吳明霞，趙文凈，鄭昇陽，徐歆怡

（1.寧德師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 寧德 352100；2.閩東水產(chǎn)品精深加工福建省高校工程研究中心，福建 寧德 352100）

紫菜(Porphyra)是指海中互生藻類的統(tǒng)稱.無論是從營養(yǎng)性，還是從保健性來看，紫菜都是寶貴的天然海洋保健食品之一.紫菜是食用海藻中的珍品，具有極高的營養(yǎng)和藥用價值.紫菜具有豐富的蛋白質(zhì)，氨基酸總量較高，含人體所需的9 種氨基酸，且其中鮮味氨基酸與甜味氨基酸含量較高，使紫菜具有優(yōu)良風(fēng)味[1].紫菜中不僅含有豐富的維生素C 與維生素B，還含有豐富的礦物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)人體礦物質(zhì)水平[2].近年來，中國已成為世界第一紫菜養(yǎng)殖大國，中國紫菜養(yǎng)殖總量占世界的65%，中國紫菜養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提高對世界紫菜養(yǎng)殖具有重要影響[3].

國內(nèi)在紫菜的深加工方面研究較多,且多采用酶解[4-6]和浸提[7-8]方法.如：沈照鵬等[4]以海藻瓊膠酶制取紫菜酶解液，研制出紫菜精素飲料；劉秀敏等[5]在研發(fā)紫菜酒過程中引進酶解工藝，增加了酒中營養(yǎng)成分還有保留了紫菜酒獨有的風(fēng)味；伍宏[6]以壇紫菜為原料,采用生物酶解技術(shù)并結(jié)合中藥配方,研制出具有補充碘元素降血壓的功效的紫菜復(fù)合功能飲料；張付云[7]以干紫菜為主要原料,通過設(shè)計正交試驗優(yōu)化出紫菜的浸提條件和紫菜汁與檸檬汁及蔗糖的配比.

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)，別名納豆菌,具有易培養(yǎng)、耐熱等特性.納豆芽孢桿菌生長繁殖過程中不僅可以分解生物大分子，還能將生物大分子降解為生物量小的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)分解為氨基酸，有利于人體消化吸收[9-13]，具有廣闊的市場前景.目前，發(fā)酵紫菜醬菌種一般采用乳酸菌和米曲霉，如張雪楠等[9]選用米曲霉和乳酸菌作為發(fā)酵劑對壇紫菜進行發(fā)酵制備紫菜醬.有鑒于此，本研究以紫菜為發(fā)酵底物，研究納豆芽孢桿菌發(fā)酵條件，并對其液體發(fā)酵培養(yǎng)基和條件進行優(yōu)化，以不同的發(fā)酵時間、溫度和轉(zhuǎn)速、氯化鈉添加量作為單因素試驗，選取單因素試驗和正交試驗優(yōu)化納豆芽孢桿菌發(fā)酵紫菜最佳培養(yǎng)基，測定納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基氨基酸態(tài)氮的含量，并結(jié)合感官評價，旨在為開發(fā)發(fā)酵型的紫菜醬制品提供參考.

1 材料和方法

1.1 供試材料

納豆芽孢桿菌（北京川秀有限公司），干壇紫菜（福建寧德霞浦縣沙江鎮(zhèn)資材加工有限公司）.LB 培養(yǎng)基制備：胰化蛋白胨1 g、氯化鈉1 g、酵母提取物0.5 g,蒸餾水1 000 mL，定容.發(fā)酵液體培養(yǎng)基制備：紫菜粉2 g、胰蛋白胨1 g、氯化鈉1 g、酵母提取液0.5 g、蒸餾水100 mL,高壓滅菌鍋121 ℃滅菌15 min.

1.2 研究方法

具體流程：分離菌種→純化→固體斜面培養(yǎng)→液體培養(yǎng)（三角瓶）→鏡檢→液體發(fā)酵→測定氨基酸氮含量同時進行感官評價.

1.2.1 操作要點（1）紫菜的處理：選取干壇紫菜于40 ℃恒溫干燥箱中干燥10 h,研磨成粉末后稱取2 g等量的紫菜粉末.（2）納豆芽孢桿菌的分離純化：稱取0.3 g 納豆芽孢桿菌置于100 mL 無菌水中振蕩均勻，用1 mL 移液槍將菌懸液按10-4～10-7梯度稀釋后，用移液槍吸取1 mL 菌懸液于LB 固體培養(yǎng)基中，使用涂布器涂布均勻，同時做3組平行試驗，在35 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h.在超凈工作臺中，挑選合適的菌落用接種環(huán)沾取少量分離好的菌種接于新制的LB固體斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，重復(fù)4次得到純菌種.（3）液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備、接種：配置LB 液體培養(yǎng)基置于121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌20 min后冷卻，在超凈工作臺中，用移液槍移取1 mL 的LB 液體培養(yǎng)基于長滿納豆芽孢桿菌的LB 固體斜面培養(yǎng)基，將接菌環(huán)置于酒精燈上灼燒，再伸入LB固體斜面培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基表面的菌種刮入LB液體培養(yǎng)基中.（4）染色鏡檢：在超凈工作臺中將納豆芽孢桿菌制片，經(jīng)過初染、媒染、脫色、復(fù)染、水洗幾個步驟后在顯微鏡下觀察到納豆芽孢桿菌呈紫色桿狀.

