劉德柱，陳藝楊，張 蒙，田 雨，李早慧，于 丹，都曉偉

內生真菌生物轉化提高滇重樓皂苷含量及抗腫瘤作用研究

劉德柱，陳藝楊，張 蒙，田 雨，李早慧，于 丹*，都曉偉*

黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040

研究內生真菌-C39生物轉化提高滇重樓藥材皂苷類化學成分的含量，并增強重樓對癌細胞增殖的抑制作用，初步探討主要甾體皂苷的生物轉化機制。將內生真菌-C39分別與滇重樓藥材固體發(fā)酵和與重樓總皂苷提取物液體發(fā)酵，比較發(fā)酵前后重樓總皂苷和重樓皂苷I、II、VII的含量變化及對肝癌HepG2細胞、肺癌A549細胞和結腸癌HT-29細胞增殖抑制作用的差異；采用UPLC/Q-TOF-MS技術研究發(fā)酵前后重樓皂苷類化學成分的變化，并結合甾體皂苷生物合成途徑推測內生真菌-C39生物轉化提高重樓皂苷含量的機制。與滇重樓藥材相比較，發(fā)酵物中的重樓總皂苷、重樓皂苷I、II和VII的含量顯著提高，對3種癌細胞增殖的抑制作用顯著增強；人參皂苷Th、pseudoproto-Pb和parisyunnanoside B為-C39菌株生物轉化提高重樓皂苷I、II和VII含量的主要前體物質，它們在-C39菌株的作用下發(fā)生了C26糖基水解和環(huán)化反應，分別生成了重樓皂苷I、II和VII。內生真菌-C39可生物轉化提高重樓皂苷含量，并增強重樓的抗腫瘤作用，轉化機制可能與-C39真菌促使重樓皂苷前體物質發(fā)生糖基水解和環(huán)化反應相關。

內生真菌；滇重樓；微生物轉化；重樓皂苷I；重樓皂苷II；重樓皂苷VII；抗腫瘤活性

百合科植物滇重樓Smith var.(Franch.) Hand. -Mazz.是常用中藥材重樓的基原植物[1]，其主要活性成分為甾體皂苷類化合物[2]。重樓皂苷按化學結構可分為2大類：一類以薯蕷皂苷元為母核，如重樓皂苷I、重樓皂苷II等；另一類以偏諾皂苷元為母核，如重樓皂苷VI、重樓皂苷VII等[3]?，F(xiàn)代藥理學研究證明，重樓皂苷具有較強的抗腫瘤、止血、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和免疫調節(jié)等作用[4]，例如重樓總皂苷能抑制肺癌細胞[5]、鼻咽癌細胞[6]、胃癌細胞的增殖[7]；重樓皂苷I對肺癌細胞[8]和結腸癌細胞[9]具有抑制作用；重樓皂苷VI、VII對肝癌細胞有抑制作用[10]。除了作為藥材單獨使用外，重樓還是云南白藥、宮血寧膠囊等上百種中成藥的主要原料[11]，市場需求量大，藥材價格已由20世紀七八十年代的20～30元/kg暴漲至現(xiàn)今1500元/kg左右。大量的采挖使得野生重樓資源日益減少，而人工馴化栽培重樓又存在著生長緩慢，繁殖率低等困難。因此，如何利用現(xiàn)代技術和手段提升其有效成分含量，增強其藥理活性，對保護重樓野生資源，提高有限資源的利用率，研制和開發(fā)以重樓藥效成分為原料的藥物具有重要的意義。

微生物轉化技術是獲得低成本、高活性藥物的重要途徑。課題組前期從穿龍薯蕷Makino中分離篩選出一株可生物轉化提高薯蕷皂苷含量的內生真菌-C39，本研究將其與滇重樓藥材共同發(fā)酵培養(yǎng)，通過對發(fā)酵前后重樓主要皂苷成分的分析以及抑制癌細胞增殖作用的考察，明確內生真菌-C39生物轉化提高滇重樓皂苷含量及抗腫瘤的作用，并初步探討主要甾體皂苷成分的生物轉化機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

2965-2996型HPLC儀、ACQUITY UPLC （Waters，美國）；Triple-TOF TM 5600+質譜儀、數(shù)據(jù)采集軟件Analyst TF 1.6 software、數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)PeakView 2.0/masterview 1.0 software、MarkerView 1.2.1（AB SCEIX公司，美國）；Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）（Waters公司，美國）；Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（北京迪馬科技有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（香港力康公司）；Multiskan FC型酶標儀（Thermo公司，美國）；AB204-N型電子分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；BXM-30R型全自動高壓滅菌鍋、BJ-CD型潔凈工作臺、SPX-150C型恒溫恒濕箱、DSD-150型振蕩培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.2 材料

