郝佳夢，常麗萍，王 璐，劉 煥，陳 檬，侯 斌, 4，周璐恒，侯云龍, *

基于網(wǎng)絡藥理學及實驗驗證探究芪藶強心膠囊治療射血分數(shù)保留型心衰的作用機制

郝佳夢1, 2，常麗萍4, 5，王 璐3, 5，劉 煥3，陳 檬3, 5，侯 斌3, 4，周璐恒3，侯云龍1, 2, 3*

1. 河北醫(yī)科大學，河北 石家莊 050017 2. 河北以嶺醫(yī)院 國家中醫(yī)藥管理局重點研究室（心腦血管絡?。颖?石家莊 050023 3. 石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050023 4. 絡病研究與創(chuàng)新中藥國家重點實驗室，河北 石家莊 050023 5. 河北省絡病重點實驗室，河北 石家莊 050023

基于網(wǎng)絡藥理學及實驗驗證探討芪藶強心膠囊治療射血分數(shù)保留型心衰（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）的作用機制。將44個明確鑒定的芪藶強心膠囊體內代謝物檢識有效成分，利用Swisstargetprediction、pharmmapper平臺預測化合物靶點，OMIM、DisGenet、GenCard數(shù)據(jù)庫中檢索HFpEF疾病靶點；取交集靶點，利用String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.7.2軟件進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）和拓撲分析；Metescape平臺對共同靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。構建醋酸脫氧皮質酮（deoxycorticosterone acetate，DOCA）鹽敏感型HFpEF大鼠模型，給予沙庫巴曲纈沙坦或芪藶強心膠囊進行干預，給藥8周后，利用小動物超聲成像系統(tǒng)、ELISA、免疫熒光、Western blotting、qRT-PCR方法進行藥效學評估和環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosinc monophosphate，cGMP）-蛋白激酶G1（protein kinase G1，PKG1）信號通路相關靶點驗證。芪藶強心膠囊有效成分和HFpEF分別篩選出38個相同作用靶點；GO功能及KEGG通路富集分析得出其在血液循環(huán)、循環(huán)系統(tǒng)、心臟收縮等生物過程，膜筏、軸突、細胞質區(qū)等細胞成分，α-葡萄糖苷酶活性、內肽酶活性、水解酶活性等分子功能上起作用，涉及cGMP-PKG信號通路、腎素分泌、鈣信號通路等。體內實驗證實芪藶強心能夠提高HFpEF大鼠射血分數(shù)，降低室壁肥厚程度，縮短等容舒張時間（isovolumic relaxation time，IVRT），提升左室舒張期充盈速度比值（＜0.05）；提高血清一氧化氮（nitric oxide，NO）、cGMP水平（＜0.05）；增強心肌組織內皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）熒光表達（＜0.05、0.01）；增加eNOS、PKG1、心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶（sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA）、可溶性鳥苷酸環(huán)化酶α（soluble guanylate cyclase α，sGCα）蛋白表達水平（＜0.05、0.01），降低cGMP特異性磷酸二酯酶5A（cGMP-specific phosphodiesterase 5A，PDE5A）蛋白表達水平（＜0.05）；減少心肌組織B型腦鈉肽（B-type brain natriuretic peptide，）、β-肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain β，）的mRNA表達（＜0.05）。芪藶強心膠囊可通過成分-多靶點-多環(huán)節(jié)發(fā)揮HFpEF的治療作用，其機制與調節(jié)cGMP-PKG信號通路有關。

網(wǎng)絡藥理學；芪藶強心膠囊；射血分數(shù)保留型心衰；內皮功能；脈絡學說；環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G1通路

射血分數(shù)保留型心衰（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）是指左室射血分數(shù)≥50%的心力衰竭，特征是左室等容舒張延長、左室僵硬度增加、左室舒張末壓增加和左室充盈緩慢[1]。HFpEF是一個具有高發(fā)病率和高死亡率的緊迫臨床事件[2]，已經(jīng)成為一個主要的公共健康問題，其患病率現(xiàn)在已經(jīng)超過了射血分數(shù)降低型心衰（heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF）[3]。HFpEF患者的預后較差[4]，到目前為止，沒有任何治療顯示可以有效降低其發(fā)病率或死亡率[5]，成為國際醫(yī)學研究的難點和熱點。

內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）/一氧化氮（nitric oxide，NO）/環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosinc monophosphate，cGMP）/蛋白激酶G1（protein kinase G1，PKG1）通路在防止心肌損傷、心室重塑和心腎綜合征方面起著重要作用[6]，該通路的損傷是HFpEF的病理生理學基礎。cGMP及其主要靶激酶PKG是公認的心臟功能和慢性應激反應的調節(jié)劑，介導NO和利鈉肽的生理功能，在心血管系統(tǒng)的維持中發(fā)揮重要功能：它們的增強能夠引起心肌制動，減少不適應性肥大，增強細胞存活信號和線粒體功能，防止缺血/再灌注損傷，并減弱兒茶酚胺的刺激作用[7-8]。激活cGMP/PKG信號通路已成為治療心力衰竭的有效治療策略[9]，可能成為HFpEF治療的一個新靶點[10]。

