李君霞，曹亞蕊，王金濤，方曉東

延胡索乙素磷脂復(fù)合物及其固體分散體、油制劑、納米混懸劑的制備及藥動學(xué)研究

李君霞1，曹亞蕊1，王金濤2*，方曉東3

1. 河南省胸科醫(yī)院，河南 鄭州 450000 2. 鄭州大學(xué)材料學(xué)院，河南 鄭州 450000 3. 河南大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 475001

制備延胡索乙素磷脂復(fù)合物（tetrahydropalmatine phospholipids complex，THP-PC）、延胡索乙素磷脂復(fù)合物固體分散體（THP-PC solid dispersion，THP-PC-SD）、延胡索乙素磷脂復(fù)合物油制劑（THP-PC oil preparation，THP-PC-OP）和延胡索乙素磷脂復(fù)合物納米混懸劑（THP-PC nanosuspensions，THP-PC-NPs），并分別比較其在SD大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)行為。溶劑揮發(fā)法分別制備THP-PC和THP-PC-SD，采用X射線粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRPD）技術(shù)分析THP的存在狀態(tài)。高壓均質(zhì)法制備THP-PC-NPs，測定粒徑及ζ電位。以THP混懸液為參考，分別比較THP-PC、THP-PC-SD和THP-PC-NPs體外溶出情況。SD大鼠分別ig給予THP、THP-PC、THP-PC-SD、THP-PC-OP和THP-PC-NPs，HPLC法測定THP血藥濃度，計算主要藥動學(xué)參數(shù)。THP在THP-PC、THP-PC-SD中均以無定型狀態(tài)存在。THP-PC-NPs平均粒徑為（184.57±10.41）nm，ζ電位為（?31.26±1.93）mV。THP-PC、THP-PC-SD和THP-PC-NPs均在不同程度上提高了THP的溶出度。與THP-PC相比，THP-PC相對生物利用度提高至1.70倍，而THP-PC-SD、THP-PC-NPs和THP-PC-OP的相對生物利用度分別進一步提高至4.11、4.86、4.22倍。THP-PC-SD、THP-PC-NPs和THP-PC-OP均可進一步提高THP-PC的生物利用度。

延胡索乙素；磷脂復(fù)合物；固體分散體；油制劑；納米混懸劑；溶出度；生物利用度；藥動學(xué)；溶劑揮發(fā)法；X射線粉末衍射；高壓均質(zhì)法

延胡索乙素（tetrahydropalmatine，THP）是一種生物堿，又稱四氫巴馬汀，主要從罌粟科紫堇屬植物延胡索W. T. Wang的干燥塊莖中提取得到[1-2]，在我國有近千年的入藥歷史。研究顯示，THP具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗心肌缺血、抗腫瘤、抗血栓、抑制胃酸分泌、抗心律失常、心肌缺血/壞死保護等藥理活性[2-4]，研究開發(fā)價值較高。但THP水溶性較差[5-6]，溶出度低，體內(nèi)易被代謝[7]，口服吸收生物利用度僅為6.59%[8]，勢必影響THP藥效發(fā)揮及其臨床應(yīng)用。THP新制劑研究有自微乳[6]、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體[9]、脂質(zhì)體[10]等制劑新技術(shù)的報道。