1.2.2 單因素試驗 發(fā)酵溫度：搖床發(fā)酵溫度分別設(shè)置為25、30、35、40 和45 ℃，控制轉(zhuǎn)速180 r·min-1，培養(yǎng)24 h，研究溫度對氨基酸態(tài)氮含量和感官評分的影響.發(fā)酵轉(zhuǎn)速：發(fā)酵轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為140、160、180、200 和220 r·min-1，控制溫度35 ℃，培養(yǎng)24 h，研究轉(zhuǎn)速對氨基酸態(tài)氮含量和感官評分的影響.發(fā)酵時間：發(fā)酵時間分別設(shè)置為18、21、24、27和30 h，控制溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速180 r·min-1,培養(yǎng)24 h，研究發(fā)酵時間對氨基酸態(tài)氮含量和感官評分的影響.氯化鈉添加量:在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中分別添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的氯化鈉，控制溫度35 ℃，培養(yǎng)24 h，研究氯化鈉添加量對氨基酸態(tài)氮含量和感官評分的影響.

1.2.3 正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵轉(zhuǎn)速（B）、發(fā)酵時間（C）、氯化鈉添加量（D）進行響應(yīng)面試驗（表1），考察其對發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量的影響，確定發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件.運用Design-Expert 8.0.6.1 軟件進行正交試驗分析，所有試驗重復(fù)3 次.

表1 正交試驗設(shè)計

1.2.4 指標測定 采用甲醛法[14-16]測定納豆芽孢桿菌液體發(fā)酵紫菜培養(yǎng)基中氨基酸態(tài)氮含量.

1.2.5 感官評分設(shè)計 選擇10名食品專業(yè)學(xué)生對紫菜醬的色、香、味、外觀進行評價，并取平均值（表2）.

表2 感官評分表

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 發(fā)酵溫度對納豆芽孢桿菌發(fā)酵紫菜的影響 由圖1 可知，氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵溫度的升高呈先緩慢增加后急劇增加再減少的趨勢，25～35 ℃氨基酸態(tài)氮含量略微升高，這可能是因為25～30℃在納豆芽孢桿菌生長緩慢，氨基酸態(tài)氮含量增長趨勢緩慢；35～40 ℃氨基酸態(tài)氮的含量急劇增長，這可能是因為35～40 ℃是納豆芽孢桿菌的最適生長溫度；40～45 ℃氨基酸態(tài)氮的含量減少，可見，在一定范圍內(nèi)升高發(fā)酵溫度可以有效促進蛋白質(zhì)水解程度.納豆芽孢桿菌發(fā)酵紫菜的感官評分則隨著發(fā)酵溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，當發(fā)酵溫度為40 ℃，感官評價得分最高，此時發(fā)酵紫菜產(chǎn)生的氨味比較淡且?guī)в凶喜孙L(fēng)味.當發(fā)酵溫度超過40 ℃時，發(fā)酵紫菜有氨味影響紫菜風(fēng)味，感官評價得分降低.因此，確定最適合發(fā)酵溫度為40 ℃.

圖1 溫度對納豆芽孢桿菌發(fā)酵紫菜的影響

2.1.2 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對納豆芽孢桿菌發(fā)酵紫菜的影響 由圖2可知，隨著發(fā)酵轉(zhuǎn)速的增加，氨基酸態(tài)氮的含量呈先增加后減少的趨勢.發(fā)酵轉(zhuǎn)速的增加會影響液體的含氧量，納豆芽孢桿菌是好氧菌，在140～200 r·min-1條件下，發(fā)酵液中含氧量增加，納豆芽孢桿菌與氧氣充分接觸，發(fā)酵氨基酸態(tài)氮含量上升；200～220 r·min-1條件下，雖含氧量增加，但氨基酸態(tài)氮含量減少，這可能是因為轉(zhuǎn)速過高時空氣切力大不利于發(fā)酵，氨基酸態(tài)氮含量減少，可見，在一定范圍內(nèi)增加發(fā)酵轉(zhuǎn)速可以有效促進蛋白質(zhì)水解程度.納豆芽孢桿菌發(fā)酵紫菜的感官評分隨著發(fā)酵轉(zhuǎn)速的增加呈先上升后下降的趨勢，當發(fā)酵轉(zhuǎn)速為200 r·min-1時，感官評價得分最高，此時發(fā)酵紫菜產(chǎn)生的氨味比較淡.當發(fā)酵轉(zhuǎn)速超過200 r·min-1時，發(fā)酵紫菜產(chǎn)生氨味，感官評價得分降低.因此，確定最適發(fā)酵轉(zhuǎn)速為200 r·min-1.