中醫(yī)脈絡學說理論指導下研制的芪藶強心膠囊是治療慢性心衰的代表中成藥，循證醫(yī)學研究證實其治療慢性心力衰竭的安全性及有效性[11-12]。前期臨床研究報道芪藶強心膠囊對HFpEF患者臨床癥狀和中醫(yī)證候評分、明尼蘇達心力衰竭生活質量量表（MLHFQ）評分、6 min步行試驗（6WMT），E/E’值、左房容積指數(shù)（LAVI）、左室舒張期充盈速度比值（E/A）均有明顯改善，提高患者的生活質量[13]。芪藶強心膠囊是首個進入《舒張性心力衰竭診斷和治療專家共識》的中成藥[14]，然而其治療HFpEF的基礎研究及機制探討尚未完全開展。本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法[15]對芪藶強心治療HFpEF的關鍵靶點和信號通路預測，采用醋酸脫氧皮質酮（deoxycorticosterone acetate，DOCA）-鹽敏感性高血壓大鼠建立HFpEF模型，通過體內實驗驗證網(wǎng)絡藥理學的預測結果，以探索芪藶強心膠囊治療HFpEF可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠50只，6周齡，體質量（200±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK2016-0006。飼養(yǎng)于屏障環(huán)境內，12 h明暗循環(huán)光照，濕度（50±10）%，溫度（23±2）℃，自由進食飲水，適應性喂養(yǎng)1周。動物實驗由河北以嶺醫(yī)藥研究院動物倫理委員會負責批準（批準號2021024）。

1.2 藥品與試劑

芪藶強心膠囊（批號S-130901）購自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，利用UPLC-Q-TOF/MSE技術[16]從芪藶強心膠囊中鑒定了40個化合物，其中黃酮類化合物3種，人參皂苷類化合物19種，C21甾糖苷類化合物7種，黃芪皂苷類化合物7種，以及丹酚酸類2種，二萜醌類2種；沙庫巴曲纈沙坦鈉片（批號J20190001，50 mg/片）購自北京諾華制藥有限公司；醋酸去氧皮質酮（批號D129628）、氯化鈉（批號WXBD3635V）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；NO測定試劑盒（A013-2-1）購自南京建成；cGMP ELISA試劑盒（E-EL-0083c）購自Elabscience；eNOS、CD31、cGMP特異性磷酸二酯酶5A（cGMP-specific phosphodiesterase 5A，PDE5A）兔抗（批號分別為GB12086、GB11063-2、GB111522）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；可溶性鳥苷酸環(huán)化酶α（soluble guanylate cyclase α，sGCα）抗體（批號bs-13544R）購自Bioss公司；肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶（sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA2）抗體（批號ab150435）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號ab181602）、羊抗兔二抗IgG-H&L Alexa Fluor?488（批號ab150077）、羊抗兔二抗IgG-H&L Alexa Fluor?594（批號ab150080）、羊抗兔二抗IgG-H&L IRDye?800CW（批號ab216773）、羊抗兔二抗IgG-H&L IRDye?680RD（批號ab216777）購自英國Abcam公司；總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自日本Takara公司。

1.3 儀器

Vevo 3100LT型小動物超聲（加拿大FUJIFILM公司）；RM2235型組織切片染色機（日本Sakura公司）；SynergyH4型多功能酶標儀（美國Bio Tek公司）；Trans-Blot SD型半干電轉膜儀、C1000型反轉錄熱循環(huán)儀（美國Bio-Rad公司）；Oddessy型雙色紅外激光掃膜儀（美國LI-COR公司）；LSM710型激光共聚焦顯微鏡（德國ZEISS公司）；7900HT型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡藥理學預測芪藶強心膠囊治療HFpEF的作用機制

2.1.1 芪藶強心膠囊主要活性成分靶點預測 本課題組前期對芪藶強心膠囊11味藥材通過自建化合物數(shù)據(jù)庫完成對其化學成分的全面檢識，共發(fā)現(xiàn)包括黃酮、生物堿、皂苷等在內的多種化合物，通過大鼠體內代謝物檢識，其中44個化合物利用對照品進行了確認[17]。將這44個活性成分，分別輸入PubChem平臺（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）保存化合物的mol2結構，未查詢到的根據(jù)文獻檢索確定其化合物結構，在Swisstargetprediction（http://www.swisstargetprediction.ch）和Pharmmapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper）平臺中上傳化合物結構圖，搜索的輸入格式為Homo sapiens[organism]，得到相應預測靶點。

2.1.2 HFpEF疾病相關靶點信息 在OMIM（https://omim.org/）、DisGeNET（https://www. disgenet.org/）、GenCard（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中檢索“射血分數(shù)保留型心衰”“HFpEF”“射血分數(shù)保留型心衰”“舒張性心衰”的疾病相關靶點，去除重復值。應用R軟件將得到的疾病靶點和篩選出的藥物活性成分及潛在靶點進行比較，得到二者共同靶點并制作韋恩圖，得到藥物和疾病共同靶點。

2.1.3 芪藶強心膠囊-HFpEF蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡的構建 在String（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫導入共同基因數(shù)據(jù)，選擇“homo sapiens”物種，將medium confidence（0.7）設置為最低相互作用分數(shù)，其余參數(shù)默認，導出PPI網(wǎng)絡圖和TSV文件。利用Cytoscape 3.7.2軟件構建PPI拓撲網(wǎng)絡。

2.1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 運用Metescape（https://metascape.org）平臺對38個活性成分和疾病的共同靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，分析類型為H.sapiens（38），設置＜0.01，取排名前10和前20的結果分別繪制GO柱狀圖和KEGG氣泡通路圖，運用R軟件進行結果可視化。

2.2 實驗驗證

2.2.1 造模、分組及給藥 HFpEF采用DOCA-鹽敏感大鼠模型：大鼠麻醉后右側臥位固定，消毒后沿脊柱左側十二肋游離緣做2 cm縱形切口，手術縫合線結扎整個腎動靜脈及輸尿管，剪去腎臟，ip 10 000 U青霉素以抗感染。生命體征穩(wěn)定后放回鼠籠中飼養(yǎng)，1%鹽水飲水，同時sc DOCA（25 mg/kg，每4天1次），自由飲食。4周后使用小動物超聲儀檢測大鼠心功能，射血分數(shù)（ejection fractions，EF）大于50%且E/A值降低視為HFpEF模型建立成功。