磷脂復(fù)合物（phospholipids complex，PC）是難溶性藥物與磷脂在非質(zhì)子溶劑中通過某種作用力（如氫鍵、范德華力等）結(jié)合在一起而形成的一種復(fù)合物。該復(fù)合物繼承了磷脂的親水親油特點，使藥物的水溶性和脂溶性均可達到提高[11-15]，為促進吸收奠定基礎(chǔ)。但磷脂復(fù)合物是一種黏性物質(zhì)，體外溶出較慢，影響生物利用度提升幅度[16-18]。固體分散體（solid dispersion，SD）和油制劑（oil preparation，OP）在常規(guī)制劑中制備工藝相對簡單可靠，故本研究將延胡索乙素磷脂復(fù)合物（THP-PC）進一步制備成延胡索乙素磷脂復(fù)合物固體分散體（THP-PC- SD）[19-20]和延胡索乙素磷脂復(fù)合物油制劑（THP- PC-OP）。納米混懸劑（nanosuspensions，NPs）在納米制劑中載藥量較高，工藝相對簡單，所以本研究進一步將THP-PC制備成延胡索乙素磷脂復(fù)合物納米混懸劑（THP-PC-NPs）[21-22]，并比較其體外溶出情況及體內(nèi)口服藥動學(xué)行為，為THP新制劑研發(fā)提供新策略。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相儀器，配置DAD檢測器，溫控進樣盤，美國安捷倫公司；BP-210D型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；D8型X射線粉末衍射儀，瑞士布魯克公司；R2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，艾卡儀器設(shè)備公司；DZF-6020型臺式真空干燥箱，鄭州生化儀器有限公司；MS-1型磁力攪拌器，上海尚普儀器公司；GJB300型均質(zhì)機，常州均質(zhì)機械設(shè)備公司；Nano ZS90型納米粒度儀，英國Malvern公司；RC-6D型溶出儀，天津創(chuàng)興電子設(shè)備制造公司；HX-10-50D型凍干機，上海滬析冷凍干燥機設(shè)備公司；SZ-24氮氣吹掃儀，上海舜制儀器公司。

1.2 材料

THP原料藥，批號20180915，質(zhì)量分數(shù)97.6%，西安瑞盈生物科技有限公司；THP對照品，批號110726-201812，質(zhì)量分數(shù)99.8%，中國食品藥品檢定研究院；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP K30），批號201748T234，德國BASF公司；白屈菜紅堿對照品，批號MUST-18252556，質(zhì)量分數(shù)98.7%，成都曼斯特生物科技有限公司；大豆磷脂，型號PC98T，批號20191125，上海輔必成生物科技公司；四氫呋喃，色譜純，批號59162526，Merck公司。

SD大鼠，清潔級，購自河南省動物實驗中心，許可證編號：SCXK-2016-0001，實驗室飼養(yǎng)至體質(zhì)量為（220±20）g，進行藥動學(xué)實驗前禁食12 h，自由飲水。所有動物實驗遵循河南省胸科醫(yī)院有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測定THP含量

2.1.1 對照品溶液的制備 稱取THP對照品20 mg置于50 mL量瓶中，加入甲醇超聲溶解并定容，即得THP對照品儲備液（400 μg/mL）。

2.1.2 供試品溶液的制備 取THP、THP-PC、THP- PC-SD、THP-PC-OP及THP-PC-NPs粉末適量（THP含有量均約為5 mg），置于100 mL量瓶中，加入50 mL甲醇超聲溶解，放置至室溫后甲醇定容，過0.45 μm微孔濾膜，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，流動相定容即得供試品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為Waters-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃；流動相為甲醇-0.3%醋酸水溶液（45∶55）；檢測波長為281 nm；體積流量為1.0 mL/min；進樣量10 μL。取磷脂、PVP K30等輔料制備空白輔料樣品，另取THP-PC、THP-PC-SD、THP-PC-OP及THP-PC-NPs進樣，色譜圖見圖1，制劑中輔料不干擾THP含量測定，理論塔板數(shù)不低于6500。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取THP對照品適量，采用流動相配制成20、10、1、0.5、0.1、0.05 μg/mL的THP對照品溶液，分別進樣。以THP質(zhì)量濃度（）與峰面積（）作線性回歸得方程＝24.155 2－0.746 9，＝0.999 7，結(jié)果表明THP在0.05～20 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度考察 取各樣品的供試品溶液，分別連續(xù)進樣6次，計算THP峰面積的RSD。結(jié)果顯示，THP-PC、THP-PC-SD、THP-PC-OP、THP-PC- NPs中的THP峰面積的RSD分別為0.46%、0.92%、0.73%、0.58%，所以精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 取各樣品的供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、18、24 h進樣，HPLC測定。結(jié)果顯示，THP-PC、THP-PC-SD、THP-PC-OP、THP-PC-NPs中的THP峰面積的RSD分別為1.43%、0.90%、1.13%、1.29%，結(jié)果表明各供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性考察 取各個樣品，分別平行制備6份供試品溶液，HPLC測定。結(jié)果顯示，THP-PC、THP-PC-SD、THP-PC-OP、THP-PC-NPs中的THP峰面積的RSD分別為1.15%、1.39%、1.64%、1.87%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率考察 取各個樣品適量（THP含有量均約為2.5 mg），分別置于9個100 mL量瓶中，分為低、中、高3組，加入樣品中THP含量50%、100%、150%的THP對照品溶液，加入50 mL甲醇超聲溶解，過0.45 μm微孔濾膜，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，流動相定容。THP-PC、THP-PC- SD、THP-PC-OP及THP-PC-NPs同法操作，分別進樣測定THP含量并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，THP- PC、THP-PC-SD、THP-PC-OP、THP-PC-NPs的平均回收率在分別為99.04%、99.97%、100.89%、101.53%，RSD分別為1.74%、0.85%、1.18%、1.60%，結(jié)果表明本實驗回收率較高。

