孫夢(mèng)梅，王瑞生，張振凌, 3, 4，陳祎甜，李德華

基于指紋圖譜及化學(xué)計(jì)量學(xué)研究不同發(fā)酵程度建曲中成分變化

孫夢(mèng)梅1, 2，王瑞生1, 2*，張振凌1, 2, 3, 4*，陳祎甜5，李德華1, 2

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450008 2. 河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450008 3. 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450008 4. 河南省中藥飲片炮制中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450008 5. 焦作工貿(mào)職業(yè)學(xué)院，河南 焦作 454550

采用指紋圖譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法，探究不同發(fā)酵程度建曲中化學(xué)成分的差異性，篩選差異性標(biāo)志物，為規(guī)范建曲炮制工藝、建立飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。采用Waters SunFire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%乙酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，體積流量1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 μL，建立不同發(fā)酵時(shí)間建曲HPLC指紋圖譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2004A版）進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，標(biāo)定共有峰并進(jìn)行指認(rèn)及歸屬；以共有峰峰面積為指標(biāo)，利用層次聚類分析法（hierarchical cluster analysis，HCA）對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間建曲進(jìn)行區(qū)分，再借助正交偏最小二乘-判別分析法（orthogonal partial least square-discriminant analysis，OPLS-DA）篩選出不同發(fā)酵程度建曲間差異性標(biāo)志物；建立多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法，對(duì)多個(gè)差異性標(biāo)志物進(jìn)行定量分析。不同發(fā)酵時(shí)間建曲指紋圖譜相似度大于0.900，共標(biāo)定46個(gè)共有峰，指認(rèn)并歸屬21個(gè)成分；HCA結(jié)果顯示9個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間建曲可聚類為4個(gè)發(fā)酵階段；OPLS-DA結(jié)果表明不同發(fā)酵階段建曲間差異性標(biāo)志物略有不同，芹菜素、新橙皮苷、峰28、柚皮苷、橙皮苷和木犀草素為不同發(fā)酵程度建曲的主要差異性標(biāo)志物；對(duì)5個(gè)已知差異性標(biāo)志物進(jìn)行定量研究，發(fā)酵過(guò)程中，柚皮苷、新橙皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)，分別從0.048 5%、0.046 4%下降至0.014 8%、0.001 8%，芹菜素、木犀草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢(shì)，由0.007 8%、0.029 3%上升至0.019 8%、0.085 2%，橙皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.307 9%～0.341 6%波動(dòng)；以5個(gè)差異性標(biāo)志物含量為指標(biāo)，進(jìn)行熱圖聚類分析，結(jié)果與HCA結(jié)果一致。建立的方法可有效區(qū)分不同發(fā)酵時(shí)間建曲，為建曲的質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)提供參考。

建曲；發(fā)酵；指紋圖譜；化學(xué)計(jì)量學(xué)；質(zhì)量標(biāo)志物；層次聚類分析；正交偏最小二乘法；芹菜素；新橙皮苷；柚皮苷；橙皮苷；木犀草素

當(dāng)前說(shuō)的建曲多指四川產(chǎn)建曲，收錄于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》（第17冊(cè)）（下文簡(jiǎn)寫為《部頒標(biāo)準(zhǔn)》），由辣蓼、蒼耳草、青蒿及苦杏仁等23味中藥混合發(fā)酵而成，具有解表和中的功效[1]。建曲的原料藥味豐富，成分復(fù)雜，自然發(fā)酵過(guò)程不可控、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不完善已成為影響建曲質(zhì)量的關(guān)鍵因素[2]。

目前，建曲研究主要集中于質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)完善方面，有關(guān)建曲發(fā)酵機(jī)制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面的研究匱乏。建曲作為一味發(fā)酵類中藥，不同發(fā)酵程度建曲的物質(zhì)基礎(chǔ)不同，相應(yīng)的藥效品質(zhì)也存有差異，因此，有效區(qū)分不同發(fā)酵程度建曲是建曲質(zhì)量評(píng)價(jià)及控制的關(guān)鍵因素。對(duì)于發(fā)酵過(guò)程不易控制的傳統(tǒng)發(fā)酵類中藥，有必要結(jié)合現(xiàn)代技術(shù)，建立全面、有效的區(qū)分及評(píng)價(jià)方法，明確不同發(fā)酵程度成品間的差異，為發(fā)酵類中藥的質(zhì)量控制及臨床療效提供保證。