滇重樓藥材購自云南麻栗坡藥材公司（批號1801031SK1），經黑龍江中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室都曉偉教授鑒定為滇重樓Smith var.(Franch.) Hand. -Mazz.的干燥根莖；-C39菌株由本實驗室分離，于4 ℃冰箱保存，通過形態(tài)與分子鑒定確定該菌株為；對照品重樓皂苷I（批號111590-201604）、重樓皂苷II（批號111591-201604）、重樓皂苷VI（批號111592-201604）、重樓皂苷VII（批號111593-201604）、偽原薯蕷皂苷（批號 111855-201402）、薯蕷皂苷元（批號1539-200001）和偏諾皂苷元（批號16091802）均購自中國藥品生物制品檢定所；肝癌HepG2細胞、肺癌A549細胞和結腸癌HT-29細胞購于中山大學實驗動物中心；胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份有限公司；RPMI 1640細胞培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；MTT和二甲基亞砜購于Sigma公司；乙腈（色譜純）購于德國Merck公司；甲酸（色譜純）購自美國Fisher公司；蒸餾水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司；其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 Fusarium-C39菌株與滇重樓的發(fā)酵培養(yǎng)

2.1.1 固體發(fā)酵 精確稱取滇重樓藥材粗粉2 g，置100 mL錐形瓶中，用4 mL蒸餾水潤濕12 h，聚丙烯膜封口，121 ℃濕熱滅菌30 min，待冷卻后于無菌條件下接種-C39菌種子液2.3 mL，置于恒溫恒濕箱28 ℃靜止培養(yǎng)20 d。

2.1.2 液體發(fā)酵 稱取2 g滇重樓藥材粗粉，加70%乙醇50 mL回流2次，每次提取2 h，合并醇溶液，減壓回收至干得藥材提取物。用PD液體培養(yǎng)基150 mL轉移藥材提取物至250 mL錐形瓶中，聚丙烯膜封口，121 ℃濕熱滅菌30 min。待冷卻后于無菌操作臺接種-C39菌種子液1.2 mL，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，120 r/min，28 ℃培養(yǎng)7 d。平行培養(yǎng)-C39菌株做空白對照。

2.2 滇重樓發(fā)酵前后總皂苷和重樓皂苷I、II、VII的含量測定

2.2.1 固體發(fā)酵前后總皂苷和重樓皂苷I、II、VII的含量測定 取2 g重樓藥材的固體發(fā)酵物，加70%乙醇140 mL超聲提取2次，每次40 min，抽濾，合并濾液，回收至干后再加水溶解。水溶液分別用石油醚和水飽和正丁醇萃取，取正丁醇部位，回收至干。以未發(fā)酵的滇重樓藥材做隨行對照。殘渣加甲醇定容至10 mL，采用紫外-可見分光光度法測定重樓總皂苷含量[12]；采用HPLC法測定重樓皂苷I、II和VII的含量，色譜條件為：Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈（A）-水（B）為流動相梯度洗脫：0～25 min，40%～60% A；25～35 min，60%～40% A，體積流量1.0 mL/min，檢測波長203 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL。

2.2.2 液體發(fā)酵前后總皂苷和重樓皂苷I、II、VII的含量測定 取150 mL液體發(fā)酵物，將菌絲和菌液抽濾分離，菌絲加入50 mL水飽和正丁醇超聲3次，每次30 min；菌液減壓回收至20 mL，加入等體積水飽和正丁醇萃取3次，合并菌絲和菌液萃取液，減壓回收至干。以未發(fā)酵的滇重樓藥材提取物做隨行對照。樣品處理方法和含量測定方法同“2.2.1”項下。

2.3 重樓固體發(fā)酵前后對癌細胞增殖的抑制作用實驗

按照“2.2.1”項下制備實驗樣品，取正丁醇部位凍干。以DMSO溶解凍干粉，配制成10 mg/mL的母液4 ℃保存，使用時用無血清培養(yǎng)基稀釋母液到所需濃度，除菌濾過，備用。采用MTT法[13]測定各實驗樣品對肝癌HepG2細胞、肺癌A549細胞和結腸癌HT-29細胞增殖的抑制作用。