2.2 復(fù)合率的測定

取70 mg的THP和適量磷脂置于三角燒瓶中，加入四氫呋喃40 mL的混懸液，于一定溫度的水浴中磁力攪拌一定時間至澄清。45 ℃減壓旋蒸10 min除去有機溶劑，即得THP-PC，該復(fù)合物為褐黃色黏稠狀物質(zhì)。THP不溶于石油醚，但THP-PC在石油醚中易溶。稱取THP（0）制備THP-PC，加入石油醚超聲20 s溶解，過0.22 μm的微孔濾膜除去游離的THP，減壓旋蒸除去石油醚，加入甲醇超聲20 s溶解，進樣測定參加復(fù)合的THP的量（1）。計算THP與磷脂的復(fù)合率。

復(fù)合率＝1/0

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化THP-PC處方工藝

2.3.1 試驗設(shè)計及結(jié)果 采用THP與磷脂的復(fù)合率（）作為THP-PC的優(yōu)化指標。前期單因素考察結(jié)果顯示，當固定THP用量為70 mg時，磷脂用量（1）、制備溫度（2）和制備時間（3）對THP-PC的復(fù)合率影響較大，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對磷脂用量范圍為100～200 mg，制備溫度為25～65 ℃，制備時間為3～6 h進行優(yōu)化，各因素水平見表1。根據(jù)不同試驗組合制備不同處方工藝下的THP-PC，并分別測定復(fù)合率，結(jié)果見表1。

2.3.2 二次多元回歸模型的建立及顯著性分析 對Box-Behnken響應(yīng)面法的因變量（1、2、3）和自變量（）的數(shù)據(jù)擬合，得包封率二次多元回歸方程為＝98.18＋8.081＋11.042－1.193＋2.1312－1.4813－0.3523－9.3712－16.3922－0.0932，模型值＜0.000 1，決定系數(shù)2＝0.999 4，校正系數(shù)adj2＝0.998 7，失擬度＝ 0.205 8＞0.05，說明測得的復(fù)合率與擬合值吻合度高，未知因素對模型干擾很小，因此建立的數(shù)學(xué)模型可信度較高，可用于THP-PC處方工藝研究。方程中1、2系數(shù)絕對值相對較大，影響程度明顯高于3。方差分析結(jié)果見表2，1、2、3、12、13、12和22等均具極顯著差異（＜0.01）。

2.3.3 效應(yīng)面結(jié)果、預(yù)測及驗證 三維曲面圖見圖2，當制備時間不變時，隨著制備溫度的延長或磷脂用量的增大，復(fù)合率均先增大后下降；固定制備溫度不變時，隨著磷脂用量的增加復(fù)合率先增加后略下降，其影響程度遠大于制備時間對復(fù)合率的影響；固定磷脂用量不變時，隨著制備溫度的增加復(fù)合率先增加后下降，其影響程度同樣遠大于制備時間對復(fù)合率的影響。設(shè)置復(fù)合率最小值為55.9%，最大值為100%，得最佳處方工藝為磷脂用量1＝160.09 mg，制備溫度2＝48.47 ℃，攪拌時間3＝3.57 h，預(yù)測復(fù)合率為101.85%。為便于操作，THP-PC最佳處方調(diào)整為1＝160 mg，2＝48.5 ℃，3＝3.5 h。按此處方工藝，平行制備3份THP-PC，測得復(fù)合率分別為99.52%、99.71%和99.38%，復(fù)合率基本接近100%。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平及結(jié)果(n = 3)

Table 1 Factor levels and results for Box-Behnken experimental design(n = 3)