基于此，本實(shí)驗(yàn)擬建立不同發(fā)酵時(shí)間建曲HPLC指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間建曲進(jìn)行區(qū)分并篩選不同發(fā)酵階段建曲的差異性標(biāo)志物，并對(duì)多個(gè)差異性標(biāo)志物進(jìn)行定量分析，以便相對(duì)全面、客觀地對(duì)建曲發(fā)酵過(guò)程中化學(xué)成分的變化情況進(jìn)行初步探究[3]，為后續(xù)建曲發(fā)酵機(jī)制、質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用等研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BSA224S-CW型萬(wàn)分之一電子天平、BT25S型十萬(wàn)分之一電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9077A型電熱恒溫干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Waters2489UV/Visible型半自動(dòng)高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；UPT-II-10T型超純水器，成都現(xiàn)超純科技有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；DK-98-11型電熱恒溫水浴鍋，上海比朗儀器有限公司。

1.2 試劑

甲醇、無(wú)水乙醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)依次為20190522、20190115，分析純；甲醇、乙腈，美國(guó)Tedia公司，色譜純；磷酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純；冰醋酸、甲酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)依次為20181803、20190517，色譜純。對(duì)照品隱綠原酸、木犀草素、槲皮苷、咖啡酸、芹菜素、香草酸、阿魏酸、濱蒿內(nèi)酯、橙皮苷、廣藿香酮、厚樸酚、木香烴內(nèi)酯、和厚樸酚、歐前胡素、柚皮苷、東莨菪內(nèi)酯、新橙皮苷、α-香附酮，成都普思生物科技股份有限公司，批號(hào)依次為PS14011403、PS10320025、PS010791、PS010522、PS000755、PS010559、PS000097、PS020012、PS011588、PS000401、PS010353、PS012275、50-99-7、6363-53-7、PS011061、PS010561、PS012062、PS011029、PS010413、PS010757，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；對(duì)照品甘草酸，四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)150823，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%；對(duì)照品山柰素，成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)MVST-16041502，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%；對(duì)照品桂皮醛，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110710-201217，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.5%。

1.3 藥材

辣蓼（批號(hào)20190221）、蒼耳草（批號(hào)20181225），安國(guó)市光明飲片有限公司；青蒿、苦杏仁、赤小豆、麥芽、山楂（炒）、陳皮、廣藿香、蒼術(shù)、厚樸、川木香、白芷、檳榔、枳殼（麩炒）、紫蘇葉、薄荷、谷芽、肉桂、香附、甘草原料均購(gòu)自河南鄭州張仲景大藥房，由河南中醫(yī)藥大學(xué)張振凌教授鑒定，辣蓼為蓼科蓼屬植物辣蓼L.的干燥全草，蒼耳草為菊科蒼耳屬植物蒼耳Patrin ex Widder的干燥地上部分，青蒿為菊科蒿屬植物黃花蒿L(fēng).的干燥地上部分，苦杏仁為薔薇科杏屬植物杏L.的干燥成熟種子，赤小豆為豆科豇豆屬植物赤小豆(Thunb.) Ohwi et Ohashi的干燥成熟種子，麥芽為禾本科大麥屬植物大麥L.的成熟果實(shí)經(jīng)發(fā)芽干燥的炮制加工品，山楂為薔薇科山楂屬植物山楂Bge.的干燥成熟果實(shí)，陳皮為蕓香科柑橘屬植物橘Blanco的干燥成熟果皮，廣藿香為唇形科藿香屬植物廣藿香(Blanco) Benth.的干燥地上部分，蒼術(shù)為菊科蒼術(shù)屬植物北蒼術(shù)(DC.) Koidz.的干燥根莖，厚樸為木蘭科木蘭屬植物厚樸Rehd. et Wils.的干燥干皮及枝皮，川木香為菊科川木香屬植物川木香(Franch.) Ling的干燥根，白芷為傘形科當(dāng)歸屬植物白芷(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f.的干燥根，檳榔為棕櫚科檳榔屬植物檳榔L.的干燥成熟種子，枳殼為蕓香科柑橘屬植物酸橙L.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，紫蘇葉為唇形科紫蘇屬植物紫蘇(L.) Britt.的干燥葉，薄荷為唇形科薄荷屬植物薄荷Briq.的干燥地上部分，谷芽為禾本科狗尾草屬植物粟(L.) Beauv.的成熟果實(shí)經(jīng)發(fā)芽干燥的炮制加工品，肉桂為樟科樟屬植物肉桂Presl的干燥樹(shù)皮，香附為莎草科莎草屬植物莎草L.的干燥根莖，甘草為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖；麥麩、面粉為實(shí)驗(yàn)室留存。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

除麥麩、面粉外，將辣蓼、蒼耳草、青蒿等21味中藥飲片分別粉碎（過(guò)五號(hào)篩），按處方量稱取各中藥細(xì)粉，與麥麩混勻，再將面粉加適量蒸餾水加熱制成稀糊，趁熱與上述藥粉揉和均勻，以手捏成團(tuán)，擲之即散為宜，捏制成方塊[1]，置于30 ℃、75%濕度的恒溫恒濕發(fā)酵箱內(nèi)發(fā)酵[4]，從發(fā)酵0 h起，每12 h取樣1次，除取樣外，發(fā)酵箱門保持密閉。樣品于60 ℃烘干即得。結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。

