肖海燕，遲玉霞，胡冬梅，高秀蕊，高翠芳，張霄漢

(山東藥品食品職業(yè)學(xué)院，淄博 255000)

1 引言

中藥荷芪煎煮茶是依據(jù)在臨床上應(yīng)用多年，并取得滿意療效的驗(yàn)方，經(jīng)過研發(fā)制備的醫(yī)院自制中藥制劑，用于益氣化濁，行瘀消積。荷芪煎煮茶由絞股藍(lán)、黃芪、山楂、荷葉等組成[1]。對(duì)于現(xiàn)代中藥制劑，處方組成、生產(chǎn)和銷售等環(huán)節(jié)均需符合國(guó)家相關(guān)部門制定的中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此需要相應(yīng)方法來測(cè)定中藥制劑中各種成分的含量?？傮w來說，在中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中，薄層掃描法、紫外分光光度法、氣相色譜法和高效液相色譜(HPLC)法等都是較為常用的定性、定量檢測(cè)方法，其中HPLC法具有快速分析、高靈敏度和高精確度的優(yōu)點(diǎn)，是定量分析的主要方法[2-3]。為有效控制荷芪煎煮茶的質(zhì)量，建立了HPLC法對(duì)制劑中熊果酸的含量進(jìn)行測(cè)定；同時(shí)測(cè)定了不同產(chǎn)地山楂中熊果酸的含量，制定了山楂中熊果酸的含量限度[4-5]。

2 實(shí)驗(yàn)

2.1 儀器與試藥

2.1.1 儀器日本島津LC-20AT高效液相色譜儀系列；瑞士梅特勒托利多MS205Du電子天平(十萬(wàn)分之一)；KQ-400KDE型高功率超聲波清洗器。

2.1.2 試藥與樣品含熊果酸荷芪煎煮茶樣品；山楂飲片；缺山楂荷芪煎煮茶樣品；UA對(duì)照品(110742-201823，含量99.9%)；德國(guó)默克色譜純乙腈、分析純乙

醇、分析純磷酸；娃哈哈純凈水。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取熊果酸對(duì)照品(UA，下同)適量，用乙醇制成每1ml含80μg的溶液即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

稱取約3 g本品，研細(xì)后放置于100 mL具塞錐形瓶中，移取25 mL乙醇，稱重后在300 W，45 kHz頻率下超聲處理30 min，放冷后向錐形瓶中再次加入乙醇至超聲前所稱重量，搖勻過濾后取續(xù)濾液即可。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備

取不含山楂的陰性樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.3 色譜條件考察

采用Agilent 1200-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版一部[1]和文獻(xiàn)[2-5]，在檢測(cè)山楂中UA含量時(shí)，采用的波長(zhǎng)多為215 nm。流動(dòng)相、柱溫、流速和進(jìn)樣量分別為乙腈和0.05%磷酸(67：33)、40 ℃、1.0 mL/min和20 μL。

2.3.1 流動(dòng)相考察

通過查閱文獻(xiàn)[2-3]，不同制劑測(cè)定UA含量多采用乙腈-0.05%磷酸作為流動(dòng)相，因此分別配置不同濃度的磷酸進(jìn)行考察。對(duì)照品及TS進(jìn)樣量均為20 μL，檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 流動(dòng)相試驗(yàn)結(jié)果

在對(duì)流動(dòng)相的分離度、拖尾因子和理論塔板數(shù)進(jìn)行綜合對(duì)比考慮后，綜合考慮后選擇乙腈-0.05%磷酸(67：33)作為流動(dòng)相，符合《中國(guó)藥典》2020年版高效液相色譜法(通則0513)。

2.3.2 提取溶劑的考察

通過查閱《中國(guó)藥典》2020年版一部[1]和文獻(xiàn)[2-4]，發(fā)現(xiàn)測(cè)定UA含量時(shí)通常使用的提取溶劑為乙醇和甲醇，因此，分別用乙醇、無水乙醇及甲醇為例進(jìn)行提取溶劑的考察。按2.2項(xiàng)下方法分別用上述三種溶劑制備TS，均作平行樣。

平行制作6份RS樣品和上述三種TS樣品各20 μL，使用HPLC測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 提取溶劑試驗(yàn)結(jié)果

由三種溶劑含量測(cè)定結(jié)果可知，甲醇、無水乙醇溶劑結(jié)果相近，乙醇溶劑含量略高，考慮到環(huán)保因素，故確定以乙醇作為提取溶劑。

2.4 方法學(xué)考察

按2.2項(xiàng)下方法制備對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液，分別吸取各20 μL，使用HPLC進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1。

圖1 專屬性的HPLC色譜圖(上圖UA對(duì)照品色譜圖，中圖樣品色譜圖，下圖陰性對(duì)照色譜圖)