試驗號X1/mgX2/℃X3/hY/%試驗號X1/mgX2/℃X3/hY/%試驗號X1/mgX2/℃X3/hY/% 1150 (0)45 (0)4.5 (0)98.77150454.598.213200654.593.2 215025 (?1)3 (?1)71.3815065394.314200254.567.1 3150256 (+1)69.8910045380.11515065691.4 4100 (?1)65 (+1)4.573.510150454.597.916150454.597.7 5200 (+1)45694.41110045680.517150454.598.4 620045399.912100254.555.9

表2 方差分析

Table 2 Analysis variance

來源平方和自由度均方F值P值來源平方和自由度均方F值P值 模型3 117.339346.371 369.44＜0.000 1X12369.281369.281 460.00＜0.000 1 X1521.641521.642 062.42＜0.000 1X22131.081131.084 471.94＜0.000 1 X2974.611974.613 853.31＜0.000 1X320.03410.0340.130.724 3 X311.28111.2844.600.000 3殘差1.7770.25 X1X218.06118.0671.41＜0.000 1失擬項1.1430.382.430.205 8 X1X38.7018.7034.410.000 6純偏差0.6340.16 X2X30.4910.491.940.206 6總離差3 119.1016

2.4 HTP-PC晶型分析

X射線粉末衍射法（XRPD）對THP-PC進行晶型分析。速度為8°/min，掃描范圍（2）為3°～45°，Cu-Kα靶。取THP原料藥、磷脂、THP-PC及物理混合物（比例THP-PC，僅作簡單混合）適量置于玻璃槽中，玻璃片壓制平整，置于X射線粉末衍射儀進行掃描，見圖3。THP在6.3°、7.4°、10.9°、11.5°、12.1°、16.9°、18.0°、18.7°、20.2°、20.9°、24.1°、25.3°、29.7°及42.7°等處出現(xiàn)眾多特征晶型峰，是一種晶型物質(zhì)。在物理混合物中仍見THP的特征晶型峰，強度有所下降，但各峰的位置未發(fā)生任何變化，說明簡單混合未改變THP的存在狀態(tài)。但在THP-PC的XRPD圖譜中，未見THP的晶型峰，說明存在形式發(fā)生了改變，轉(zhuǎn)變成無定型物質(zhì)，證明了THP-PC制備成功。

圖3 THP-PC的XRPD結(jié)果

2.5 表觀油水分配系數(shù)（P）的測定

分別配制pH 1.0、pH 2.5、pH 3.6、pH 4.5、pH 5.8、pH 6.8、pH 7.4、pH 8.0的水相溶液，加入正辛醇進行飽和。分別取過量THP、物理混合物（比例同THP-PC）和THP-PC加入到飽和后的不同pH值的水溶液中，于37 ℃振蕩器中震蕩3 d，取上層混懸液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液進樣測定濃度1。精密量取1 mL置于玻璃離心管中，平行8份，分別加入經(jīng)不同pH值的水溶液飽和過的正辛醇5 mL，于37 ℃振蕩器中震蕩3 d。取下層水相過0.45 μm微孔濾膜，測得濃度2。計算，＝ (1－2)/2，并計算lg。結(jié)果見圖4。THP在不同pH值中的lg變化較大，在酸性條件下水溶性較大，但在堿性條件下脂溶性較強，水溶性或脂溶性過大均不利于藥物透膜吸收[12]。制備成THP-PC后有效調(diào)節(jié)了THP的表觀油水分配系數(shù)，利于藥物胃腸道吸收。而物理混合物對THP油水分配系數(shù)有一定影響，但無顯著性意義。

圖4 表觀油水分配系數(shù)結(jié)果(n = 3)

2.6 THP-PC-SD的制備及表征

磷脂復(fù)合物熱穩(wěn)定性不好，因此，不適合采用熔融法制備成固體分散體，故采用溶劑法將THP-PC制備成THP-PC-SD。按照質(zhì)量比1∶6，分別取THP-PC和PVP K30，置于無水乙醇中，45 ℃條件下磁力攪拌3 h至溶液澄清，45 ℃下減壓旋蒸除去有機溶劑，即得THP-PC-SD粉末。