2.2 色譜條件

色譜柱為Waters SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%乙酸水溶液，梯度洗脫：0～25 min，5%～12%乙腈；25～55 min，12%～25%乙腈；55～100 min，25%～60%乙腈；100～110 min，60%～80%乙腈；110～120 min，80%～5%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.3 供試品溶液制備

精密稱取各建曲樣品粉末2.0 g，置于150 mL錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻?yàn)V過(guò)，濾液于70 ℃水浴揮干，殘?jiān)蛹状既芙舛ㄈ葜?0 mL量瓶中，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜，即得供試品溶液。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間建曲外觀性狀

Table 1 Appearance characteristics of Jianqu fermented in different times

編號(hào)發(fā)酵時(shí)間/h外觀性狀 J10塊狀，棕褐色，軟硬適中 J212塊狀，棕褐色，無(wú)白霉 J324塊狀，棕褐色，無(wú)白霉 J436塊狀，棕褐色，有極少量白霉 J548塊狀，棕褐色，有少量白霉，酒香氣微 J660塊狀，遍布白霉，覆蓋整個(gè)表面，有酒香氣 J772塊狀，遍布白霉，泛黃，有少量黑色孢子，微有霉味 J884塊狀，遍布白霉，黑色孢子增多，有霉味 J996塊狀，遍布白霉，泛黑，黑色孢子覆蓋整個(gè)表面，有霉味

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間建曲外觀性狀差異

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一建曲供試品溶液10 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以38號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.06%～0.22%，相對(duì)峰面積的RSD為0.54%～4.32%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一建曲樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以38號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.08%～0.37%，相對(duì)峰面積的RSD為0.69%～3.47%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一建曲供試品溶液10 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。以38號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.04%～0.51%，相對(duì)峰面積的RSD為0.98%～3.81%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 不同發(fā)酵時(shí)間建曲指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

按“2.3”項(xiàng)下方法制備不同發(fā)酵時(shí)間建曲樣品的供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖（圖2）。將各色譜圖分別導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，以S1（J1-1樣品色譜圖）為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗為0.10 min，平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R，圖3），進(jìn)行多點(diǎn)校正及Mark峰匹配，并計(jì)算相似度，結(jié)果見(jiàn)表2。共標(biāo)定了46個(gè)共有峰，不同發(fā)酵時(shí)間建曲樣品指紋圖譜相似度均大于0.900，說(shuō)明利用指紋圖譜不能有效區(qū)分不同發(fā)酵時(shí)間建曲。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間建曲HPLC指紋圖譜疊加圖

4-香草酸 5-咖啡酸 9-隱綠原酸 11-東莨菪內(nèi)酯 13-阿魏酸 15-柚皮苷 16-槲皮苷 17-橙皮苷 18-新橙皮苷 19-濱蒿內(nèi)酯 23-木犀草素 26-桂皮醛 27-芹菜素 33-山柰素 34-歐前胡素 35-和厚樸酚 36-木香烴內(nèi)酯 37-廣藿香酮 38-厚樸酚 40-α-香附酮 43-甘草酸

表2 不同發(fā)酵時(shí)間建曲指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

Table 2 HPLC chromatograms similarity evaluation results of Jianqu fermented in different times

樣品相似度 J1J2J3J4J5J6J7J8J9R J11.0000.9970.9720.9790.9690.9500.9490.9560.9460.978 J20.9971.0000.9780.9880.9780.9600.9580.9660.9540.985 J30.9720.9781.0000.9840.9830.9920.9830.9770.9870.994 J40.9790.9880.9841.0000.9960.9830.9800.9850.9690.995 J50.9690.9780.9830.9961.0000.9890.9900.9920.9740.996 J60.9500.9600.9920.9830.9891.0000.9950.9880.9880.993 J70.9490.9580.9830.9800.9900.9951.0000.9940.9840.992 J80.9560.9660.9770.9850.9920.9880.9941.0000.9820.992 J90.9460.9540.9870.9690.9740.9880.9840.9821.0000.986 R0.9780.9850.9940.9950.9960.9930.9920.9920.9861.000

2.6 共有峰指認(rèn)及歸屬

精密稱取上述各對(duì)照品適量，用甲醇制成適宜濃度的對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄各對(duì)照品色譜圖。以色譜峰相對(duì)保留時(shí)間為參照，與不同發(fā)酵時(shí)間建曲指紋圖譜對(duì)比，指認(rèn)了21個(gè)共有峰，分別為峰4（香草酸）、5（咖啡酸）、9（隱綠原酸）、11（東莨菪內(nèi)酯）、13（阿魏酸）、15（柚皮苷）、16（槲皮苷）、17（橙皮苷）、18（新橙皮苷）、19（濱蒿內(nèi)酯）、23（木犀草素）、26（桂皮醛）、27（芹菜素）、33（山柰素）、34（歐前胡素）、35（和厚樸酚）、36（木香烴內(nèi)酯）、37（廣藿香酮）、38（厚樸酚）、40（α-香附酮）、43（甘草酸）。

