吳遠(yuǎn)波，焦 濤，吳克勤，劉宇政，張 鴻*

(1.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，江西 南昌 330006；2.丹東市市場監(jiān)管事務(wù)服務(wù)中心藥檢部，遼寧 丹東 118002)

1 引言

木芙蓉花為錦葵科植物木芙蓉Hibiscus mutabilis L.的干燥花，秋季采收，始載于《本草圖經(jīng)》，具有清肺涼血，散熱解毒，消腫排膿的功效，用于治療肺熱咳嗽，瘰疬，腸癰，白帶；外治癰癤膿腫，膿耳，無名腫毒，燒、燙傷[1]。木芙蓉花富含黃酮類化合物，其中黃酮苷有蘆丁，異槲皮苷，金絲桃苷，槲皮素-4’-葡萄糖苷，槲皮黃苷[2]，槲皮素-3-山布雙糖苷[3]，花色苷有矢車菊素3，5-二葡萄糖苷，矢車菊素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷[2]，矢車菊素-3-接骨木二糖苷[4]，黃酮類有槲皮素，山柰酚[5]等。本文對木芙蓉花總黃酮進(jìn)行提取和純化的工藝研究，可為木芙蓉花總黃酮的進(jìn)一步應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

2 實驗部分

2.1 試劑和儀器

2.1.1 儀器

UV-5800型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；LE24E/02電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，感量：0.1 mg)；EX125ZH電子天平(奧豪斯儀器有限公司，感量：0.01 mg)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；DKM610C干燥箱(重慶雅馬拓科技有限公司)；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2.1.2 試劑與樣品

試藥：蘆丁對照品(批號：RFS-L00102003024，含量以98.0%計)，購自成都瑞芬思生物科技有限公司。聚酰胺(目數(shù)：30目～60目、60目～100目、100目～200目)，購自臺州市路橋四甲生化塑料廠。甲醇、乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純。

樣品：木芙蓉花采自南昌市，按要求曬干。經(jīng)丹東市市場監(jiān)管事務(wù)服務(wù)中心藥檢部焦?jié)鞴苤兴帋熻b定為木芙蓉Hibiscus mutabilis L.的干燥花。

2.2 實驗過程

2.2.1 總黃酮含量測定[6，7]

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.2015 mg的溶液，即得對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL和6 mL至25 mL量瓶中，各加95 %乙醇6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻放置6 min；然后加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻放置6 min，加10%氫氧化鈉溶液10 mL，最后加 95%乙醇至刻度，搖勻放置15 min測定。以相應(yīng)的溶液為空白。照紫外-可見分光光度法，在510 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程A=12.07c+0.012，r=0.9998，在0.008 mg/mL～0.048 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.1.2 樣品的測定

木芙蓉花提取液經(jīng)適量稀釋后，取1.0 mL至25 mL量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項下自“各加95%乙醇6 mL”起，依法測定吸收度值，并按回歸方程計算樣品液中總黃酮含量。

2.2.2 木芙蓉花總黃酮提取工藝的研究

2.2.2.1 單因素試驗

稱取木芙蓉花粉末10 g，共3份，分別以70 %、80 %和90 %的乙醇溶液為提取溶劑，加熱回流2次，每次加入提取溶劑100 mL，每次回流2 h，過濾，合并兩次濾液，測量總體積。取提取液按“2.2.1.2”項下方法進(jìn)行總黃酮含量測定。實驗結(jié)果見表1。由實驗結(jié)果可知，70 %乙醇作提取溶劑時，所得總黃酮提取量最高，因此，選用70%乙醇作為提取溶劑。

表1 木芙蓉花三種提取溶劑比較

2.2.2.2 提取工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以70%乙醇作為提取溶劑，以70%乙醇的用量、提取次數(shù)、提取時間為考察因素，每個因素考察3個水平，選用 L9(34)正交試驗表安排試驗，因素水平見表2。

表2 因素水平表

稱取9份木芙蓉花粉末，各10 g，按表3規(guī)定的70%乙醇用量、提取次數(shù)和回流時間，安排試驗，合并各次濾液，測量總體積。所得乙醇提取液按“2.2.1.2”項下方法進(jìn)行總黃酮含量測定，結(jié)果見表3、表4。另外，所得乙醇提取液，各精密量取25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，冷卻，稱重，計算干膏重量。

表3 正交試驗及結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

直觀分析結(jié)果表明，各因素對木芙蓉花總黃酮提取量的影響程度依次為B>C>A，即回流次數(shù)>回流時間>乙醇用量。方差分析結(jié)果顯示，因素B對總黃酮提取量具有顯著影響(P<0.05)，因素A與因素C對其不具有顯著影響。綜合直觀和方差分析結(jié)果，確定最佳回流提取工藝為A1B3C3，即以70%乙醇為提取溶劑，溶劑用量為8倍量，提取3次，每次提取3 h。