芪藶強心膠囊劑量選擇參考國家973計劃“基于微血管病變性疾病的營衛(wèi)‘由絡以通、交會生化’研究”實驗用藥推薦劑量，其中0.5 g/kg劑量為臨床等效劑量，本研究選擇該劑量為低劑量組，4倍臨床劑量2 g/kg為高劑量組，以觀察量效關系。沙庫巴曲纈沙坦劑量參考藥品說明書，換算為大鼠每日給藥劑量20 mg/kg進行后續(xù)實驗。

設10只未行手術大鼠為對照組，選擇40只成模大鼠分為模型組、沙庫巴曲纈沙坦（20 mg/kg）組和芪藶強心膠囊低、高（0.5、1.0 g/kg）劑量組，每組10只，各給藥組ig相應藥物，對照組和模型組ig等體積羧甲基纖維素鈉，1次/d，連續(xù)8周。

2.2.2 超聲心動圖檢測各組大鼠心功能 大鼠在1%異氟醚氧氣混合物中麻醉，在胸骨旁長軸切面獲得標準M型成像，獲得獲得心率（heart rate，HR）、EF、左心室前/后壁厚度（left ventricular anterior/posterior wall thickness，LVAW/LVPW）、左室舒張末期內徑/收縮末期內徑（end-diastolic left ventricular internal dimension/end-systolic left ventricular internal dimension，LVIDd/LVIDs）。四腔心切面的二尖瓣多普勒血流圖像中獲得等容舒張時間（isovolumic relaxation time，IVRT）、等容收縮時間（isovolumic contraction time，LVCT）、被動左室充盈峰值速度（E）和心房收縮期峰值流速（A）。M型和多普勒研究的掃描速度為100 mm/s，心率保持在250～350次/min。

2.2.3 血清NO、cGMP水平的檢測 在12周實驗結束時，從腹主動脈采集血樣，輕輕翻轉10次以上置于在冰上。1800×離心10 min，獲得上層血清，轉移至1.5 mL離心管中；再以13 000×離心2 min，取血清，按試劑盒操作說明檢測NO、cGMP含量。

2.2.4 免疫熒光染色觀測心肌組織eNOS、CD31蛋白表達情況 動物處死后，將心臟固定在10%福爾馬林溶液，乙醇脫水后進行石蠟包埋。組織切片（4 μm）平行于根尖-基底軸進行。脫蠟和復水后，免疫熒光法測量eNOS和CD31評估心肌細胞內皮功能及密度。盲法評估隨機選擇的5個視野，并選擇1個代表性圖像。

2.2.5 Western blotting檢測心肌組織eNOS、PKG1、PDE5A、SERCA、sGCα蛋白表達 各組大鼠心臟組織加入裂解液，提取蛋白并進行BCA定量。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，用5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜，洗滌后孵育二抗結合。用Bio-Rad校準密度計掃描薄膜，將免疫印跡條帶的灰度值強度與內參對照。

2.2.6 qRT-PCR檢測心肌組織B型腦鈉肽（B-type brain natriuretic peptide，）和β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，）mRNA表達 參照RNA提取試劑盒說明書獲得大鼠心臟組織中總RNA并合成cDNA，擴增后完成qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-ACCTGGGCAAGTCCAACAAC-3’，下游引物5’-CGGACACGGTCTGAAAGGAT；上游引物5’-AGCCAGTCTCTCCAGAACAATCCA-3’，下游引物5’-CCGGTCTATCTTCTGCCCAAA-3’；上游引物5’-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3’，下游引物5’-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3’。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 網(wǎng)絡藥理學分析

3.1.1 芪藶強心膠囊治療HFpEF的網(wǎng)絡分析結果及靶點預測 44個活性成分（表1）在Swisstargetprediction和Pharmmapper平臺上共得到（去除重復值）530個潛在作用靶點；在OMIM、DisGenet、GenCard數(shù)據(jù)庫中檢索“射血分數(shù)保留型心衰”“HFpEF”“舒張性心衰”，3者取并集，去除重復值共得到672個作用靶點。利用Venn圖在線平臺得到藥物和疾病共同作用靶點38個，見圖1。

將38個共同靶點輸入STRING 11.0在線平臺得到的藥物-疾病靶點PPI網(wǎng)絡，共得到51條邊，平均節(jié)點度2.68。通過Cytoscape 3.7.2內置Network Analyzer插件進行PPI網(wǎng)絡拓撲分析。其中，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡中較為重要的靶基因與G蛋白偶聯(lián)受體、內皮素受體、β腎上腺能受體相關。

表1 芪藶強心膠囊中明確鑒定的活性成分

Table 1 Active components identified in Qili Qiangxin Capsule

活性成分CAS號活性成分CAS號 丹參酮IIA568-72-9 杠柳毒苷13137-64-9 talatizamine20501-56-8川陳皮素478-01-3 宋果靈509-24-0 尼奧寧466-26-2 丹參素鈉67920-52-9柚皮苷10236-47-2 sinapine thiocyanate7431-77-8新烏頭堿2752-64-9 丹酚酸B115939-25-8丹酚酸A96574-01-5 isorhamnetin-3-O-β-D-glucopyranoside5041-82-7異鼠李素-3,7-二-O-β-D-葡萄糖苷6758-51-6 蘆丁153-18-4 hesperidin520-26-3 迷迭香酸20283-92-5次烏頭堿6900-87-4 quercetin-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-β-gentiobioside1309067-39-7kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl-7-O-β-gentiobioside16290-07-6 quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside491-50-9 毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷20633-67-4 人參皂苷Re51542-56-4 毛蕊異黃酮20575-57-9 人參皂苷Rd52705-93-8 苯甲酰烏頭原堿63238-67-5 人參皂苷Rc11021-14-0 黃芪甲苷IV84687-43-4 人參皂苷Rb211021-13-9 黃芪甲苷II84676-89-1 人參皂苷Rb141753-43-9 黃芪甲苷I84680-75-1 附子靈80665-72-1 澤瀉醇F155521-45-2 刺芒柄花素485-72-3 澤瀉醇B18649-93-9 隱丹參酮35825-57-1澤瀉醇B 23-乙酸酯26575-95-1 肉桂酸621-82-9 澤瀉醇A19885-10-0 chlorogenic acid1049703-62-9 20(S)-人參皂苷Rg267400-17-3 人參皂苷Rg122427-39-020(S)-人參皂苷F262025-49-4