按“2.3”項(xiàng)下方法制備各原料藥供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各單味藥色譜圖。以色譜峰相對(duì)保留時(shí)間為參照，對(duì)比不同發(fā)酵時(shí)間建曲指紋圖譜，對(duì)指認(rèn)出的21個(gè)成分進(jìn)行歸屬，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.7 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.7.1 層次聚類分析法（hierarchical cluster analysis，HCA） 將不同發(fā)酵時(shí)間建曲共有峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin Pro 2021b軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，選擇離差平方和法聚類，歐氏距離法測(cè)距，輸出垂直方向譜系圖，如圖4所示，不同發(fā)酵時(shí)間建曲可各自聚為一類，當(dāng)相似度為80%時(shí)，9個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間建曲被很好地分為4類，結(jié)合各類建曲發(fā)酵時(shí)間及外觀性狀，可分別定義為4個(gè)不同發(fā)酵程度建曲，發(fā)酵0 h及12 h為建曲發(fā)酵的初期階段，外觀性狀無(wú)明顯變化；發(fā)酵24 h及36 h為建曲發(fā)酵的未成熟階段，表面始有少量白霉；發(fā)酵48 h及60 h為建曲發(fā)酵的適度階段，逐漸達(dá)到“遍布白霉，有酒香氣”狀態(tài)，發(fā)酵72、84、96 h為建曲發(fā)酵的過(guò)度階段，白霉變黑，有霉味。

2.7.2 正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least square-discriminant analysis，OPLS-DA） 基于HCA結(jié)果，首先將4個(gè)發(fā)酵階段建曲共有峰面積數(shù)據(jù)一起導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，建立M1模型，以篩選不同發(fā)酵程度建曲間的差異性成分；然后將相鄰2個(gè)發(fā)酵階段建曲共有峰面積數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，建立模型M2、M3和M4，以篩選建曲發(fā)酵程度控制的關(guān)鍵指標(biāo)；由表4可知，4個(gè)OPLS-DA模型的2、2及2都接近于1，并進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)評(píng)價(jià)各模型，均沒(méi)有過(guò)擬合的現(xiàn)象，說(shuō)明4個(gè)模型都穩(wěn)定、有效、可行，具有良好的解釋及預(yù)測(cè)能力。在各模型得分圖中，不同發(fā)酵階段建曲分別位于兩側(cè)，說(shuō)明不同發(fā)酵階段建曲差異明顯，可被區(qū)分。由各模型VIP圖（圖5）可知，第1～4階段建曲主要差異性成分依次為芹菜素、新橙皮苷、峰28、柚皮苷、橙皮苷、厚樸酚、桂皮醛、濱蒿內(nèi)酯、峰31和木犀草素；第1與第2階段建曲主要差異性成分為芹菜素、柚皮苷、新橙皮苷、峰28、橙皮苷、濱蒿內(nèi)酯及木犀草素等；第2與第3階段建曲主要差異成分為芹菜素、峰28、新橙皮苷、桂皮醛、橙皮苷、柚皮苷及木犀草素等；第3與第4階段建曲主要差異性成分為厚樸酚、橙皮苷、峰31、濱蒿內(nèi)酯、芹菜素、新橙皮苷、峰28、阿魏酸及峰10等。