2.6.1 晶型分析 取適量THP、PVP K30、物理混合物（THP、磷脂和PVP K30比例同THP-PC-SD，僅作簡單混合）和THP-PC-SD，按照“2.4”項下條件進行XRPD掃描，結(jié)果見圖5，在物理混合物中仍可見THP原料藥在10.9°、11.5°、12.1°、16.9°、18.0°、20.2°、20.9°、24.1°、25.3°、29.7°及42.7°等處衍射峰，雖其強度下降，但各峰的位置并未發(fā)生變化，可能是由于處方中PVP K30用量較大，對衍射峰起到了掩蔽作用所致[15]。但在THP-PC-SD中THP的衍射峰全部消失，說明將THP-PC制備成THP-PC-SD后，THP仍是以無定形狀態(tài)存在，同時也證明THP-PC-SD制備成功。

圖5 THP-PC-SD的XRPD結(jié)果

2.6.2 SEM分析 THP、物理混合物（THP、磷脂和PVP K30比例同THP-PC-SD，僅作簡單混合）和THP-PC-SD適量，加入無水乙醇進行分散，取2～3 d至導(dǎo)電膠上，烘干后噴金2 min，置于SEM下觀察，結(jié)果見圖6。THP原料藥為柱狀形態(tài)，在物理混合物中可觀察到原料藥附著在輔料上，存在狀態(tài)并未發(fā)生改變。但在THP-PC-SD中原料藥的柱狀形態(tài)消失，說明其存在狀態(tài)發(fā)生變化，與XRPD研究結(jié)果一致。

圖6 THP (A)、物理混合物(B)和THP-PC-SD (C) 的SEM圖

2.7 THP-PC-NPs及其凍干粉的制備及表征

2.7.1 THP-PC-NPs及其凍干粉的制備 高壓均質(zhì)法制備THP-PC-NPs。取80 mg的PVP K30溶解于100 mL蒸餾水中（溫度為45 ℃），另取40 mg的THP-PC超聲分散于3 mL無水乙醇，水相與有機相合并后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)10 min（溫度為45 ℃）?；鞈乙河诰|(zhì)壓力為40 MPa條件下循環(huán)均質(zhì)5次，于80 MPa條件下循環(huán)均質(zhì)8次，繼續(xù)于100 MPa條件下循環(huán)均質(zhì)8次，即得THP-PC-NPs混懸液。加入5%甘露醇，混勻，分成若干份，于?40 ℃超低溫冰箱預(yù)凍1 d，迅速置于冷凍干燥機中進行凍干，即得THP-PC-NPs凍干粉。

2.7.2 粒徑和ζ電位的測定 取適量THP-PC-NPs混懸液，蒸餾水稀釋50倍，置于粒度儀中測得其ζ電位為（?31.26±1.93）mV，見圖7；平均粒徑為（184.57±10.41）nm，見圖8。取適量THP-PC-NPs凍干粉蒸餾水復(fù)溶，測得平均粒徑增長至（242.90±15.63）nm，ζ電位為（?28.05±1.69）mV。

圖7 THP-PC-NPs的ζ電位

圖8 THP-PC-NPs粒徑分布

2.7.3 SEM觀察 取THP-PC-NPs混懸液100 μL，加入蒸餾水3 mL混勻，取2～3 d滴加至導(dǎo)電膠上，自然晾干并噴金2 min，置于SEM下觀察其微觀形態(tài)，結(jié)果見圖9，THP-PC-NPs呈類球形。

圖9 THP-PC-NPs的SEM圖

2.8 THP-PC-OP的制備

中鏈三酰甘油具有良好的安全性和可耐受性，廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥領(lǐng)域，且磷脂復(fù)合物在中鏈三酰甘油溶解度良好，因此，本研究采用中鏈三酰甘油制備THP-PC-OP。過程為取100 mg的THP- PC，超聲溶于10 mL中鏈三酰甘油，即得THP-PC油制劑。