圖1 芪藶強心膠囊與HFpEF靶點Venn圖

3.1.2 GO功能及KEGG通路富集分析 借助Metescape分析平臺，共得到芪藶強心膠囊作用于HFpEF治療的499個生物過程，30個細胞成分，31個分子功能。篩選＜0.01排名前10的GO注釋結果做柱形圖展示如圖2。根據(jù)分析結果，芪藶強心膠囊可能參與調控了血液循環(huán)、循環(huán)系統(tǒng)、心臟收縮等生物過程；在膜筏、軸突、細胞質區(qū)等細胞組分中起作用；激活了α-葡萄糖苷酶活性、內肽酶活性、水解酶活性等分子功能。

KEGG共富集到52條通路，按照＜0.01，富集值≥1.5篩選前20條通路結果如圖2所示，芪藶強心膠囊治療HFpEF的潛在途徑可能為cGMP-PKG信號通路、心肌細胞中的腎上腺素能信號傳導、神經(jīng)活性配體受體相互作用、cAMP信號通路、腎素分泌、鈣信號通路等。其中富集度最高的cGMP-PKG信號通路是HFpEF治療的重要靶點[18]，本研究選用該通路進行體內實驗驗證探討芪藶強心膠囊治療HFpEF的作用機制。

3.1.3 網(wǎng)絡可視化分析 應用Cytoscape 3.7.2軟件對QLQX有效成分，疾病-藥物共有的38個潛在靶基因、生物過程、KEGG通路進行可視化網(wǎng)絡構建，如圖3所示。該網(wǎng)絡說明芪藶強心膠囊通過多組分、多靶點、多環(huán)節(jié)發(fā)揮對HFpEF的治療作用。

3.2 實驗驗證

3.2.1 各組大鼠一般狀態(tài)變化情況 對照組大鼠一般狀態(tài)良好，毛色光澤、行動敏捷、飲食及飲水量正常，尿量正常；模型組精神狀態(tài)欠佳，毛色粗糙，無光澤，行動遲緩，飲水量增多，尿量增多；各給藥組大鼠精神狀態(tài)及一般狀況有所改善。如表2所示，經(jīng)藥物干預8周后，與對照組相比，模型組心臟質量和心臟指數(shù)均明顯提升（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組心臟質量和心臟指數(shù)均顯著降低（＜0.01）；各組大鼠體質量無明顯差異。

菱形節(jié)點為活性成分，圓形節(jié)點為作用靶點，四邊形節(jié)點為生物過程，三角形節(jié)點為信號通路

表2 各組大鼠體質量和心臟指數(shù)比較(, n = 10)

Table 2 Comparison of body weight and cardiac index of rats in each group (, n = 10)

組別劑量/(g·kg?1)體質量/g心臟質量/g心臟指數(shù) 對照—508.00±14.901.44±0.122.78±0.26 模型—509.86±53.491.86±0.37##3.64±0.49## 沙庫巴曲纈沙坦0.02494.69±42.431.54±0.20*3.11±0.32** 芪藶強心膠囊0.5496.42±62.451.53±0.30**3.07±0.39** 2.0496.73±66.451.52±0.28**3.05±0.27**

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

3.2.2 芪藶強心膠囊對DOCA鹽敏感型HFpEF大鼠心功能影響 如圖4和表3所示，與對照組比較，模型組大鼠EF顯著降低（＜0.05），LVAW、LVPW顯著升高（＜0.05），提示心室壁肥厚，心功能下降；IVRT時間延長、E/A值下降（＜0.05），提示舒張功能障礙，EF尚處于正常范圍，IVCT無明顯差異，表明收縮功能未明顯損傷。沙庫巴曲纈沙坦組EF較對照組明顯降低（＜0.05），也處于正常范圍；LVAW較模型組降低（＜0.05），E/A比值顯著提升（＜0.01）；各組LVIDs、LVIDd無統(tǒng)計學差異，提示心室未增大。芪藶強心膠囊低劑量組EF、E/A值較模型組升高（＜0.05），未能降低室壁厚度。芪藶強心膠囊高劑量組較模型組明顯提高EF，IVRT時間縮短，E/A值提升（＜0.05），提示心室舒張功能明顯恢復，同時LVAW、LVPW降低（＜0.05），減輕了室壁肥厚程度。

3.2.3 芪藶強心膠囊對DOCA鹽敏感型HFpEF大鼠血清NO、cGMP水平的影響 如圖5所示，與對照組相比，模型組大鼠血清NO和cGMP水平均顯著下降（＜0.05、0.01）；與模型組相比，沙庫巴曲纈沙坦組血清NO水平顯著升高（＜0.05），芪藶強心膠囊低、高劑量組血清NO和cGMP水平均顯著升高（＜0.05）。

圖4 各組大鼠超聲心動圖典型圖像對比

表3 各組大鼠超聲心動圖參數(shù)比較(, n = 10)

Table 3 Comparison of echocardiographic parameters of rats in each group (, n = 10)