表3 建曲指紋圖譜成分歸屬

Table 3 Compositional attribution of Jianqu

峰號(hào)（成分）相對(duì)保留時(shí)間成分歸屬原藥材相對(duì)保留時(shí)間 峰4（香草酸）0.593廣藿香、紫蘇0.594、0.593 峰5（咖啡酸）0.618陳皮、厚樸、川木香、檳榔、官桂0.617、0.616、0.619、0.617、0.618 峰9（隱綠原酸）0.804辣蓼、青蒿、苦杏仁、官桂、甘草0.804、0.803、0.804、0.803、0.803 峰11（東莨菪內(nèi)酯）0.877青蒿、陳皮、厚樸、川木香、麩炒枳殼0.877、0.879、0.877、0.879、0.879 峰13（阿魏酸）0.913辣蓼、青蒿、陳皮、蒼術(shù)、川木香、檳榔0.913、0.912、0.915、0.914、0.913、0.913 峰15（柚皮苷）1.038辣蓼、青蒿、厚樸、麩炒枳殼、官桂1.039、1.039、1.038、1.039、1.040 峰16（槲皮苷）1.050辣蓼、青蒿、麥芽、廣藿香、薄荷、谷芽1.050、1.049、1.051、1.051、1.052、1.048 峰17（橙皮苷）1.059辣蓼、麥芽、炒山楂、陳皮、廣藿香、蒼術(shù)、麩炒枳殼、薄荷、甘草1.059、1.061、1.060、1.061、1.061、1.061、1.061、1.061、1.059 峰18（新橙皮苷）1.096陳皮、麩炒枳殼1.096、1.097 峰19（濱蒿內(nèi)酯）1.126青蒿、陳皮、麩炒枳殼1.125、1.128、1.127 峰23（木犀草素）1.325蒼耳草、白芷、麩炒枳殼、紫蘇、甘草1.326、1.324、1.327、1.326、1.325 峰26（桂皮醛）1.454辣蓼、青蒿、苦杏仁、炒山楂、廣藿香、厚樸、檳榔、紫蘇、薄荷、1.456、1.456、1.456、1.456、1.456、1.456、1.456、1.456、1.456、 官桂、香附1.456、1.456 峰27（芹菜素）1.466辣蓼、陳皮、廣藿香、麩炒枳殼、谷芽1.467、1.467、1.468、1.467、1.465 峰33（山柰素）1.782辣蓼、陳皮、蒼術(shù)、麩炒枳殼1.783、1.782、1.782、1.782 峰34（歐前胡素）1.937辣蓼、陳皮、白芷1.938、1.938、1.937 峰35（和厚樸酚）1.985辣蓼、厚樸1.986、1.985 峰36（木香烴內(nèi)酯）2.017青蒿、廣藿香、川木香2.018、2.018、2.017 峰37（廣藿香酮）2.073苦杏仁、炒山楂、陳皮、廣藿香、蒼術(shù)、厚樸、甘草2.073、2.073、2.073、2.073、2.073、2.073、2.073 峰38（厚樸酚）2.094廣藿香、厚樸、川木香2.094、2.093、2.094 峰40（α-香附酮）2.218辣蓼、蒼術(shù)2.219、2.218 峰43（甘草酸）2.258辣蓼、蒼術(shù)、谷芽、官桂、麥麩2.258、2.259、2.258、2.258、2.257

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間建曲樣品聚類樹(shù)狀圖

表4 OPLS-DA模型信息

Table 4 OPLS-DA model information

模型編號(hào)發(fā)酵階段R2XR2YQ2 M1第1至第4階段0.9760.9720.870 M2第1和第2階段0.8840.9960.984 M3第2和第3階段0.8440.9960.983 M4第3和第4階段0.8250.9280.860

圖5 OPLS-DA得分圖(a) 及VIP值(b)

2.8 差異性標(biāo)志物含量測(cè)定

2.8.1 色譜條件 色譜柱為Waters SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%乙酸水溶液，梯度洗脫：0～15 min，20%～25%乙腈；15～40 min，25%～55%乙腈；40～45 min，55%～20%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖6。

1-柚皮苷 2-橙皮苷 3-新橙皮苷 4-木犀草素 5-芹菜素

2.8.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木犀草素、芹菜素適量，加甲醇配制成單一對(duì)照品溶液，精密移取適量單一對(duì)照品溶液，配制成混合對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為90.4、568.5、64.8、33.3、88.2 μg/mL。

2.8.3 供試品溶液制備 精密稱取不同發(fā)酵時(shí)間樣品粉末1.0 g，參照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。

2.8.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.8.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，采用倍比稀釋法，制成系列對(duì)照品溶液，按“2.8.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得各成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)（）及線性范圍分別為柚皮苷＝1 777 120.590－6 902.098，2＝1.000，線性范圍0.011 3～0.723 2 μg；橙皮苷＝ 1 529 123.153－48 807.224，2＝1.000，線性范圍0.568 5～6.821 8 μg；新橙皮苷＝1 875 185.081－16 185.075，2＝0.999，線性范圍0.008 1～0.777 6 μg；木犀草素＝1 733 238.192－5 275.340，2＝1.000，線性范圍0.008 5～0.199 7 μg；芹菜素＝ 1 799 382.435－12 156.713，2＝1.000，線性范圍0.044 1～1.058 4 μg。

2.8.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.8.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.8.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木犀草素、芹菜素峰面積RSD分別為1.49%、1.98%、1.99%、0.55%、2.29%，表明儀器精密度良好。

2.8.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取J6樣品6份，按“2.8.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.8.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木犀草素、芹菜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD分別為0.64%、0.38%、1.21%、0.70%、0.30%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取J6樣品適量，按“2.8.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.8.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木犀草素、芹菜素峰面積RSD分別為1.18%、0.74%、1.19%、1.01%、0.83%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取J6樣品6份，每份0.5 g，加入混合對(duì)照品適量，按照“2.8.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.8.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木犀草素、芹菜素的平均加樣回收率分別為96.96%、103.68%、97.99%、97.33%、102.16%，RSD分別為1.42%、0.97%、1.91%、2.27%、1.04%。