2.4 重樓皂苷I、II和VII的液相-質譜分析

2.4.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取適量重樓皂苷I、II、VI、VII，偽原薯蕷皂苷，薯蕷皂苷元以及偏諾皂苷元對照品，配制成各對照品濃度均為0.1 mg/mL的混合對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 精確量取150 mL發(fā)酵液濃縮至20 mL，加乙醇至80%，沉淀12 h，抽濾，旋干，80%乙醇定容，獲得供試品溶液。

2.4.3 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；流動相為0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；梯度洗脫：0～2 min，95%～60% A；2～22 min，60%～0 A；22～22.1 min，0～95% A；22.1～25 min，95% A；體積流量0.3 mL/min；進樣量2 μL。

2.4.4 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正負離子交替掃描；離子源溫度550 ℃；碰撞電壓500 V；裂解電壓80 V；碰撞能量40 eV；碰撞能量擴展15 eV；氮氣為霧化氣體；輔助氣Gas1和Gas2均為55 psi（1 psi=6.895 kPa）；氣簾氣Cur Gas為35 psi。一級質譜母離子掃描范圍為80～1500，相關信息掃描（IDA）設置響應值超過100 cps的最高峰進行二級質譜掃描，子離子掃描范圍為/50～1500，開啟動態(tài)背景扣除（DBS）。

2.4.5 數(shù)據(jù)分析 （1）通過質譜處理工作站（Markerview）對數(shù)據(jù)進行篩查，獲取發(fā)酵前后樣品數(shù)據(jù)的分型信息，選擇發(fā)酵前后有顯著性差異（＜0.05）且離子強度差異倍數(shù)（Fold Change）＞1.5倍的離子作為發(fā)酵前后的差異化合物。（2）依據(jù)精確質量數(shù)及同位素豐度比確定差異化合物的分子式，通過與對照品和數(shù)據(jù)庫的二級譜圖比對以及裂解規(guī)律分析，并結合現(xiàn)有文獻報道[14-20]，最終確定結構式。（3）結合甾體皂苷的生物合成途徑從差異化合物中挖掘生物轉化生成重樓皂苷I、II和VII的前體物質，解析發(fā)酵后重樓皂苷I、II和VII含量提升的機制。

2.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)分析和處理，計量資料以表示，采用檢驗，以值小于0.05為有統(tǒng)計學意義。

3 結果與分析

3.1 Fusarium-C39菌發(fā)酵提高滇重樓皂苷類成分的含量

重樓皂苷對照品、-C39空白菌液、滇重樓原藥材、滇重樓原藥材乙醇提取物、滇重樓固體發(fā)酵物、滇重樓液體發(fā)酵物的HPLC圖見圖1，滇重樓固體發(fā)酵物和液體發(fā)酵物中重樓皂苷的增長率見圖2。與滇重樓原藥材比較，固體發(fā)酵物和液體發(fā)酵物中總皂苷、重樓皂苷I、重樓皂苷II以及重樓皂苷VII的含量均有顯著提高。如圖2所示，采用固體發(fā)酵方法，-C39菌使重樓總皂苷、重樓皂苷I、重樓皂苷II和重樓皂苷VII的含量分別提高了60.01%、86.36%、75.60%和52.07%；液體發(fā)酵物中重樓總皂苷、重樓皂苷I、重樓皂苷II和重樓皂苷VII的含量分別提高了28.89%、61.89%、48.81%和27.63%?？梢姡?C39菌通過發(fā)酵能夠生物轉化提高滇重樓中重樓皂苷成分的含量。

A-Fusarium-C39發(fā)酵液 B-重樓皂苷對照品 C-重樓藥材 D-重樓固體發(fā)酵物 E-重樓皂苷提取物 F-重樓液體發(fā)酵物 1-重樓皂苷VII 2-重樓皂苷II 3-重樓皂苷I

圖2 Fusarium-C39菌與滇重樓固體發(fā)酵(A)和液體發(fā)酵(B)對重樓皂苷的增長率

3.2 滇重樓固體發(fā)酵物抑制癌細胞增殖實驗結果

MTT實驗結果見圖3，在0～500 μg/mL濃度范圍內，滇重樓固體發(fā)酵前后的總皂苷提取物均具有抑制肝癌HepG2細胞、肺癌A549細胞和結腸癌HT-29細胞增殖的作用。滇重樓原藥材的總皂苷提取物對肝癌HepG2細胞、肺癌A549細胞和結腸癌HT-29細胞的IC50值分別為43.37、276.18、66.75 μg/mL，而固體發(fā)酵物的總皂苷提取物對3種癌細胞的IC50值分別下降為24.07、87.43、17.42 μg/mL。可見與原藥材相比較，滇重樓固體發(fā)酵后對癌細胞增殖的抑制作用顯著增強。