組別劑量/(g·kg?1)HREF/%LVAW/mmLVPW/mmIVRT/msIVCT/msE/ALVIDs/mmLVIDd/mm 對照—366.57±25.0578.68±9.733.19±0.603.39±0.7318.17±3.6918.39±6.311.15±0.224.74±0.618.49±0.64 模型—359.31±15.9767.28±6.04#3.66±0.44#3.81±0.50#20.86±2.98#18.49±3.841.02±0.26#4.68±0.538.21±0.67 沙庫巴曲纈沙坦0.02350.11±33.3168.86±2.983.32±0.31*3.63±0.3219.44±2.8719.69±3.081.18±0.15**4.66±0.578.32±0.49 芪藶強心膠囊0.5355.69±15.7872.34±5.36*3.52±0.373.63±0.3318.97±2.9719.55±4.031.15±0.18*4.70±0.778.55±0.79 2.0360.55±30.6273.85±6.91*3.39±0.28*3.60±0.39*18.23±2.14*19.05±4.351.10±0.17*4.85±0.668.56±0.53

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.2.4 大鼠心肌組織eNOS和CD31免疫熒光染色 內皮功能障礙被認為是HFpEF病理生理學的中心機制[19]。如圖6所示，綠色熒光為eNOS，紅色為CD31，二者均為內皮細胞標志物，共表達處呈現(xiàn)黃色。如圖7所示，與對照組相比，模型組大鼠心肌組織血管周圍eNOS熒光表達量顯著降低（＜0.01），而各給藥組均能明顯恢復大鼠心肌組織內皮功能（＜0.05），芪藶強心膠囊高劑量組效果更為明顯（＜0.01）。

圖6 各組大鼠心肌組織eNOS(綠色)、CD31 (紅色)、DAPI (藍色) 定位的免疫熒光圖像(×400)

圖7 各組大鼠心肌組織eNOS熒光強度比較

3.2.5 芪藶強心膠囊對心肌組織eNOS、PKG1、PDE5A、SERCA和sGCα蛋白表達的影響 如圖8和表4所示，與對照組相比，模型組大鼠心肌組織eNOS、PKG1和SERCA蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01），PDE5A蛋白表達水平顯著升高（＜0.05），sGCα蛋白表達水平降低但無統(tǒng)計學差異；與模型組相比，沙庫巴曲纈沙坦組eNOS、SERCA、sGCα蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05），PDE5A蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）；芪藶強心膠囊低劑量組eNOS、PKG1、sGCα蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01），PDE5A蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）；芪藶強心膠囊高劑量組eNOS、PKG1、SERCA和sGCα蛋白表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01），PDE5A蛋白表達水平顯著降低（＜0.05）。

圖8 各組大鼠心肌組織eNOS、PKG1、PDE5A、SERCA和sGCα蛋白的WB圖

表4 各組大鼠心肌組織eNOS、PKG1、PDE5A、SERCA和sGCα的蛋白表達(, n = 3)

Table 4 eNOS,PKG1,PDE5A,SERCA and sGCα proteins in myocardium of rats in each group(, n = 3)

組別劑量/(g·kg?1)蛋白相對表達量 eNOSPKG1PDE5ASERCAsGCα 對照—1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00 模型—0.88±0.08#0.77±0.27#1.60±0.41#0.61±0.05##0.88±0.07 沙庫巴曲纈沙坦0.021.32±0.17*0.99±0.231.25±0.29*0.94±0.25*1.31±0.59* 芪藶強心膠囊0.51.35±0.09*1.56±0.30**1.24±0.40*0.76±0.111.53±0.63* 2.01.39±0.30**1.44±0.19*1.30±0.17*1.02±0.21**1.53±0.46*

3.2.6 芪藶強心膠囊對心肌組織和mRNA表達的影響 如圖9所示，與對照組相比，模型組心肌組織和mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組相比，各給藥組心肌組織和mRNA表達水平均顯著降低（＜0.05）。

圖9 各組大鼠心肌組織BNP和β-MHC mRNA表達(, n = 4)

4 討論

HFpEF與左室舒張功能障礙密切相關，舒張功能障礙可由肥厚和間質纖維化導致的左室僵硬度增加以及鈣循環(huán)受損導致的左室舒張異常引起[20]。內皮炎癥及其繼發(fā)的內皮功能障礙被認為是HFpEF其重要病理機制[21]。肥胖、糖尿病、高脂血癥等全身促炎狀態(tài)可導致冠狀動脈微血管內皮炎癥，其級聯(lián)反應始于內皮細胞，通過抑制eNOS使內源性NO生物利用度降低，繼而影響cGMP含量及其下游PKG活性。這種低活性造成肌漿網(wǎng)上受磷蛋白和SERCA-2a活性降低，使Ca2+在肌漿網(wǎng)中積累，心肌無法正常松弛，繼發(fā)心肌細胞僵硬，舒張功能障礙。

