李婧婧 丁 龍 夏金鳳 黃 冠 方先勇 余洪根

（安徽國豪農(nóng)業(yè)科技有限公司，合肥 230088）

近年來，兩系雜交稻不斷發(fā)展壯大，是繼我國三系法雜交水稻后又一世界領(lǐng)先的原創(chuàng)性重大科技成果[1]。兩系法育種具有不受細胞質(zhì)和恢保關(guān)系制約、配組自由、能廣泛利用遺傳資源聚合優(yōu)良性狀的技術(shù)優(yōu)勢，為保障我國和世界糧食安全提供了新方法和新途徑。兩系法雜交水稻主要是利用光溫敏不育材料的育性轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)的，所以易受光、溫等環(huán)境條件的影響，在制種期間若遇異常天氣則導(dǎo)致不育系育性轉(zhuǎn)化，使其部分自交結(jié)實。此外，在制種生產(chǎn)時未能有效隔離則會造成串粉，在收獲、加工、包裝等環(huán)節(jié)疏忽則會造成種子機械混雜[2]。以上因素均會造成種子純度降低，因此，在種子銷售前必須對種子的純度進行檢測，以確保銷售的種子純度合格。

種子純度是種子四大質(zhì)量指標中重要的一項，純度的高低直接影響新品種市場規(guī)模、種子企業(yè)及農(nóng)民的經(jīng)濟效益。目前，種子純度鑒定有3 種形式:正季鑒定、海南鑒定、分子標記鑒定。正季鑒定時間滯后，其結(jié)果出來后種子已經(jīng)銷售。海南鑒定因其特殊的氣候條件，植株形態(tài)可能與正季不同。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子標記可以從DNA 水平上快速、準確地對種子純度進行檢測。SSR 標記因其鑒別能力強、穩(wěn)定、多態(tài)性好、檢測方便等優(yōu)點，成為現(xiàn)在室內(nèi)鑒定種子純度應(yīng)用最為廣泛的分子標記[3]。利用SSR 標記進行檢測的方法多為聚丙烯酰胺凝膠電泳法，此方法程序繁雜，耗時耗力且使用有毒試劑，污染實驗室環(huán)境。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，毛細管電泳解決了這一問題，在大量分戶樣品的純度檢測中快速簡便、安全可靠。

豪兩優(yōu)729 是安徽國豪農(nóng)業(yè)科技有限公司自主選育的秈型兩系雜交水稻品種，于2019 年10 月通過了國家農(nóng)作物品種審定委員會審定（審定編號:國審稻20190109）。豪兩優(yōu)729 在長江中下游作一季中稻種植。2016 年區(qū)域試驗、2017 年續(xù)試、2018 年生產(chǎn)試驗均比對照豐兩優(yōu)四號增產(chǎn)，分別增產(chǎn)3.32%、4.57%、4.14%。經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（杭州）檢測分析，米質(zhì)達部頒NY/T 593—2013《食用稻谷品種品質(zhì)》標準三級。豪兩優(yōu)729 被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認定為綠色水稻品種。

本研究以豪兩優(yōu)729 及其母本63-8S（安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所育成的水稻溫敏核不育系）和父本R729（自主選育的恢復(fù)系）為試驗材料，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法，對NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR 標記法》中推薦的48 對核心引物進行篩選，獲得適合豪兩優(yōu)729 測純的引物。利用毛細管電泳檢測技術(shù)對豪兩優(yōu)729的分戶樣進行快速純度檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料父本R729 標準樣是由安徽國豪農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，母本63-8S 標準樣是由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供，豪兩優(yōu)729 雜交種的分戶樣共4 份，其中2 份來自江西省贛州市會昌縣農(nóng)戶（張起新-1、張起新-2），另2 份分別來自江西省贛州市寧都縣農(nóng)戶（曾輝）、江蘇省鹽城市阜寧縣農(nóng)戶（唐守成）。SSR 引物采用NY/T 1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SSR 標記法》附錄C 中推薦的核心引物中的6對。試驗在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)國家重點實驗室完成，所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取隨機選取健康幼苗，分別取0.5～1.0cm 大小的葉片放入96 孔PCR 板中，每孔中加入40μL 0.25mol/L 的NaOH 溶液（NaOH 溶液應(yīng)該浸沒植物組織），蓋上軟膠蓋，放置于100℃的水浴鍋內(nèi)，加熱1min，取出后每孔加入60μL 0.17mol/L 的Tris-HCl 溶液，再置于水浴鍋沸水中煮3min，水煮后的樣品冷卻后即可作為PCR 反應(yīng)的模板，備用。