與原藥材比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3.3 發(fā)酵過程中重樓皂苷I、II和VII的生物轉化分析

滇重樓發(fā)酵物的UPLC-MS總離子流圖見圖4，相關化合物的MS/MS圖見圖5，與重樓皂苷I、II和VII生物轉化相關的化合物列于表1。采用“2.4.5”項下的方法對UPLC-MS數(shù)據(jù)進行篩查，與原藥材比較，發(fā)酵后重樓皂苷I、II和VII的含量明顯升高，而化合物Th、pseudoproto-Pb和parisyunnanoside B的含量顯著下降。后3種化合物均為呋甾類皂苷，在C26位上連有糖基，經過水解脫去糖基后，開鏈不穩(wěn)定而產生環(huán)合，可形成螺甾結構的薯蕷皂苷。根據(jù)已有報道的甾體皂苷生物合成途徑分析[21]，推測發(fā)酵過程中，滇重樓中的Th、pseudoproto-Pb和parisyunnanoside B等成分在-C39真菌高表達水解酶的作用下，其C26上連接的糖基首先發(fā)生水解，然后脫去糖基的部位再環(huán)合，分別轉化成重樓皂苷VII、重樓皂苷II和重樓皂苷I，從而使發(fā)酵物中的3種重樓皂苷含量顯著提升。課題組對不同發(fā)酵時間-C39菌株轉錄組學分析中也發(fā)現(xiàn)，-C39菌株在與滇重樓發(fā)酵過程中，羥基化、羰基化、糖基化和水解等酶的相關基因表達均上調，發(fā)揮了結構修飾作用，從代謝酶角度佐證了對生物轉化途徑的推測?；衔锷镛D化途徑見圖6。

1-Th 2-pseudoproto-Pb 3-parisyunnanoside B 4-重樓皂苷VII 5-重樓皂苷II 6-重樓皂苷I

A-重樓皂苷I B-重樓皂苷II C-重樓皂苷VII D-Th E-pseudoproto-Pb F-parisyunnanoside B

表1 發(fā)酵過程中與重樓皂苷I、II和VII生物轉化相關的化合物

Table 1 Compounds related to biotransformation of polyphyllin I, II and VII during fermentation

峰號tR/min選擇離子測定值（m/z）誤差×10?6分子式主要二級碎片離子（MS/MS）及來源鑒定結果變化趨勢 1 4.63[M+H?H2O]+1 193.599 02.93C57H94O271 193.596 9, 1013.533 8, 927, 6557, 721.413 4, 593.3686, 431.313 1, 413.305 1Th下降 2 6.56[M+H]+1 177.606 55.01C57H92O251 177.599 1, 1015.549 5, 869.487 4, 723.431 9, 577.372 5, 415.319 8, 397.309 2pseudoproto-Pb下降 3 6.73[M+H]+1 017.529 42.26C50H82O221 017.524 4, 855.468 3, 723.430 3, 577.370 1, 415.325 8, 271.207 1, 253.197 4parisyunnanoside B下降 412.15[M+H?H2O]+1 013.536 64.34C51H82O211 013.532 3, 867.472 9, 721.413 8, 575.358 4, 413.305 4, 395.294 7, 269.189 9, 251.179 1重樓皂苷 VII提升 515.88[M+H]+1 015.551 43.64C51H82O201 015.545 3, 869.486 6, 723.430 4, 577.372 9, 415.320 7, 397.309 7, 271.206 1, 253.195 4重樓皂苷 II提升 616.23[M+H]+ 855.476 12.22C45H72O17885.470 3, 723.426 2, 577.370 1, 433.256 3, 415.317 9, 397.307 4, 271.203 7, 253.193 0重樓皂苷 I提升

圖6 Fusarium-C39菌株促進重樓皂苷I、II和VII生物轉化的可能途徑

4 討論

本研究采用微生物轉化技術，將-C39菌與滇重樓藥材共同發(fā)酵培養(yǎng)，使重樓總皂苷、重樓皂苷I、II和VII的含量均大幅度提高。同時發(fā)酵后的總皂苷提取物對肝癌HepG2細胞、肺癌A549細胞和結腸癌HT-29細胞增殖的抑制作用也顯著提升，這與重樓皂苷I、II和VII具有抑制上述3種癌細胞增殖作用的文獻報道相一致[13, 22-24]，證明滇重樓發(fā)酵后抗癌活性的增強與重樓皂苷I?II和VII的含量升高有關。