2.9 溶出度測定方法

取THP、THP-PC、THP-PC-SD和THP-PC-NPs凍干粉適量，使THP含量均為30 mg，采用蒸餾水制備混懸液，置于透析袋中，各樣品均平行制備6份。溶出介質(zhì)為900 mL蒸餾水，溫度和轉(zhuǎn)速分別為37 ℃和100 r/min，于0、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、18、24 h取樣3 mL，立即補進蒸餾水3 mL。各樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，進HPLC測定THP質(zhì)量濃度，計算各時間點累積溶出率，結(jié)果見圖10。THP原料藥24 h累積釋放率為49.18%，THP-PC在各個時間點累積釋放率均高于THP原料藥，24 h累積釋放率為69.47%，有一定的促溶出作用。將THP-PC制備成THP-PC-SD后溶出速率明顯增大，8 h的累積溶出率達到96.02%。而THP-PC-NPs在 4 h累積溶出率達到95.67%，基本釋放完畢。THP-PC-OP是一種溶液制劑，故不再考察體外溶出情況。

圖10 不同樣品的溶出曲線(, n = 6)

2.10 口服藥動學(xué)比較

2.10.1 試驗方案 取THP、THP-PC、THP-PC-SD、THP-PC-NPs粉末適量，加入適量0.5% CMC-Na溶液配制灌胃液，THP-PC-OP可直接灌胃給藥。取SD大鼠30只，隨機均分為5組，禁食12 h但可自由飲水，按大鼠體質(zhì)量進行ig給藥（30 mg/kg）。分別在0、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、10、12 h眼眶后靜脈叢取血約0.3 mL，毛細玻璃管引流至肝素化的離心管中，立即于3000 r/min離心3min，分取血漿密封，?15 ℃冰箱中冷凍保存。

2.10.2 血漿樣品處理過程[23]取白屈菜紅堿適量，采用甲醇配制成600 ng/mL，作為內(nèi)標溶液。吸取血漿樣品100 μL，加入內(nèi)標溶液50 μL和1 mL乙腈（含體積分數(shù)為0.05%甲酸），密封，渦旋2 min，于5000 r/min離心8 min，取有機相，40 ℃氮氣吹干得殘渣，加入100 μL甲醇渦旋30 s復(fù)溶，于5000 r/min離心5 min，進樣測定。

2.10.3 血漿對照品標準曲線 取2.0 μg/mL的THP對照品溶液，甲醇稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為1000、500、250、100、20 ng/mL，分別取100 μL，加入白屈菜紅堿內(nèi)標溶液50 μL，40 ℃氮氣流緩慢吹干得殘渣，分別加入空白血漿100 μL，渦旋混勻，即得THP血漿對照品溶液。按照“2.10.2”項下操作，進樣測定。以THP質(zhì)量濃度（）為橫坐標，THP與白屈菜紅堿峰面積比（）為縱坐標，得方程＝0.042 6－2.450 1，＝0.992 6，所以線性范圍為20～2 000 ng/mL。

2.10.4 方法學(xué)考察 取空白血漿、血漿對照品和血漿樣品進樣，結(jié)果見圖11，血漿內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾THP及內(nèi)標測定，因此專屬性較高。取20、500、2000 ng/mL的血漿對照品溶液，連續(xù)進樣6次，分別計算得THP與內(nèi)標峰面積比值的RSD分別為9.97%、6.31%、9.17%，因此日內(nèi)精密度良好。分別連續(xù)測定6 d，每天測定1次，分別計算得THP與內(nèi)標峰面積比值的RSD分別為10.88%、7.18%、9.96%，因此日間精密度良好。取THP原料藥ig給藥1 h的血漿樣品，分別于0、3、6、12、18、24 h進樣測定THP與內(nèi)標峰面積比值，計算得比值的RSD為6.49%，說明血漿樣品穩(wěn)定性良好。取20、500、2000 ng/mL的血漿對照品，進HPLC測定兩者峰面積，計算峰面積比值，帶入血漿對照品標準曲線方程計算測得濃度，并與配制質(zhì)率濃度比較，計算得平均回收率為94.06%（＝9），RSD值為7.93%，可見準確度較高。因此建立的色譜方法及血漿處理過程可用于血漿樣品中THP的含量測定。