1.2.2 SSR 引物篩選采用6 對SSR 引物分別對豪兩優(yōu)729 雜交種子及其雙親進行多態(tài)性篩選。聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR 擴增產(chǎn)物進行檢測，染色采用銀染法。

1.2.3 PCR 擴增用篩選得到的SSR 引物分別對分戶樣的DNA 進行擴增。10μL PCR 反應(yīng)體系:10×Buffer（含Mg2+），2mmol/L dNTPs，5U/μL Taq DNA 聚合酶，50ng/μL SSR 引物。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性4min，1 個循環(huán)；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，共31 個循環(huán)；72℃延伸5min，1 個循環(huán)；4℃保存待用。

1.2.4 水稻種子純度檢測使用美國AATI 毛細管電泳儀（ZAG）對每個分戶樣的188 株種子苗的擴增產(chǎn)物進行檢測。根據(jù)儀器使用說明，對PCR 產(chǎn)物進行處理。一次可以上機9 板PCR 產(chǎn)物，并實現(xiàn)不間斷循環(huán)自動化檢測。使用PROSize 2.0 分析軟件對獲取的數(shù)據(jù)進行分析，并計算水稻種子純度。

種子純度（%）=（檢測種子總數(shù)-雜株種子數(shù)）/檢測種子總數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR 引物篩選本試驗從48 對引物中隨機選取了6 對引物（RM253、RM278、RM336、RM331、RM289、RM316）進行多態(tài)性篩選，結(jié)果顯示RM336的多態(tài)性最好，在母本中擴增的條帶大小為191bp，在父本中擴增的條帶大小為157bp，且在雜交種中呈現(xiàn)共顯性（圖1），可以用于豪兩優(yōu)729 雜交種子的純度鑒定。RM336 的引物序列（5′→3′）如下。RM336F:CTTACAGAGAAACGGCATCG；RM336R:GCTGGTTTGTTTCAGGTTCG。

圖1 RM336 對豪兩優(yōu)729 及其雙親的擴增結(jié)果

2.2 分戶樣的毛細管電泳純度鑒定結(jié)果選用SSR引物RM336 分別擴增4 份豪兩優(yōu)729 的分戶樣，每戶取200 粒種子發(fā)芽，分別提取188 份葉片DNA 用于PCR 擴增，對PCR 產(chǎn)物進行毛細管電泳檢測，并用PROSize 2.0 數(shù)據(jù)分析軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行分析。若所獲得的峰圖為雙峰且與RM336 引物在其父母本中篩選的峰值一致，則認定為雜交種；若所獲得的峰圖為雙峰且只有1 個峰值與RM336 引物在父母本中的峰值一致，則認定為異交種；若所獲得的峰圖為雙峰但雙峰的峰值均與RM336 引物在父母本中的峰值不一致，則認定為雜株；若所獲得的峰圖為單峰且主峰大小與RM336 引物在父本或者母本中的一個主峰大小一致，則認定為自交種。部分鑒定結(jié)果如圖2。4 個豪兩優(yōu)729 的分戶樣中，張起新-2 有2 粒異交種、2 粒自交種，其余3 個分戶樣中均僅有2 粒自交種，純度分別為:98.9%、97.9%、98.9%、98.9%。