中醫(yī)將心衰歸于“心積”“心水”等范疇，脈絡學說提出，心積、心水病機多為宗氣虧虛，心氣虛乏，營衛(wèi)交匯生化障礙為本，營衛(wèi)氣化失常瘀血阻滯脈絡津聚為水為主要病理過程[22]。宗氣虧虛，心臟氣陽虛乏、脈道無力，血無以運而形成脈絡瘀阻，同時營衛(wèi)交匯生化失司，陽虛不能化水，致使水飲停滯，氣、血、水三分合而發(fā)病，痰瘀互結，阻滯脈絡，導致絡息成積的的病理變化，可引起心臟組織腫大變形，室壁肥厚、纖維增生，致使心臟擴大和重塑，心功能惡化。脈絡學說將HFpEF病機歸納為“氣陽虛乏、絡瘀水停、絡息心積”，在“絡以通為用”治療原則指導下，進一步提出了“益氣溫陽、活血通絡、利水消腫”治法并研制了芪藶強心膠囊。本藥以黃芪、附子、人參、陳皮益氣溫陽，丹參、紅花活血通絡，葶藶子、香加皮、澤瀉、玉竹利水消腫，桂枝佐使以辛溫通絡，溫陽化氣，諸藥配伍使心慌氣短、不能平臥、尿少水腫諸癥自消，抑制心室重構，改善心臟功能，對HFpEF有較好的療效[23]。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，通過公共數(shù)據(jù)庫對芪藶強心膠囊明確鑒定的成分及HFpEF的共同作用靶點，利用生物信息學技術進行網(wǎng)絡構建，尋找芪藶強心治療HFpEF的可能作用靶點。既往亦有研究[24-26]通過網(wǎng)絡藥理學方法探究芪藶強心膠囊的作用機制，而所探討的疾病多為慢性心衰（HFrEF）、糖尿病性心肌病、充血性心力衰竭等，尚無HFpEF的網(wǎng)絡藥理學研究；同時，這些研究多通過TCMSP、BAT-MAN TCM等平臺直接檢索芪藶強心膠囊中11味藥物所有成分的各自靶點，未通過藥物代謝研究探索其在體內真正發(fā)揮藥效的物質成分，缺乏針對性，本研究彌補了這一缺陷。本課題組前期對芪藶強心膠囊11味藥材通過自建化合物數(shù)據(jù)庫完成對其化學成分的全面檢識，共發(fā)現(xiàn)包括黃酮類22種、二萜生物堿33種、三萜皂苷類44種，苯丙素類21種，其他類化合物11種，其中44個化合物利用對照品進行了確認[17]，又確認了毛蕊異黃酮-7--β--葡萄糖苷、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、杠柳苷G等成分為芪藶強心膠囊強心、利尿及擴血管的重要活性成分[27]。芪藶強心膠囊組方中黃芪、附子、人參、陳皮益氣溫陽，助陽化氣，針對氣陽虛乏的基本病機，本研究中鑒定的主要有效成分包括黃芪甲苷、異鼠李素、新烏寧堿、次烏頭堿、人參皂苷、橙皮苷等，具有非正性肌力洋地黃類作用，能改善心肌收縮、擴血管、增加細胞搏動頻率和幅度、改善心功能[28]；丹參、紅花活血化瘀以通脈絡，主要有效成分包括丹酚酸、丹參素鈉、丹參酮、毛蕊異黃酮、槲皮素等，可擴張冠狀動脈、減少紅細胞聚集、改善血黏度和血液流變等[29]；澤瀉、葶藶子、香加皮、玉竹養(yǎng)陰利水消腫以緩其癥，主要有效成分包括澤瀉醇、異鼠李素、杠柳毒苷、槲皮素-吡喃葡萄糖等，具有強心、利尿、抗炎、免疫調節(jié)等多種生物功能[30]。這些藥理作用為芪藶強心膠囊治療HFpEF奠定了基礎。

KEGG通路富集結果顯示，cGMP-PKG信號通路為芪藶強心膠囊治療HFpEF的高敏感通路，對此本研究進行了深入探討。NO-sGC-cGMP-PKG軸被描述為心臟舒縮的重要調節(jié)器[31]。在生理條件下，內皮細胞在一級聯(lián)反應中的關鍵作用是通過eNOS的活性生成NO，并激活sGC作為其靶細胞（如心肌細胞和血管平滑肌細胞）中的氣體遞質。作為回應，sGC產(chǎn)生cGMP，這是下游效應器PKG酶的關鍵調節(jié)因子，能夠調節(jié)血管緊張、松弛和收縮[32]。該系統(tǒng)的4個基本調節(jié)因子是磷酸二酯酶（GMP-binding cGMP-specific phosphodiesterase，PDE），PDE5A對cGMP分子具有特異性能夠將cGMP降解為5′-GMP，如果PDE上調加上增強的硝基氧化應激，可能顯著導致HFpEF患者心肌中cGMP-PKG信號受損[33]。舒張功能障礙還可能由于該通路中SERCA-2a活性降低有關，導致肌漿網(wǎng)清除Ca2+功能降低，舒張期Ca2+增加，心肌松弛異常[34]?？偟膩碚f，cGMP增加和PKG激活導致細胞內游離鈣減少，導致血管平滑肌細胞松弛，這是該通路主要生理效應之一。

常麗萍[35]研究發(fā)現(xiàn)芪藶強心膠囊可以提高心梗后心衰大鼠主動脈組織中降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）、cGMP、eNOS蛋白表達，同時增強主動脈組織、mRNA表達水平，提示芪藶強心膠囊可以通過舒張血管而增強心肌供血，其擴展血管機制可能與eNOS-sGC-cGMP-PKG通路相關，證實了芪藶強心膠囊可以通過調控cGMP-PKG通路改善心臟/血管舒張功能。本研究亦證實，芪藶強心膠囊能降低HFpEF大鼠心臟指數(shù)，提高EF，降低室壁肥厚程度，縮短IVRT時間，提高E/A值，提示心室舒張功能明顯恢復；同時增加HFpEF血清中NO水平，提高eNOS表達量，增強內皮功能；可降低PDE5A對cGMP的水解作用增加心臟cGMP水平，同時增強PKG活性，這些過程改善了肌絲功能，降低了心肌細胞的被動僵硬度，從而改善了舒張功能。此外，芪藶強心膠囊還能降低該通路下游心肌肥厚相關因子和mRNA相對表達量增加，提示其能夠增強大鼠排鈉利尿和血管平滑肌松弛，改善心室重構的重要作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學構建“藥物-有效成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡，闡明了芪藶強心膠囊多組分-多靶點-多環(huán)節(jié)治療HFpEF的作用機制。通過體內實驗，發(fā)現(xiàn)芪藶強心膠囊可以多維度、全面的激活cGMP-PKG信號通路，增強內皮功能，改善心肌被動僵硬程度，增強Ca2+轉運功能，減輕心室重構，驗證了網(wǎng)絡藥理學的預測結果。這些數(shù)據(jù)對于闡明芪藶強心膠囊介導的舒張性心功能障礙改善的潛在機制有重要意義，并為HFpEF治療提供了有力佐證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Ponikowski P, Voors A A, Anker S D,. 2016 ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure of the European Society of Cardiology (ESC). Developed with the special contribution of the Heart Failure Association (HFA) of the ESC [J]., 2016, 18(8): 891-975.