圖11 空白血漿(A)、血漿對照品溶液(B) 和血漿樣品(C) 的HPLC圖

2.10.5 藥動學(xué)結(jié)果 分別測定THP、THP-PC、THP-PC-SD、THP-PC-OP和THP-PC-NPs在各個時間點的血藥濃度，藥-時曲線見圖12。DAS 2.0軟件包擬合各組樣品藥動學(xué)數(shù)據(jù)，主要藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果見表3。THP-PC的max與THP原料藥相比無統(tǒng)計學(xué)意義，但1/2、max、AUC0～t和AUC0～∞等參數(shù)有顯著性改變，相對生物利用度提高至1.70倍，在一定程度上促進了THP體內(nèi)吸收。THP-PC-SD、THP-PC-NPs和THP-PC-OP的max、max、AUC0～t和AUC0～∞與THP或THP-PC相比均有顯著性或極顯著性差異（＜0.05、0.01），藥動學(xué)行為發(fā)生了較大變化。與THP原料藥相比，THP-PC-SD、THP-PC-NPs和THP-PC-OP相對生物利用度分別提高至4.11、4.86、4.22倍，其中THP-PC-NPs提升幅度相對最大。

圖12 藥-時曲線(,n = 6)

表3 主要藥動學(xué)參數(shù)(,n = 6)

Table 3 Main pharmacokinetic parameters (, n = 6)

參數(shù)單位THP原料藥THP-PCTHP-PC-SDTHP-PC-NPsTHP-PC-OP tmaxh1.06±0.311.11±0.280.74±0.21*#0.70±0.23*#1.56±0.36*# t1/2h2.61±0.543.72±0.69*3.34±0.57*3.96±0.61**4.44±0.68**# Cmaxng?mL?1557.64±61.24741.76±92.32**1 388.05±148.67**##1 704.33±253.64**##1 147.16±148.98**## AUC0～tng?h?mL?11 568.23±148.612 674.93±282.70**6 447.18±627.96**##7 629.81±721.16**##6 615.04±589.03**## AUC0～∞ng?h?mL?11 624.17±159.082 812.62±301.56**6 591.43±681.42**##7 728.64±772.08**##6 756.08±703.58**##

與THP比較：*＜0.05**＜0.01；與THP-PC比較：#＜0.05##＜0.01

*< 0.05**< 0.01THP;#< 0.05##< 0.01THP-PC

3 討論

前期分別考察了制備溶劑（醋酸乙酯、乙醇、丙酮、四氫呋喃等）、制備溫度（20～70 ℃）、磷脂用量（100～300 mg）、制備時間（2～6 h）等對THP-PC復(fù)合率的影響，發(fā)現(xiàn)采用四氫呋喃作為制備溶劑時復(fù)合率最高，可能是由于四氫呋喃是一種非質(zhì)子溶劑，對THP及磷脂有較高的溶解度，有利于THP-PC的形成。

據(jù)文獻報道[12]，質(zhì)子溶劑（如乙醇）會對藥物與磷脂的親電基團與供電基團之間的電子傳遞產(chǎn)生影響，因而會干擾磷脂復(fù)合物的形成，影響復(fù)合率。磷脂容易被氧化，制備溫度過高或制備時間過長時均會影響磷脂的穩(wěn)定性，進而也會影響復(fù)合率。藥物與磷脂分子一般是按照物質(zhì)的量比1∶1結(jié)合在一起，磷脂用量不足時，復(fù)合率較低，但磷脂用量過大時造成材料浪費，故需要對磷脂用量進行優(yōu)化。因此，選擇磷脂用量、制備溫度和制備時間為主要影響因素，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化了THP-PC處方工藝，復(fù)合率接近100%。計算結(jié)果顯示，THP與磷脂的物質(zhì)的量比為1∶1.04。XRPD研究顯示，THP在THP-PC以無定型狀態(tài)存在，利于提高體溶出度及生物利用度[24]。

THP-PC是一種黏性物質(zhì)，給藥不便，故本研究進一步將其制備成THP-PC-SD、THP-PC-OP及THP-PC-NPs凍干粉。體外溶出結(jié)果顯示，THP-PC體外溶出較為緩慢，但THP-PC-SD和THP-PC-NPs極大促進了THP體外溶出，且給藥便捷性大大提高。

