定，在探針1+Mg2+的質(zhì)譜中找到了m/z為602.1348的離子峰，剛好是探針[1+Mg2++2NO3-+H]+的分子量；而在探針1+Ca2+的質(zhì)譜中的m/z為555.2126處找到了[1+Ca2++NO3-]+的離子峰；用相同的辦法，在m/z為602.1352的位置找到了[1+Sr2++NO3-]+的離子峰，以此確認(rèn)了探針1與Mg2+、Ca2+、Sr2+作用時參加了的微粒種類和個數(shù)比。

4 結(jié)論

本文設(shè)計并合成了一個具有弱熒光性質(zhì)的對稱咪唑并[1，2-α]吡啶，通過分子中芳環(huán)上的三個氮原子與堿土金屬離子鰲合，產(chǎn)生明亮的熒光，研究了其對堿土金屬的靈敏性和快速響應(yīng)性。該分子由于在和堿土金屬配位之前，由于單鍵的可旋轉(zhuǎn)性，使整體平面性差，熒光性弱，當(dāng)與堿土金屬離子反應(yīng)后，通過氮原子與離子鰲合，增加了結(jié)構(gòu)的剛性，使結(jié)構(gòu)更加共平面，產(chǎn)生明亮的熒光。探針1對Mg2+、Ca2+、Sr2+具有選擇性和靈敏性，并分別在545 nm，523 nm和502 nm處有明顯的熒光。

*致謝 非常感謝劉剛教授對本工作的大力支持，感謝江西省教育廳青年基金(GJJ190614)和江西省科技廳青年科學(xué)基金(20202BAB213006)的資助。