結(jié)果顯示，在陰性對(duì)照品色譜圖中含有除UA外所有其他物質(zhì)的色譜峰，這說明荷芪煎煮茶處方中的其他物質(zhì)不會(huì)對(duì)HPLC測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生干擾。

2.4.2 線性關(guān)系考察

按2.2項(xiàng)下方法制備UA對(duì)照品溶液，分別精密量取1 mL置10 mL量瓶中，3 mL置20 mL量瓶中，2 mL置10 mL量瓶中，5 mL置20 mL量瓶中，3 mL置10 mL量瓶中，分別加乙醇稀釋至刻度，制成6種濃度溶液。各吸取10 μL，分別以UA對(duì)照品進(jìn)樣量和峰面積為橫、縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸得到回歸方程，回歸方程y=399163 x-292.51，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。結(jié)果顯示，當(dāng)UA濃度在37.6 μg·mL-1～112.9 μg·mL-1的范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積的線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度考察

精密吸取按2.2項(xiàng)下方法制備UA對(duì)照品溶液20 μL，平行測(cè)定6次，記錄色譜圖。UA的RSD為0.076%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察

取本品適量，按2.2項(xiàng)下方法制備TS，在0 h、2 h、4 h、8 h、24h，分別進(jìn)樣20μL并測(cè)定UA的峰面積，觀察TS在檢測(cè)過程中UA的穩(wěn)定性。RSD為0.56%，結(jié)果顯示，TS在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

式中，Y為社會(huì)總產(chǎn)出；A 代表技術(shù)進(jìn)步水平；L 為勞動(dòng)力投入；K 為資本投入；參數(shù)α和β分別表示資本和勞動(dòng)力的產(chǎn)出彈性。假設(shè)各地區(qū)生產(chǎn)函數(shù)遵循規(guī)模報(bào)酬不變的C-D生產(chǎn)函數(shù)，即α+β=1。

2.4.5 重復(fù)性考察

按照2.2項(xiàng)下方法制備制備RS和TS(平行制備6份)，吸取各20 μL，測(cè)定UA含量，UA的RSD為0.61%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率考察

取已測(cè)知含量的本品適量(批號(hào)：030502)，約1.5 g，精密稱定，分別精密加入U(xiǎn)A對(duì)照品溶液(79.68 μg·mL-1)15 mL及乙醇10 mL，按正文中含量測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算回收率。平行制作6份，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為100.6 %，RSD為0.34 %(n=6)。

2.5 樣品含量測(cè)定

按前文方法和條件，使用HPLC測(cè)定3批荷芪煎煮茶中的UA含量。按2.2項(xiàng)下方法制備RS，TS，取本品然后按照上述溶液制備方法制備。

吸取RS及TS各20 μL，使用HPLC用外標(biāo)法計(jì)算UA含量。結(jié)果見表3。

表3 熊果酸含量測(cè)定結(jié)果

2.6 不同產(chǎn)地山楂中UA含量測(cè)定

因山楂為《中國(guó)藥典》2020年版(一部)收載的品種，但含量采用的是容量分析測(cè)定有機(jī)酸含量，因此按上述含量測(cè)定方法，對(duì)八批不同產(chǎn)地的山楂樣品進(jìn)行熊果酸含量測(cè)定。色譜圖見圖2，結(jié)果見表4。

圖2 山楂HPLC色譜圖

表4 8批不同產(chǎn)地山楂熊果酸含量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)果與討論

3.1 本試驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定荷芪煎煮茶中熊果酸含量，方法簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為該制劑的含量測(cè)定方法。

3.2 參考以熊果酸為山楂測(cè)定指標(biāo)的相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)多種流動(dòng)相進(jìn)行了選擇，最后確定流動(dòng)相為乙腈-0.05% 磷酸(67：33)，熊果酸峰形對(duì)稱，樣品分離良好。

3.3 因?yàn)椤吨袊?guó)藥典》2020年版一部收載的山楂含量是采用酸堿滴定法測(cè)定有機(jī)酸含量，因此根據(jù)以上8個(gè)不同產(chǎn)地山楂中熊果酸含量測(cè)定結(jié)果，故規(guī)定山楂飲片在符合《中國(guó)藥典》2020年版一部要求外，還需采用HPLC法測(cè)定山楂中熊果酸含量?？紤]到產(chǎn)地及批與批可能存在的含量差別，故定山楂按干燥品計(jì)算，含熊果酸(C30H4803)不得少于0.18 %。

3.4 根據(jù)樣品和山楂含量測(cè)定結(jié)果，暫定每袋荷芪煎煮茶中含山楂以熊果酸計(jì)，應(yīng)不得少于9.0 mg。

4 結(jié)論

采用本方法測(cè)定荷芪煎煮茶中熊果酸含量，方法簡(jiǎn)便，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為該制劑的含量測(cè)定方法，同時(shí)本方法可用作山楂中熊果酸含量測(cè)定方法。