口服后，THP-PC的生物利用度提高至1.70倍，可能是由于THP的溶出度得到一定程度提高、降低了胃腸道對藥物代謝作用[25]、調(diào)節(jié)了油水分配系數(shù)、促進胃腸道吸收等[25-26]作用所致。但磷脂復(fù)合物黏性較大，促溶出作用有限，且部分磷脂復(fù)合物在水相環(huán)境中可能發(fā)生解離[15]，因而生物利用度提高幅度受限。制備成THP-PC-SD后生物利用度提高至4.11倍，可能是由于制備成THP-PC-SD后THP仍以無定型狀態(tài)存在、THP-PC的親水性及分散性得到極大改善、加快體外溶出速率、提高了累積溶出度等[27]。THP-PC-NPs進一步把生物利用度提高至4.86倍，可能是由于THP-PC-NPs充分融合了PC和NPs制劑新技術(shù)的優(yōu)勢[22]，增強了THP的透膜吸收能力、增加了藥物與胃腸道的接觸面、延長了胃腸道滯留時間、發(fā)揮納米制劑特殊吸收機制 等[18,21]，從而實現(xiàn)高效吸收。THP-PC-OP生物利用度提高至4.22倍，可能是由于磷脂復(fù)合物在水中容易發(fā)生解離，析出原形藥物，失去促吸收作用，當以油制劑形式給藥后使THP-PC與水相隔離，增加了THP-PC穩(wěn)定性；THP-PC-OP口服后在胃腸道蠕動作用下可能會形成微乳、膠束等[28-30]，從而使生物利用度遠高于THP-PC。因此，THP-PC-SD、THP-PC-NPs和THP-PC-OP均可進一步促進THP-PC口服吸收，本研究為THP制劑研發(fā)提供了有價值的參考資料。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation and pharmacokinetics of tetrahydropalmatine phospholipid complex, and its solid dispersion, oil preparation and nanosuspension

LI Jun-xia1, CAO Ya-rui1, WANG Jin-tao2, FANG Xiao-dong3

1. Henan Provincial Chest Hospital, Zhengzhou 450000, China 2. School of Materials, Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China 3. School of Pharmacy, Henan University, Zhengzhou 475001, China

To prepare tetrahydropalmatine phospholipids complex (THP-PC), THP-PC solid dispersion (THP-PC-SD), THP-PC oil preparation (THP-PC-OP), and tetrahydropalmatine phospholipids complex nanosuspensions (THP-PC-NPs), and then compare their pharmacokinetics behavior in SD rats.THP-PC and THP-PC-SD were prepared by solvent volatilization. X-ray power diffraction (XRPD) was employed to study the presence of THP. THP-PC-NPs were prepared by high pressure homogenization method, particle size and ζ potential were also determined. Dissolutionof THP-PC, THP-PC-SD and THP-PC-NPs were compared to THP suspension. SD rats in each group were administered intragastrically with THP, THP-PC, THP-PC-SD, THP-PC-OP and THP-PC-NPs, respectively. Plasma concentration of THP was determined by HPLC, and the main pharmacokinetic parameters were calculated.The results of XRPD indicated that THP was changed into an amorphous state in THP-PC and THP-PC-SD. Particle size and ζ potential of THP-PC-NPs were (184.57 ± 10.41) nm and (?31.26 ± 1.93) mV, respectively. The dissolution of THP was improved by THP-PC, THP-PC-SD and THP-PC-NPs in different degrees. Compared with raw medicine, relative bioavailability of THP-PC was increased to 1.70 times. The relative bioavailability of THP-PC-SD, THP-PC-OP and THP-PC-NPs were enhanced to 4.11, 4.86 and 4.22 times, respectively.THP-PC-SD, THP-PC-OP and THP-PC-NPs could enhance the oral bioavailability of THP-PC in further.

tetrahydropalmatine; phospholipids complex; solid dispersion; oil preparation; nanosuspensions; dissolution rate; bioavailability; pharmacokinetics; solvent volatilization; X-ray power diffraction; high pressure homogenization

R283.6

A

0253 - 2670(2022)14 - 4307 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.14.010

2022-01-25

2018年度河南省科技攻關(guān)計劃項目（2018020561）

李君霞（1975—），本科，副主任藥師，研究方向為醫(yī)院臨床藥學(xué)。Tel: (0371)65662768 E-mail: lijunxia_henan@126.com

王金濤（1969—），博士，副研究員，研究方向為中藥新型給藥系統(tǒng)。Tel: (0371)67766820 E-mail: jtwangphd@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]