2.8.9 樣品含量測(cè)定 取不同發(fā)酵時(shí)間建曲樣品，按“2.8.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.8.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表5。5種成分含量隨發(fā)酵過(guò)程的變化趨勢(shì)不同，柚皮苷及橙皮苷含量在0～48 h內(nèi)分別由0.048 5%、0.311 2%持續(xù)降低至0.014 8%、0.307 9%，48～96 h內(nèi)，含量又持續(xù)分別升高至0.017 1%、0.339 6%；新橙皮苷含量隨著發(fā)酵過(guò)程持續(xù)降低；木犀草素及芹菜素含量在0～72 h內(nèi)分別由0.007 8%、0.029 3%持續(xù)升高至0.019 8%、0.085 2%，72～96 h內(nèi)，又分別下降至0.015 8%、0.062 8%。各成分含量及變化趨勢(shì)存有差異，難以直觀評(píng)價(jià)，故將測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入微生信在線平臺(tái)，繪制聚類熱圖，見(jiàn)圖7。結(jié)果表明，以5個(gè)黃酮類差異性標(biāo)志物平均含量為指標(biāo)，仍可將不同發(fā)酵階段建曲區(qū)分為4個(gè)不同發(fā)酵階段建曲，分類結(jié)果與HCA結(jié)果一致。

表5 不同發(fā)酵時(shí)間建曲5種成分含量測(cè)定結(jié)果(, n = 3)

Table 5 Results of five components determination of Jianqu fermented in different times (,n = 3)

發(fā)酵時(shí)間/h質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 柚皮苷橙皮苷新橙皮苷木犀草素芹菜素 00.048 50.311 20.046 40.007 80.029 3 120.040 30.313 10.040 90.009 40.034 9 240.021 60.304 70.022 90.013 10.055 9 360.018 20.308 00.019 00.014 50.059 1 480.014 80.307 90.010 80.016 40.069 4 600.015 30.313 70.008 80.018 60.079 7 720.015 10.341 40.005 00.019 80.085 2 840.015 10.341 60.003 00.018 90.079 1 960.017 10.339 60.001 80.015 80.062 8

15、17、18、23及27為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木犀草素及芹菜素色譜峰編號(hào)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首次建立了不同發(fā)酵時(shí)間建曲的指紋圖譜，并首次指認(rèn)了建曲中的21個(gè)成分，又借助化學(xué)計(jì)量學(xué)分析篩選出了不同發(fā)酵時(shí)間建曲間的多個(gè)差異性標(biāo)志物，可作為區(qū)分不同發(fā)酵時(shí)間建曲的關(guān)鍵指標(biāo)，為建曲發(fā)酵工藝優(yōu)化及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為了確保建立的指紋圖譜可對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間建曲中的成分進(jìn)行較全面地分析，以色譜圖出峰多、峰形好、峰面積及分離度高為條件，分別對(duì)9種提取溶劑（水、甲醇、75%甲醇、50%甲醇、無(wú)水乙醇、95%乙醇、75%乙醇、55%乙醇、稀乙醇）、2種提取方式（超聲、回流）、4種檢測(cè)波長(zhǎng)（254、280、300、320 nm）、3種流動(dòng)相（乙腈- 0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙酸水溶液）及多種不同梯度洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化。為了更好地展示指紋圖譜各色譜峰，本實(shí)驗(yàn)僅展示了1個(gè)批次9個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間建曲的HPLC指紋圖譜，并對(duì)橙皮苷色譜峰進(jìn)行了截取。本實(shí)驗(yàn)參照建曲各原料藥所含主要成分選用對(duì)照品，對(duì)指紋圖譜共有峰進(jìn)行指認(rèn)，并嘗試用槲皮素、木犀草苷、川陳皮素等對(duì)峰14和峰28進(jìn)行比對(duì)分析，但均未能指認(rèn)出其所代表的成分，后期將采用成分分離及結(jié)構(gòu)鑒定等相關(guān)技術(shù)對(duì)2個(gè)成分進(jìn)一步研究。

不同發(fā)酵時(shí)間建曲指紋圖譜相似度均大于0.900，不能根據(jù)指紋圖譜相似度對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間建曲進(jìn)行區(qū)分。因此，本實(shí)驗(yàn)首先引入無(wú)監(jiān)督模式的HCA，將不同發(fā)酵時(shí)間建曲很好地劃分為4類，又借助有監(jiān)督模式的OPLS-DA對(duì)相鄰發(fā)酵程度建曲間的差異性成分分別進(jìn)行篩選，重復(fù)出現(xiàn)的差異性成分主要為芹菜素、新橙皮苷、橙皮苷、峰28、柚皮苷和木犀草素。芹菜素主要來(lái)源于辣蓼，具有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用[5]；柚皮苷和新橙皮苷主要來(lái)源于枳殼，是枳殼中含量最高的2個(gè)黃酮類物質(zhì)，分別具有調(diào)血脂[6]、保肝[7]、抗抑郁[8]和調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)[9]的藥理作用；橙皮苷主要來(lái)源于陳皮、枳殼、薄荷等，具有抗氧化、抗炎、促胃動(dòng)力等作用[10]；木犀草素主要來(lái)源于枳殼和紫蘇，具有抗炎、抗氧化等活性[11]。因此，對(duì)芹菜素、新橙皮苷、橙皮苷、柚皮苷和木犀草素進(jìn)行定量分析，分析結(jié)果與HCA結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了選擇5種黃酮類成分作為差異性標(biāo)志物的合理性。其中辣蓼、麩炒枳殼和陳皮等原料藥可能是建曲質(zhì)量控制的關(guān)鍵。