[2] Groenewegen A, Rutten F H, Mosterd A,. Epidemiology of heart failure [J]., 2020, 22(8): 1342-1356.

[3] Lam C S, Donal E, Kraigher-Krainer E,. Epidemiology and clinical course of heart failure with preserved ejection fraction [J]., 2011, 13(1): 18-28.

[4] Brouwers F P, de Boer R A, van der Harst P,. Incidence and epidemiology of new onset heart failure with preserved vs. reduced ejection fraction in a community-based cohort: 11-year follow-up of PREVEND [J]., 2013, 34(19): 1424-1431.

[5] McMurray J J V, Adamopoulos S, Anker S D,. ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC [J]., 2012, 33(14): 1787-1847.

[6] Gheorghiade M, Marti C N, Sabbah H N,. Soluble guanylate cyclase: A potential therapeutic target for heart failure [J]., 2013, 18(2): 123-134.

[7] Rainer P P, Kass D A. Old dog, new tricks: Novel cardiac targets and stress regulation by protein kinase G [J]., 2016, 111(2): 154-162.

[8] Takimoto E. Cyclic GMP-dependent signaling in cardiac myocytes [J]., 2012, 76(8): 1819-1825.

[9] Armstrong P W, Pieske B, Anstrom K J,. Vericiguat in patients with heart failure and reduced ejection fraction [J]., 2020, 382(20): 1883-1893.

[10] Breitenstein S, Roessig L, Sandner P,. Novel sGC stimulators and sGC activators for the treatment of heart failure [J]., 2017, 243: 225-247.

[11] 吳以嶺, 谷春華, 徐貴成, 等. 芪藶強心膠囊治療慢性心力衰竭隨機雙盲、多中心臨床研究 [J]. 疑難病雜志, 2007, 6(5): 263-266.

[12] 朱青梅, 潘慧敏, 趙海霞, 等. 芪藶強心膠囊聯(lián)合沙庫巴曲纈沙坦治療慢性心力衰竭的系統(tǒng)評價[J]. 藥物評價研究, 2022, 45(1): 144-155.

[13] 田野, 李彥霞, 任君霞, 等. 芪藶強心膠囊治療舒張性心衰的療效觀察 [J]. 中國臨床藥理學雜志, 2011, 27(9): 666-668.

[14] 廖玉華, 楊杰孚, 張健, 等. 舒張性心力衰竭診斷和治療專家共識 [J]. 臨床心血管病雜志, 2020, 36(1): 1-10.

[15] 牛明, 張斯琴, 張博, 等.《網(wǎng)絡藥理學評價方法指南》解讀 [J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4119-4129.

[16] 康利平, 趙陽, 余河水, 等. 采用UPLC-Q-TOF/MSE鑒別芪藶強心膠囊有效部位中的化學成分 [J]. 藥學學報, 2011, 46(10): 1231-1236.

[17] Yun W J, Yao Z H, Fan C L,. Systematic screening and characterization of Qi-Li-Qiang-Xin Capsule-related xenobiotics in rats by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry [J]., 2018, 1090: 56-64.

[18] Breitenstein S, Roessig L, Sandner P,. Novel sGC stimulators and sGC activators for the treatment of heart failure [J]., 2017, 243: 225-247.

[19] Shah S J, Lam C S P, Svedlund S,. Prevalence and correlates of coronary microvascular dysfunction in heart failure with preserved ejection fraction: PROMIS-HFpEF [J]., 2018, 39(37): 3439-3450.

[20] Louren?o A P, Leite-Moreira A F, Balligand J L,. An integrative translational approach to study heart failure with preserved ejection fraction: A position paper from the Working Group on Myocardial Function of the European Society of Cardiology [J]., 2018, 20(2): 216-227.

[21] Chadderdon S M, Belcik J T, Bader L,. Proinflammatory endothelial activation detected by molecular imaging in obese nonhuman primates coincides with onset of insulin resistance and progressively increases with duration of insulin resistance [J]., 2014, 129(4): 471-478.

[22] 吳以嶺. 脈絡論 [M]. 北京: 中國科學技術出版社, 2010: 189-190.

[23] 王朝遠, 胡秀文. 芪藶強心膠囊聯(lián)合左西孟旦治療擴張型心肌病心力衰竭的臨床研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2020, 35(11): 2238-2242.

[24] 趙達, 趙振宇, 葉嘉豪, 等. 基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術探討芪藶強心膠囊治療慢性心力衰竭的作用機制 [J]. 湖南中醫(yī)藥大學學報, 2022, 42(6): 950-957.

[25] 朱慧明, 喬莉, 馮小龍, 等. 基于網(wǎng)絡藥理學探討芪藶強心膠囊治療充血性心力衰竭的作用機制 [J]. 世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2021, 23(11): 3986-3996.

[26] 李立鳳, 楊志華, 王居平, 等. 芪藶強心膠囊治療慢性充血性心力衰竭作用機制的網(wǎng)絡藥理學研究 [J]. 長治醫(yī)學院學報, 2021, 35(2): 89-94.