圖2 豪兩優(yōu)729 及其父母本毛細管電泳純度鑒定峰圖

2.3 分戶樣的田間純度鑒定結(jié)果每個分戶樣田間鑒定，分別在苗期、抽穗期等整個生育期進行觀察，記錄各分戶樣的雜株類型和雜株數(shù)。田間正季鑒定結(jié)果顯示（表1），4 個豪兩優(yōu)729 分戶樣種子純度結(jié)果分別為99.5%、98.5%、99.4%、99.0%，與毛細管電泳檢測技術(shù)鑒定結(jié)果趨勢一致，驗證了毛細管電泳技術(shù)鑒定雜交稻純度的可靠性。

表1 豪兩優(yōu)729 分戶樣的田間純度調(diào)查結(jié)果

3 結(jié)論與討論

不同水稻品種的SSR 分子純度鑒定所使用的引物不同，所以在水稻種子純度檢測前要篩選出在雜交種的父母本之間存在多態(tài)性的SSR 引物。本試驗在篩選能夠用于豪兩優(yōu)729 雜交種純度鑒定的SSR 引物時，基于成本考慮選用了聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染法。聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染法無需昂貴的試驗儀器，且試劑耗材成本較低，對試驗人員的要求也較低，一般操作工在經(jīng)過培訓(xùn)后即可進行，在分析少量的材料時經(jīng)濟適用，所以在SSR 標記篩選時宜選擇此種方法。

在進行大量材料分析時，毛細管電泳檢測技術(shù)的優(yōu)勢就顯而易見了。首先，毛細管電泳檢測技術(shù)可以實現(xiàn)全程自動化，自動灌膠、上樣、電泳、收集數(shù)據(jù)等，一輪上樣可以檢測9 板PCR 產(chǎn)物，且24h 不停運轉(zhuǎn)，中間無需人員操作，省時省力，將操作者從低效率、大強度的工作中釋放出來，大大提高了工作效率，且避免了操作中的人為誤差，增強了試驗結(jié)果的可重復(fù)性和穩(wěn)定性[4]。其次，毛細管電泳檢測技術(shù)不需要使用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測中的甲醛、甲叉丙烯酰胺等有毒有害化學(xué)試劑，不僅對人體無害，而且對環(huán)境特別友好，有效保障了實驗室環(huán)境的安全衛(wèi)生。最后，因在上樣前，PCR 產(chǎn)物各孔中均加入了分子量內(nèi)標，各泳道的產(chǎn)物大小直接與其內(nèi)標比較，毛細管電泳檢測技術(shù)的檢測結(jié)果更加準確。而聚丙烯酰胺凝膠不可能在每個泳道中點入分子量標準，只能用肉眼與分子量標準比較估測得出，遠離分子量標準泳道的數(shù)據(jù)準確性難免會受到人為因素影響。

種子企業(yè)在大量制種時，通常委托多家制種企業(yè)，收到大量的分戶樣。種子企業(yè)要對各分戶樣進行質(zhì)量檢測，以確保入庫的種子質(zhì)量符合國家標準。大量分戶樣的純度檢測耗時耗力，采用一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法，一般從收獲到年關(guān)，2 個人每天都在做此項工作。而采用自動化程度較高的毛細管電泳檢測技術(shù)，只需要1 人即可提前完成。這也關(guān)系到生產(chǎn)商是否能夠及時拿到種子生產(chǎn)款，所以快速準確地進行分戶樣質(zhì)量檢測很有必要。在不考慮儀器成本的前提下，對大量樣品的分析，毛細管電泳檢測技術(shù)與聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法的費用基本持平[5]，但毛細管電泳檢測技術(shù)的效率以及環(huán)境安全性明顯較高，所以在大規(guī)模材料分析時，選擇用毛細管電泳檢測技術(shù)來完成，更加高效精準。