2.2.3 木芙蓉花總黃酮純化工藝的研究

經(jīng)過優(yōu)選提取工藝，所得的木芙蓉花乙醇提取干膏中總黃酮含量約為18%，為了進(jìn)一步提高該提取物的總黃酮含量，需對其進(jìn)行純化。

2.2.3.1 上樣液的準(zhǔn)備

稱取木芙蓉花粉末30 g，加8倍量70 %乙醇回流提取3次，每次3 h，合并各次提取液，將提取液減壓濃縮至無醇味，再加入約2倍量水，充分?jǐn)嚢韬笤? ℃～10 ℃冰箱放置48 h，過濾，濾液濃縮至原體積的25%左右，得粗提物作為上樣液，測量粗提物的體積。另外，精密量取粗提物5 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，冷卻，稱重，計算干膏重量。得粗提物85 mL，干膏重量為0.3720 g。

2.2.3.2 聚酰胺種類的篩選

取經(jīng)預(yù)處理的30目～60目聚酰胺、60目～100目聚酰胺和100目～200目聚酰胺各50 mL，分別濕法裝柱。取上樣液3份，各精密量取定量體積(折算干膏質(zhì)量0.5 g)，分別上3種聚酰胺柱，然后依次用10 %乙醇、30 %乙醇、95 %乙醇梯度洗脫，每次洗脫溶劑用量為200 mL，收集各段洗脫液，將各段洗脫液減壓濃縮并定容至50 mL。各洗脫液的濃縮液按“2.2.1.2”項下方法進(jìn)行總黃酮含量測定。結(jié)果見表5。

表5 三種聚酰胺純化總黃酮比較

由結(jié)果可見，使用100目～200目聚酰胺時，其30 %乙醇和95 %乙醇洗脫部位所得總黃酮量最多，故選擇100目～200目聚酰胺。

2.2.3.3 洗脫體積的篩選

取經(jīng)預(yù)處理的100目～200目聚酰胺50 mL，共3份，分別濕法裝柱。取上樣液3份，各精密量取定量體積(折算干膏質(zhì)量0.5 g)，上聚酰胺柱，然后依次用10 %乙醇、30 %乙醇、95 %乙醇梯度洗脫。第1根聚酰胺柱每次洗脫溶劑體積為100 mL；第2根聚酰胺柱每次洗脫溶劑體積為200 mL；第3根聚酰胺柱每次洗脫溶劑體積為300 mL。收集各段洗脫液，將各段洗脫液減壓濃縮并定容至50 mL。各洗脫液的濃縮液按“2.2.1.2”項下方法進(jìn)行總黃酮含量測定。另外，所得洗脫液的濃縮液，各精密量取25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，冷卻，稱重，計算干膏重量。結(jié)果見表6。

表6 三種洗脫溶劑體積純化總黃酮比較

由結(jié)果可見，洗脫溶劑體積為300 mL，其30 %乙醇和95 %乙醇洗脫部位所得總黃酮量最多，干膏中總黃酮含量也最高，達(dá)到73.20 %，故選擇洗脫溶劑體積為300 mL。

3 結(jié)果與討論

3.1 本文采用單因素試驗考察了木芙蓉花總黃酮的提取溶劑，在此基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗設(shè)計優(yōu)選木芙蓉花總黃酮的提取工藝。確定了木芙蓉花的最佳醇提工藝為：以70 %乙醇為提取溶劑，溶劑用量為8倍量，提取3次，每次回流提取3 h。

3.2 聚酰胺是根據(jù)各分離物質(zhì)和填料之間氫鍵強弱不同使其得到分離，主要用作分離黃酮一類的小分子物質(zhì)。經(jīng)篩選，確定了聚酰胺純化的最優(yōu)條件為：選擇100目～200目聚酰胺，洗脫溶劑體積為300 mL。經(jīng)聚酰胺層析柱純化后，木芙蓉花總黃酮的含量有了較大的提高，可以達(dá)到73.20 %，達(dá)到了提高木芙蓉花醇提物中總黃酮含量的目的。

3.3 用聚酰胺進(jìn)行總黃酮純化時，10 %乙醇洗脫部位主要是糖類等雜質(zhì)，經(jīng)檢測使用100目～200目聚酰胺純化時該部位幾乎無黃酮類成分。30 %與95 %乙醇部位總黃酮含量較高，我們將30 %與95 %乙醇部位數(shù)據(jù)合并統(tǒng)計結(jié)果。

4 結(jié)論

4.1 本文研究確定的木芙蓉花總黃酮提取純化方法，操作簡便、穩(wěn)定可靠，可用于木芙蓉花總黃酮的提取純化。

4.2 根據(jù)文獻(xiàn)[8，9]的報道，木芙蓉葉黃酮類成分為其抗炎有效成分。作為同一植物來源的木芙蓉花其總黃酮含量豐富，可以預(yù)見木芙蓉花總黃酮具有抗炎藥理作用。本文的研究可為木芙蓉花總黃酮的進(jìn)一步藥理研究及木芙蓉花的進(jìn)一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。