-C39菌發(fā)酵促使滇重樓中甾體皂苷類成分含量提高的機制，推測是由于滇重樓藥材中存在著與這些甾體皂苷類成分生物合成相關的前體物質，當-C39菌與滇重樓藥材共培養(yǎng)時，二者之間發(fā)生了交互作用。一方面，滇重樓存在下的培養(yǎng)環(huán)境影響誘導-C39菌產生了某些特殊的酶，這些生物酶反過來又催化藥材中的化學物質發(fā)生了結構改變，促使原藥材中的前體物質向甾體皂苷類成分的轉化，從而實現(xiàn)了發(fā)酵后甾體皂苷類成分大幅升高的結果，同時顯著提高了滇重樓的抗腫瘤作用。本實驗對比了滇重樓發(fā)酵前后化學成分的變化，對重樓皂苷I、II和VII的生物轉化過程進行了分析與探討，發(fā)現(xiàn)在發(fā)生不同程度的升高或降低的多種化學成分中，化合物Th、pseudoproto-Pb和parisyunnanoside B的變化最為顯著，參照-C39菌株的轉錄組學研究結果，結合代謝酶的分析，推測上述3種化合物為-C39菌株生物轉化提高重樓皂苷I、II和VII含量的前體物質，它們在-C39菌株代謝酶的作用下發(fā)生了糖基水解和環(huán)化反應，分別生成了重樓皂苷I、II和VII。

本研究工作證實，-C39菌株具有生物轉化提高重樓皂苷I、II和VII含量的作用與能力，將-C39菌株與滇重樓共同發(fā)酵為獲取重樓皂苷I、II和VII的有效途徑。甾體皂苷的生物合成過程極為復雜，迄今為止相關的生物合成途徑尚未得到全面闡釋，本實驗的研究結果對進一步了解和揭示重樓皂苷的生物合成過程，以及重樓藥材資源的深入開發(fā)和利用具有實際意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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[24] You L, Geng H, Yang X,. The comparison analysis of polyphyllin I and its analogues induced apoptosis of colon and lung cancer cells via mitochondrial dysfunction [J]., 2021, 129(1): 15-25.

Study on biotransformation of endophytic fungus to enhance saponins content and antitumour activity of

LIU De-zhu, CHEN Yi-yang, ZHANG Meng, TIAN Yu, LI Zao-hui, YU Dan, DU Xiao-wei

Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China

To study the fermenting effect of endophytic fungus-C39 with Dian chong lou () on enhancing the saponins content and antitumour activity, and preliminarily investigate the biotransformation mechanism of main steroid saponins.The endophytic fungus-C39 was fermented withand total saponins extract, respectively. The contents of total saponins and polyphyllin I, II and VII fromand its fermentation, and the inhibitory effects on the proliferation of HepG2, A549 and HT-29 of them were compared. UPLC/Q-TOF-MS was used to study the changes of saponins before and after fermentation, and the mechanism of biotransformation was deduced by referring with the biosynthesis pathway of steroidal saponins.Compared with, the contents of total saponins, polyphyllin I, II and VII in the fermentation were significantly increased, and the inhibitory effect on the proliferation of tumour cells was significantly enhanced. Th, pseudoproto-Pb and parisyunnanoside B were determined as main precursor substances. They were biotransformed into polyphyllin I, IIand VII by the deglycosylation of C26and cyclization under the catalysis of-C39.Endophytic fungus-C39 could increase the saponins content and enhance the anti-tumor effect ofby fermentation. The transformation mechanism was probably related to the deglycosylation and cyclization of the precursor substances catalyzed by-C39.

endophytic fungus;Smith var.(Franch.) Hand. -Mazz.; microbial transformation; polyphyllin I; polyphyllin II; polyphyllin VII; antitumor activity

R286.2

A

0253 - 2670(2022)14 - 4486 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.027

2021-11-13

國家自然科學基金面上項目（81872967）

劉德柱（1986—），男，研究實習員，研究方向為中醫(yī)藥基礎研究。E-mail: 253720985@qq.com

于 丹（1980—），女，副教授，研究方向為天然藥物質量評價。E-mail: yd10011@163.com

都曉偉（1962—），女，教授，研究方向為天然藥物質量評價。E-mail: xiaoweidu@hotmail.com

[責任編輯 時圣明]