[27] 劉奕訓, 余河水, 康利平, 等. 芪藶強心膠囊活性部位中的組成成分研究 [J]. 中草藥, 2010, 41(7): 1060-1065.

[28] Cho J Y, Jeong M H, Ahn Y K,. Comparison of outcomes of patients with painless versus painful ST-segment elevation myocardial infarction undergoing percutaneous coronary intervention [J]., 2012, 109(3): 337-343.

[29] 代曉光, 蘇長蘭. 丹參化學成分及藥理研究進展 [J]. 中醫(yī)藥信息, 2018, 35(4): 126-129.

[30] 張慧娟, 龔蘇曉, 許浚, 等. 澤瀉藥材的研究進展及其質量標志物的預測分析[J]. 中草藥, 2019, 50(19): 4741-4751.

[31] Zhao C Y, Greenstein J L, Winslow R L. Roles of phosphodiesterases in the regulation of the cardiac cyclic nucleotide cross-talk signaling network [J]., 2016, 91: 215-227.

[32] Maurice D H, Wilson L S, Rampersad S N,. Cyclic nucleotide phosphodiesterases (PDEs): Coincidence detectors acting to spatially and temporally integrate cyclic nucleotide and non-cyclic nucleotide signals [J]., 2014, 42(2): 250-256.

[33] Das A, Durrant D, Salloum F N,. PDE5 inhibitors as therapeutics for heart disease, diabetes and cancer [J]., 2015, 147: 12-21.

[34] Lovelock J D, Monasky M M, Jeong E M,. Ranolazine improves cardiac diastolic dysfunction through modulation of myofilament calcium sensitivity [J]., 2012, 110(6): 841-850.

[35] 常麗萍. 芪藶強心膠囊治療慢性心力衰竭的作用機理及代謝組學研究 [D]. 石家莊: 河北醫(yī)科大學, 2017.

Mechanism of Qili Qiangxin Capsule in treatment of heart failure with preserved ejection fraction based on network pharmacology and experimental verification

HAO Jia-meng1, 2, CHANG Li-ping4, 5, WANG Lu3, 5, LIU Huan3, CHEN Meng3, 5, HOU Bin3, 4, ZHOU Lu-heng3, HOU Yun-long1, 2, 3

1. Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China 2. Key Research Office of State Administration of Traditional Chinese Medicine (Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases), Hebei Yiling Hospital, Shijiazhuang 050023, China 3. Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Ltd., Shijiazhuang 050023, China 4. State Key Laboratory of Collateral Disease Research and Innovative Chinese Medicine, Shijiazhuang 050023, China 5. Hebei Key Laboratory of Collateral Diseases, Shijiazhuang 050023, China

To explore the mechanism of Qiliqiangxin Capsule (芪藶強心膠囊, QLQX) in treatment of heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) based on network pharmacology and experimental verification.Forty-four clearly identified exogenous substances in QLQX were identified as active ingredients, and targets of compounds were predicted by Swisstarget prediction and Pharmmapper platforms, HFpEF disease targets were retrieved from OMIM, Disgenet and Gencard databases. Intersection targets were collected, String database and Cytoscape 3.7.2 software were uses to perform protein-protein interaction network analysis (PPI) and topology analysis. Metescape platform were used to perform gene ontology (GO) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis for common targets. A salt-sensitive HFpEF rat model with deoxycorticosterone acetate (DOCA) was constructed and given sacubitril-valsartan or QLQX for intervention. After eight weeks of administration, small animal ultrasound imaging system, ELISA, immunofluorescence, Western blotting, qRT-PCR methods were used for pharmacodynamic evaluation and cyclic guanosinc monophosphate (cGMP)-protein kinase G1 (PKG1) signaling pathway related target validation.Thirty-eight identical targets were screened out from active ingredients of QLQX and HFpEF; GO function and KEGG pathway enrichment analysis showed that they were involved in biological process (such as blood circulation, circulatory system, cardiac contraction), cellular components (such as membrane rafts, axons, cytoplasmic region) and molecular function (such as α-glucosidase activity, endopeptidase activity, hydrolase activity), involving cGMP-PKG signaling pathway, renin secretion, calcium signaling pathway.experiments confirmed that QLQX increased ejection fraction, reduced degree of ventricular wall hypertrophy, shortened isovolumic relaxation time (IVRT), and increased ratio of left ventricular diastolic filling velocity in HFpEF rats (< 0.05), increased nitric oxide (NO) and cGMP levels in serum (< 0.05), enhanced myocardial endothelial nitric oxide synthase (eNOS) fluorescence expression (< 0.05, 0.01), increased eNOS, PKG1, cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), soluble guanylate cyclase α (sGCα) protein expressions (< 0.05, 0.01), decreased cGMP-specific phosphodiesterase 5A (PDE5A) protein expression level (< 0.05), decreased B-type brain natriuretic peptide () and β-myosin heavy chain () mRNA expressions in myocardial tissue (< 0.05).QLQX can exert the therapeutic effect of HFpEF through component-multi-target-multi-link, and its mechanism is related to the regulation of cGMP-PKG signaling pathway.

network pharmacology; Qili Qiangxin Capsule; heart failure with preserved ejection fraction; endothelial function; choroid theory; cGMP-PKG1 pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)14 - 4365 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.016

2022-02-23

國家重點研發(fā)計劃“中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究”重點專項資助項目（2017YFC1700501）；河北省自然科學基金資助項目（H2019106059）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目（Z2022020）

郝佳夢（1992—），女，博士研究生，從事心血管病中西醫(yī)結合研究。E-mail: sweet_dreams0502@yeah.net

侯云龍，男，博士，教授，博士生導師，從事中藥藥理學研究。E-mail: houyunlonghrb@hotmail.com

[責任編輯 李亞楠]