在建曲發(fā)酵前期及中期，木犀草素和芹菜素含量均逐漸升高，可能與發(fā)酵前期植物本身存在的纖維素酶及微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程產(chǎn)生的纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和果膠酶等具有降解植物細(xì)胞壁，促進(jìn)活性成分的溶出有關(guān)[12]；發(fā)酵后期，二者含量又呈下降趨勢(shì)，可能與發(fā)酵后期微生物生長(zhǎng)環(huán)境改變，相關(guān)微生物活性降低有關(guān)。發(fā)酵0～48 h，柚皮苷、橙皮苷含量先降低，可能是部分微生物在發(fā)酵環(huán)境下產(chǎn)生降解柚皮苷和橙皮苷的酶，使兩者成分進(jìn)行分解生成代謝產(chǎn)物以供微生物自身生長(zhǎng)需求。有研究表明，菌株可以將柚皮苷去糖基化生成柚皮素，轉(zhuǎn)化高達(dá)96%[13]；黑曲霉菌種轉(zhuǎn)化產(chǎn)生橙皮苷酶及柚苷酶的能力較強(qiáng)，能夠轉(zhuǎn)化橙皮苷產(chǎn)生橙皮素和橙皮素-7--葡萄糖苷[14]，可極大提升其生物利用度，更易于體內(nèi)吸收[15]。而發(fā)酵48～96 h，柚皮苷、橙皮苷含量再次升高，可能是部分微生物對(duì)2種成分的降解達(dá)到飽和，柚皮苷和橙皮苷的含量在這一階段進(jìn)行富集，因此表現(xiàn)為含量增加[16]。但有關(guān)建曲發(fā)酵過(guò)程中，微生物的種群、生長(zhǎng)代謝特性及其對(duì)建曲物質(zhì)基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)化機(jī)理均不明確[17]，仍有待進(jìn)一步深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十七冊(cè)[S]. 1998: 142.

[2] 李翠萍. 川產(chǎn)建曲的質(zhì)變因素與解決措施 [J]. 中國(guó)西部科技, 2005, 4(21): 8.

[3] 鄭艷萍, 朱紅軍, 秦昆明, 等. 川產(chǎn)建曲中5種成分含量的測(cè)定及HPLC指紋圖譜的初步建立 [J]. 中藥材, 2018, 41(5): 1138-1141.

[4] 胥敏, 劉玉杰, 解達(dá)帥, 等. 建曲發(fā)酵過(guò)程的最佳“火候” [J]. 中成藥, 2017, 39(1): 136-142.

[5] 盧慧穎, 王天陽(yáng), 王浩澤, 等. 芹菜素聯(lián)合其它藥物在疾病治療中藥理作用及機(jī)制的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)藥房, 2021, 32(4): 502-507.

[6] 楊新榮, 竇霞, 李國(guó)峰, 等. 柚皮苷藥理作用及機(jī)制的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2022, 53(10): 3226-3240.

[7] Akamo A J, Rotimi S O, Akinloye D I,. Naringin prevents cyclophosphamide-induced hepatotoxicity in rats by attenuating oxidative stress, fibrosis, and inflammation [J]., 2021, 153: 112266.

[8] Zhang X H, Han L R, Liu J,. Pharmacokinetic study of 7 compounds following oral administration ofto depressive rats [J]., 2018, 9: 131.

[9] Wang Y K, Zhou Z M, Dai M Y,. Discovery and validation of quality markers ofagainst acetylcholinesterase using metabolomics and bioactivity assays [J]., 2021, 44(11): 2189-2205.

[10] 董自亮, 李紅亮, 原歡歡, 等. UPLC測(cè)定經(jīng)典名方金水六君煎中11種成分 [J]. 中草藥, 2021, 52(3): 711-717.

[11] 韓寧馨, 孫雅麗, 盛帥, 等. 木犀草素對(duì)氧化應(yīng)激和炎癥的調(diào)控機(jī)制 [J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2022, 34(5): 2856-2861.

[12] 江曙, 劉培, 段金廒, 等. 基于微生物轉(zhuǎn)化的中藥廢棄物利用價(jià)值提升策略探討 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2014, 16(6): 1210-1216.