圖2 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對納豆芽孢桿菌發(fā)酵紫菜的影響

2.1.3 發(fā)酵時間對納豆芽孢桿菌發(fā)酵紫菜的影響 由圖3可知，隨著發(fā)酵時間的增加，氨基酸態(tài)氮含量先增加后減少.不同的發(fā)酵時間菌株處于不同的生長周期，發(fā)酵時間為18～24 h 時，納豆芽孢桿菌從對數(shù)生長期進入穩(wěn)定期，氨基酸態(tài)氮含量的增長趨勢逐步變緩，發(fā)酵時間為24～30 h 時，納豆芽孢桿菌從穩(wěn)定期進入衰亡期，氨基酸態(tài)氮含量的減少.所以，在一定范圍內(nèi)增加發(fā)酵時間可以有效促進蛋白質(zhì)水解程度.發(fā)酵紫菜的感官評分隨著發(fā)酵時間的增加呈先上升后下降的趨勢，當發(fā)酵時間為24 h時，感官評價得分最高，此時發(fā)酵紫菜產(chǎn)生的氨味比較淡.當發(fā)酵時間超過24 h時，納豆芽孢桿菌衰亡分解，發(fā)酵紫菜產(chǎn)生異味，感官評價得分降低.因此，確定最適發(fā)酵時間為24 h.

圖3 發(fā)酵時間對納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

2.1.4 氯化鈉添加量對納豆芽孢桿菌發(fā)酵紫菜的影響 由圖4可知，隨著氯化鈉添加量的增加，氨基酸含氮量呈先增加后減少趨勢，氯化鈉添加量小于1.0%時，促進納豆芽孢桿菌發(fā)酵，氨基酸態(tài)氮含量增加，氯化鈉添加量為1.0%～2.0%時，抑制納豆芽孢桿菌發(fā)酵，氨基酸態(tài)氮含量減少.可見，添加適量氯化鈉有利于促進納豆芽孢桿菌發(fā)酵氨基酸氮含量增加，促進蛋白質(zhì)水解程度，氯化鈉濃度過高則不利于發(fā)酵.納豆芽孢桿菌發(fā)酵紫菜的感官評分隨著氯化鈉添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，當氯化鈉添加量為1.0%時，感官評價得分最高，此時發(fā)酵紫菜產(chǎn)生的氨味比較淡.因此，確定最適氯化鈉添加量為1.0%.

圖4 氯化鈉添加量對納豆芽孢桿菌發(fā)酵的影響

2.2 正交試驗

由表3 可知，以氨基酸態(tài)氮含量與感官評分為指標的試驗最優(yōu)方案皆為A1B2C3D2，即發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵溫度為35 ℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速200 r·min-1、發(fā)酵時間27 h、氯化鈉添加量1.0%，此時測得氨基酸態(tài)氮含量為1.59 g·L-1，感官評分9.02.正交試驗組合中的最高值試驗A1B2C2D2氨基酸態(tài)氮的含量為1.45 g·L-1，感官評分8.87，試驗最優(yōu)方案測得的氨基酸態(tài)氮的含量與感官評價皆高于正交試驗組合中的最高值.因此，選取最優(yōu)方案A1B2C3D2，即液體發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速200 r·min-1、發(fā)酵時間27 h、氯化鈉添加量1.0%.

表3 正交試驗分析表

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵紫菜最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵轉(zhuǎn)速200 r·min-1、發(fā)酵時間27 h、氯化鈉添加量1.0%，在此條件下，納豆芽孢桿菌發(fā)酵紫菜氨基酸態(tài)氮含量最高(1.59 g·L-1),感官評分最高(9.02).經(jīng)過納豆芽孢桿菌發(fā)酵的紫菜蛋白質(zhì)水解程度更高，利于人體消化吸收，可應(yīng)用于生產(chǎn)發(fā)酵紫菜醬.已有研究表明，當溫度低于30 或高于45 ℃時，納豆芽孢桿菌的生長有下降趨勢[17-19]，這與本研究所得結(jié)果一致.王發(fā)祥等[17]以實驗室選育的納豆芽孢桿菌BN.0301為出發(fā)菌株，研究其液體發(fā)酵，對碳源和氮源進行了初步篩選，并確立了其最優(yōu)發(fā)酵條件：種齡18 h，接種量1%，溫度30 ℃，搖瓶轉(zhuǎn)速180 r·min-1，裝液量160 mL·L-1，初始pH 值6.0，搖瓶發(fā)酵周期33 h，此時納豆激酶活力最大，為最適發(fā)酵條件.可見，其溫度、轉(zhuǎn)速、時間等發(fā)酵條件與本研究不盡相同，這可能是因為紫菜作為培養(yǎng)基可能會影響菌種的生長趨勢.