[13] 鄧媛, 毛勇, 王燕, 等. 黑曲霉TC-01產(chǎn)柚苷酶對(duì)柚皮苷酶解作用的研究 [J]. 中國(guó)食品添加劑, 2012(3): 108-111.

[14] 申麗靜, 汪釗, 章銀軍, 等. 橙皮苷酶高產(chǎn)菌株的選育及其酶學(xué)性質(zhì)的研究 [J]. 食品研究與開(kāi)發(fā), 2014, 35(5): 109-112.

[15] 張風(fēng)亭, 胡坦, 潘思軼. 橙皮苷生物學(xué)活性及其改性技術(shù)的研究進(jìn)展 [J]. 食品工業(yè)科技, 2022, 43(10): 442-449.

[16] 劉麗娜. 基于微生物代謝對(duì)陳皮陳化活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究[D]. 湛江: 廣東海洋大學(xué), 2019.

[17] 張歡, 高勝美, 王躍飛, 等. 中藥“曲劑”發(fā)酵的物質(zhì)和功能變化及機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2021, 52(8): 2473-2479.

Study on changes of components in Jianqu with different degrees of fermentation based on fingerprint and chemometrics

SUN Meng-mei1, 2, WANG Rui-sheng1, 2, ZHANG Zhen-ling1, 2, 3, 4, CHENYi-tian5, LI De-hua1, 2

1. College of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China 2. Henan Research Center for Special Processing Technology of Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China 3. Co-construction Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine and Respiratory Diseases by Henan & Education Ministry, Zhengzhou 450008, China 4. Henan Provincial Key Laboratory of TCM Decoction Processing, Zhengzhou 450008, China 5. Jiaozuo industry and Trade Vocational College, Jiaozuo 454550, China

Fingerprint technology combined with chemometrics analysis method was used to study the changes of chemical components and screen the differential markers in Jianqu with different degrees of fermentation, so as to lay a foundation for standardizing processing technology and establishing the quality standard of Jianqu.The fingerprint of jianqu fermented in different times was established by a Waters SunFire C18column（250 mm×4.6 mm, 5 μm）by gradient elution, and the mobile phase consisted of acetonitrile and 0.1% acetic acid solution, the flow rate was 1.0 mL/min, the wavelength was 280 nm and the column temperature was 30 ℃. Similarity evaluation was carried out using the raditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation system (2004A version), the common peaks identification and attribution were carried out. The common peaks area was used as indicators, and hierarchical cluster analysis (HCA) was used to distinguish Jianqu fermented in different times, and then orthogonal partial least square discriminant analysis (OPLS-DA) was used to screen the differential markers in Jianqu fermentation. The content of differential markers was determined by HPLC.The similarity of fingerprint of Jianqu fermented in different times was greater than 0.900, 46 common peaks were calibrated, and 21 components were identified and attributed; HCA clustered Jianqu fermented in nine different times into Jianqu fermented in four different stages. The results of OPLS-DA showed that there were slight differences in the differential markers between Jianqu fermented in different stages; Apigenin, neohesperidin, peak 28, naringin, hesperidin and luteolin were the main differential markers in Jianqu with different degrees of fermentation; The contents of 5 differential markers were determined, and the contents of naringin and neohesperidin showed a decreasing trend from 0.048 5% and 0.046 4% to 0.014 8% and 0.001 8%, respectively; the contents of apigenin and luteolin increased from 0.007 8% and 0.029 3% to 0.019 8% and 0.085 2%, respectively; The content of hesperidin fluctuated between 0.307 9% and 0.341 6%. The content of five differential markers was used as indicators to conduct heat map cluster analysis which can also effectively distinguish Jianqu fermented in different times.The method established in this study can effectively distinguish Jianqu fermented in different times and provide reference for quality control and evaluation of Jianqu.

Jianqu; fermentation; fingerprint; chemometrics analysis; quality marker; hierarchical cluster analysis; orthogonal partial least squares; apigenin; neohesperidin; naringin; hesperidin; luteolin

R283.6

A

0253 - 2670(2022)14 - 4340 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.014

2022-01-24

中藥建曲發(fā)酵工藝優(yōu)化及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究（22B360004）；河南中醫(yī)藥大學(xué)博士基金項(xiàng)目（RSBSJJ2019-09）

孫夢(mèng)梅，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幣谥萍夹g(shù)研究。E-mail: mengmei9856@163.com

張振凌，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)橹兴幣谥茩C(jī)制及飲片標(biāo)準(zhǔn)化研究。Tel: (0371)65680970 E-mail: zhangzl6758@163.com

王瑞生，講師，主要研究方向?yàn)橹兴幣谥茩C(jī)制及飲片標(biāo)準(zhǔn)化研究。Tel: (0371)65676656 E-mail: wrsh900226@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]